劉笑純 姚煦

210042南京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病研究所過敏與風濕免疫科

·綜述·

經(jīng)皮免疫機制及其在過敏性疾病的應用進展

劉笑純 姚煦

210042南京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病研究所過敏與風濕免疫科

經(jīng)皮免疫作為一種新型免疫治療途徑，是將抗原和佐劑局部應用于皮膚，誘導機體產(chǎn)生系統(tǒng)性免疫應答的接種方式，該方法安全有效，有望成為具有吸引力的傳統(tǒng)疫苗替代途徑。經(jīng)皮免疫誘導不同方向免疫反應，但是皮膚免疫耐受方面的具體機制尚未完全明確。大多數(shù)研究基于動物模型，動物與人類皮膚存在結構差異，需建立更多研究實現(xiàn)動物模型向人體的轉化。并非所有的疫苗都適用于皮膚接種，研究必須評估其安全性和有效性。各種改良的疫苗遞送系統(tǒng)及其在相關疾病上的臨床應用尚待進一步發(fā)掘。

皮膚疾?。贿^敏反應；免疫；疫苗；治療應用

皮膚富含免疫細胞和免疫分子，具有一套調控精密的免疫網(wǎng)絡。經(jīng)皮免疫（transcutaneous immunization，TCI）是將抗原和佐劑局部應用于皮膚，誘導機體產(chǎn)生系統(tǒng)性免疫應答的一種新型免疫治療途徑。與傳統(tǒng)針劑注射疫苗相比，TCI疫苗避免了血源性感染，不經(jīng)過胃腸道降解，作用更為穩(wěn)定持久，成為新型疫苗發(fā)展的趨勢。

一、經(jīng)皮免疫概況

自20世紀下半葉，皮膚免疫系統(tǒng)的理論逐漸得到關注。1996年，Wang等［1］發(fā)現(xiàn)小鼠皮膚表面敷貼卵清蛋白抗原后，血清中檢測到較高水平的特異性IgE和IgG1，誘導機體產(chǎn)生Th2為主的免疫應答。Glenn等［2］發(fā)現(xiàn)，霍亂菌素可透過小鼠完整皮膚，引發(fā)強烈的免疫反應，闡述了TCI的概念，并證實霍亂毒素同時可作為佐劑應用的可行性。此后數(shù)年內，對某些細菌、病毒等抗原、佐劑及相應疫苗遞送系統(tǒng)的研究逐步深入。目前，TCI作為一種新型免疫治療途徑仍處于實驗室研究，針對防治某些感染性疾病和腫瘤設計的疫苗部分已進入臨床試驗階段，主要方向集中在抗原、佐劑和皮膚促滲技術等方面。

二、皮膚免疫系統(tǒng)

皮膚通過精密復雜的免疫網(wǎng)絡抵御外來病原微生物入侵。皮膚主要的免疫細胞包括角質形成細胞（KC）和朗格漢斯細胞（LC），以及成纖維細胞、T 淋巴細胞、樹突細胞（DC）、巨噬細胞、肥大細胞和先天淋巴樣細胞。此外還有多種細胞因子、免疫球蛋白、補體、神經(jīng)肽等免疫分子［3］，參與構成了皮膚免疫網(wǎng)絡。KC分泌多種細胞因子、趨化因子和抗微生物肽，表面的Toll樣受體是識別病原微生物及其組分的重要物質。LC是表皮特征性DC，特異性表達凝集素受體Langerin。侵入表皮的抗原可被LC識別、攝取和加工，運送至局部引流淋巴結，提呈給初始T細胞啟動免疫應答。腫瘤壞死因子（TNF）α和白細胞介素（IL）1β參與動員LC的遷移，上調整合素α6、CD54、CD86和MHC-Ⅱ類分子的表達，促進LC成熟。表皮屏障結構完整時，LC負責監(jiān)視外來抗原，維持皮膚免疫耐受。成纖維細胞是真皮的主要成分，可表達Toll樣受體1～10［4］，釋放IL-6、角質細胞生長因子和血管內皮生長因子等，與KC一道參與維持皮膚免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。dDC可在整個真皮層不斷遷移，發(fā)揮免疫監(jiān)視作用。在炎癥早期，dDC從真皮動員至引流淋巴結，可能參與誘導初始T細胞對病原體的免疫應答［3］。不同dDC亞群在促進Th1或Th2反應的作用上有所不同［5-6］，Langerin+dDC參與活化細胞毒性T淋巴細胞，促進Th1反應，抑制Th17細胞分化；Langerin-dDC主要在Th2細胞發(fā)育早期發(fā)揮作用。

皮膚中的肥大細胞、常駐T細胞以及淋巴結內初始T和B淋巴細胞是主要的免疫效應細胞。真皮中的肥大細胞參與IgE介導的超敏反應，能對多種刺激產(chǎn)生應答，分泌一系列促炎細胞因子和趨化因子，介導T細胞免疫應答方向的極化。初始T和B細胞位于皮膚引流淋巴結，被遷移至局部的抗原提呈細胞激活，在此發(fā)生特異性免疫應答。真皮常駐γδT細胞分泌IL-17，可以募集中性粒細胞參與對病原體的先天性防御，并誘導IL-6、IL-8、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子分泌，啟動早期炎癥反應。除此之外，多種細胞因子參與體液或細胞免疫，進一步增強免疫效應。

三、經(jīng)皮免疫機制

通過皮膚接種是最有效的刺激皮膚歸巢效應T細胞的方式。TCI抗原主要經(jīng)表皮LC攝取，另外CD14+dDC和能夠交叉提呈的CD141hidDC也參與該過程。LC和dDC攜帶被加工抗原遷移至引流淋巴結，通過MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子提呈給初始CD4+和CD8+T細胞。CD14+dDC優(yōu)先誘導Th1極化反應，激活CD4+T細胞分化成Th1細胞和濾泡輔助性T細胞。CD141hiDC能將外源性抗原交叉提呈給外周CD8+T細胞，可與LC一道與CD8+T細胞相互作用，誘導其分化為細胞毒性T淋巴細胞，分泌IL-2和IFN-γ，介導細胞免疫。與皮內免疫相比，由于抗原提呈細胞不同亞群的參與，TCI產(chǎn)生的免疫應答更為顯著。表達在樹突細胞表面的內肽酶、外肽酶及血清來源的蛋白酶可以修剪抗原，導致T細胞表位片段缺失，而經(jīng)皮免疫持續(xù)長時的給