李光哲　程　琳　陳　慧　元紅花　許妍姬

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，吉林　延吉　133002)

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淀粉樣前體蛋白-C端片段對胚鼠原代皮層神經(jīng)元cofilin磷酸化的影響

李光哲1程琳陳慧元紅花許妍姬

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，吉林延吉133002)

摘要〔〕目的探討淀粉樣前體蛋白-C端游離片段(APP-CTFs)對ADF/cofilin的影響及作用機(jī)制。方法APP-CT99-pEGFP轉(zhuǎn)染胎鼠原代皮層細(xì)胞，采用細(xì)胞免疫組化方法和蛋白印跡方法觀察磷酸化cofilin和LIMK1的分布形態(tài)和表達(dá)水平。處理S3肽，LIMK1的特異性競爭性抑制劑后再觀察磷酸化cofilin表達(dá)。結(jié)果細(xì)胞免疫組化實驗結(jié)果，轉(zhuǎn)染APP-CT99-pEGFP的細(xì)胞中，磷酸化cofilin和LIMK1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，與空載體轉(zhuǎn)染組比較分布較高。S3肽處理后，磷酸化cofilin的表達(dá)水平減少。蛋白印跡實驗結(jié)果，轉(zhuǎn)染APP-CT99-pEGFP的細(xì)胞中，磷酸化cofilin和LIMK1蛋白水平增高，與空載體轉(zhuǎn)染組比較具有顯著性差異(P<0.05)。S3肽處理后，磷酸化cofilin蛋白水平降低。結(jié)論APP-CTFs通過LIMK1激酶調(diào)控cofilin磷酸化。

關(guān)鍵詞〔〕淀粉樣前體蛋白-C端片段；Cofilin；LIMK1；磷酸化

1延邊腦科醫(yī)院心理科

第一作者：李光哲(1973-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事精神神經(jīng)疾病的病因及藥理學(xué)研究。

阿爾茨海默病(AD)有各種發(fā)病假說，其中淀粉樣蛋白假說一直很受重視〔1〕。淀粉樣前體蛋白(APP)是一種跨膜糖蛋白，先后經(jīng)β-內(nèi)切酶和γ-內(nèi)切酶剪切之后，產(chǎn)生Aβ和不同長度的APP-C端游離片段(APP-CTFs)〔2～5〕。 AD腦組織除老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)之外，還包含Hirano bodies，一種由肌動蛋白和其結(jié)合蛋白絲切蛋白(cofilin)構(gòu)成的節(jié)狀結(jié)構(gòu)〔6～8〕。cofilin是存在于真核生物中的一種低分子量(21 kD)的肌動蛋白結(jié)合蛋白〔9〕。AD患者的腦皮質(zhì)和海馬回中發(fā)現(xiàn)的ADF/cofilin-肌動蛋白節(jié)狀結(jié)構(gòu)，在正常人腦中沒有〔10〕。人單絲氨酸蛋白酶(LIMK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可直接磷酸化cofilin蛋白使其失活，從而逆轉(zhuǎn)cofilin誘導(dǎo)的肌動蛋白解聚〔11，12〕。本研究欲探討APP-CTFs對ADF/cofilin分子家族的影響及作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實驗動物及DNA孕17～18 d的SPF級SD大鼠，由延邊大學(xué)動物實驗中心提供。APP-CTFs由韓國首爾醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教室徐維憲教授饋贈。

1.2藥品與試劑胰蛋白酶(Sigma)；胎牛血清(Corning，N.Y，14831，USA)；馬血清；N2；DMEM培養(yǎng)液(Grand Island，N.Y，14072，USA)；多聚賴氨酸；Triton X-100；甲醛；甲醇；淬滅劑封片液；磷酸化(ph)-cofilin和ph-LIMK單克隆抗體，相應(yīng)的二抗、蛋白印跡封閉液、洗滌液、免疫組化固定液、洗滌液、封閉液均購自碧云天生物有限公司。S3肽，LIMK1的特異性競爭性抑制，其結(jié)構(gòu)為MASGVAVSDGVIKVFNRQIKWFQNRRMKWKK，由上?？齐墓竞铣伞?/p>

1.3實驗儀器蛋白印跡電泳裝置、恒溫水浴鍋、分析天平、CO2培養(yǎng)箱、脫式搖床；離心機(jī)、解剖體式顯微鏡、熒光顯微鏡、制冰機(jī)、立式壓力蒸汽滅菌器、移液器等均由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)實驗中心提供。

1.4實驗方法

1.4.1質(zhì)粒的擴(kuò)增、提取和純化分別將含有重組質(zhì)粒pEGFP-N1-APP-CTFs(C99，C57)〔5〕和空載體pEGFP-N1的菌種用Kan+培養(yǎng)基培養(yǎng)并選取單菌落，取單菌落至10 ml含Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、230 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，再轉(zhuǎn)入200 ml LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。按照質(zhì)粒大量提取試劑盒說明提取、純化質(zhì)粒，并用紫外分光光度計測定質(zhì)粒的濃度和純度。

1.4.2細(xì)胞培養(yǎng)用乙醚麻醉懷孕18 d的SPF級SD大鼠，無菌條件下取胚胎，置于含冰冷的D-Hank液的平皿中，反復(fù)清洗，去除血漬。斷頭，分離大腦，剝離腦膜，取皮層，將皮層剪碎成1 mm×1 mm大小或更小，離心去上清。加0.25%的胰酶在37℃的水浴鍋中孵育20 min。離心，去上清，用含5%的馬血清、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打20次，自然沉淀后上清即為原代皮層細(xì)胞。

將多聚賴氨酸用無菌的三蒸水配制成0.1%的溶液，每孔用1 ml多聚賴氨酸溶液包埋過夜，回收，晾干，用無菌三蒸水清洗3次，晾干，紫外照射。將獲得的細(xì)胞接種于含5%的馬血清、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液被多聚賴氨酸包埋的六孔板中，放置在5%CO2，37℃的CO2培養(yǎng)箱中。第2天換成含有1%N2的DMEM培養(yǎng)液中，隔1 d換成含有適合5%馬血清、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。第5～7天做細(xì)胞處理。

1.4.3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及在原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)實驗分為三個組，①對照組轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體，②APP-CT99轉(zhuǎn)染組，③APP-CT57轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染過程按照Lipofectemin脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行。每組細(xì)胞均于24 h后在熒光顯微鏡下觀察。

1.4.4蛋白印跡方法用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞，加入RIPA裂解液，在冰上用細(xì)胞刮裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞，4℃ 8 000 r/min離心5 min，得出細(xì)胞裂解液，蛋白定量，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用封閉液封閉1 h，用活化的ph-cofilin單克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，洗滌液漂洗3次后加二抗辣根過氧化酶(HRP)-IgG(1∶1 000)，室溫孵育1 h，洗膜3次后化學(xué)發(fā)光法顯色。用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值，tubulin作為內(nèi)參照，得出蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.4.5免疫組化(IC)吸盡培養(yǎng)液，加1 ml固定液，固定10 min，棄去固定液，用洗滌液在脫式搖床上洗3次，每次5 min，吸盡液體。用封閉液封閉60 min，在搖床上輕輕搖動。去封閉液，用稀釋的一抗ph-cofilin和ph-LIMK(1∶200)孵育60 min，搖床上輕輕搖動。回收一抗，用洗滌液洗3次，每次5 min，吸盡液體。加入1 ml稀釋好的二抗避光孵育60 min，搖床上輕輕搖動?；厥斩梗孟礈煲合?次，每次5 min，吸盡液體。期間避光操作。

把蓋玻片取出，蓋在滴有淬滅劑封片液的載玻片上，盡量避免氣泡，熒光顯微鏡下觀察。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)顯微鏡下觀察到剛接種的皮層神經(jīng)元細(xì)胞大多為圓形，2 h后見有少量的神經(jīng)元細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞多為散在的單個細(xì)胞。培養(yǎng)第2天大多數(shù)的神經(jīng)元細(xì)胞都已經(jīng)貼壁。繼續(xù)培養(yǎng)后神經(jīng)元胞體漸漸增大，長出突起的神經(jīng)元細(xì)胞越來越多，突起也開始變長。培養(yǎng)到第5天的神經(jīng)元細(xì)胞胞體最飽滿，細(xì)胞90%長滿平皿，許多突起都交織成網(wǎng)，適合做處理。見圖1。

圖1　不同時間段顯微鏡觀察大鼠皮層原代神經(jīng)元生長狀況(×10)

2.2轉(zhuǎn)染APP-CTFs對ph-cofilin和ph-LIMK表達(dá)的影響共聚焦顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染APP-CT99、CT57-pEGFP組與空載體對照組相比較，ph-cofilin和ph-LIMK蛋白表達(dá)水平明顯增加(圖2，圖3)。蛋白印跡實驗結(jié)果也證實了轉(zhuǎn)染APP-CT99、57-pEGFP可誘導(dǎo) cofilin磷酸化(0.633±0.05，0.621±0.025)和ph-LIMK表達(dá)水平(0.747±0.038，0.643±0.032)的增高，與對照組(0.365±0.045，0.438±0.028)相比較具有顯著性差異(P<0.05)。見圖4。

圖2　APP-CTFs誘導(dǎo)cofilin的磷酸化免疫組化染色結(jié)果(×400)

2.3S3肽處理對APP-CTFs誘導(dǎo)ph-cofilin表達(dá)的影響蛋白印跡實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染APP-CT99、57-pEGFP的細(xì)胞經(jīng)S3肽處理后，ph-cofilin的表達(dá)水平(0.374±0.028，0.348±0.019)減少，與不處理組(0.563±0.032，0.441±0.034)比較有顯著性差異(P<0.05)。見圖5。

圖3　APP-CTFs誘導(dǎo)LIMK1磷酸化在原代皮層培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)(×400)

圖4　APP-CTFs誘導(dǎo)cofilin磷酸化和LIMK1磷酸化

圖5　S3肽抑制APP-CTFs誘導(dǎo)的cofilin磷酸化

3討論

AD是一種嚴(yán)重危害人類健康的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其典型的病理特征有老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元的丟失、Tau過度磷酸化〔1〕。APP是一種跨膜糖蛋白，存在于多種細(xì)胞中，由21號染色體中的一個基因編碼，N端位于細(xì)胞外，C端位于細(xì)胞內(nèi)。APP先后經(jīng)β-內(nèi)切酶和γ-內(nèi)切酶剪切之后，產(chǎn)生Aβ和不同長度的APP-C端游離片段，Aβ是老年斑的主要成分〔2～4〕。最近研究表明，異常的cofilin沉積可引起Tau神經(jīng)氈螺紋，所以提示cofilin-肌動蛋白束在AD病理機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用〔13〕。但cofilin-肌動蛋白節(jié)狀結(jié)構(gòu)形成的具體機(jī)制還未闡明。cofilin是肌動蛋白結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞凋亡、胞質(zhì)分裂及對鬼筆環(huán)肽的作用〔9〕；它能夠精密控制肌動蛋白的動力并通過切割和解聚重組肌動蛋白絲。Ser3位點(diǎn)的磷酸化使cofilin蛋白失活，LIM激酶(LIMK)1是cofilin磷酸化酶中的一種，對Ser3位點(diǎn)具有高度親和力。LIM激酶作為細(xì)胞骨架動力學(xué)的調(diào)節(jié)子，位于Rho-ROCK誘導(dǎo)的含肌動蛋白的細(xì)胞骨架的信號通路上，主要通過磷酸化cofilin蛋白來調(diào)節(jié)肌動蛋白絲和質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的重新組裝〔11，12〕。本文結(jié)果顯示APP-CT99和C57均可增加磷酸化LIMK1的水平。β-APP內(nèi)結(jié)構(gòu)域(AICD)直接釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可影響很多細(xì)胞內(nèi)分子和信號系統(tǒng)。在前期的實驗研究中已闡明APP-CTFs和APLP2-CTFs的毒性通路，被各種酶切之后形成的AICD與Fe65結(jié)合進(jìn)行核轉(zhuǎn)移，后與CP2/LSF/LBP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合刺激GSK-3β基因，增強(qiáng)Tau磷酸化〔5，14〕。本次研究提示AICD通過作用于LIM激酶調(diào)控cofilin磷酸化，從而調(diào)控微絲的解聚，影響細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，提示了一個新的毒性通路。

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〔2014-12-17修回〕

(編輯袁左鳴)

·基礎(chǔ)研究·

The effect of C-terminal fragments of amyloid precursor protein on phosphorylation of cofilin in rat primary neuronal culture cells

LI Guang-Zhe, CHENG Lin, CHEN Hu，etal.

Department of Preventive Medicine,Medical College Yanbian University,Yanji 133002,Jilin, China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of C-terminal fragments of amyloid precursor protein on phosphorylation of cofilin in rat primary neuronal culture cells.MethodsAPP-CT99-pEGFP was transfected into fetal rat primary cortical neurons ,then the distributional pattern and protein expression levels of cofilin and LIMK1 were tested by immunofluorescence and Western blot. After the treatment with S3 peptide, the activities of LIMK1 and phosphorylated cofilin were measured.ResultsThe phosphorylated cofilin and LIMK1 were distributed in the cytoplasm and nuclei.Compared with that of empty vector transfection group,the protein distribution was higher,however, in S3 peptide treatment group, the expression of phosphorylated cofilin level was decreased. Transfection with APP- CT99-pEGFP into cells, the phosphorylated cofilin and LIMK1 protein expression levels were higher compared with those of empty vector transfection group(P<0.05).And the phosphorylated cofilin protein levels in S3 peptide treatment group were decreased as well.ConclusionsAPP-CTFs could regulate cofilin phosphorylation through the LIMK1.

【Key words】APP-CTFs；Cofilin；LIMK1；Phosphorylation

通訊作者：許妍姬(1973-)，女，博士，副教授，主要從事神經(jīng)毒理學(xué)研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81160159)

中圖分類號〔〕R74〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6641-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.001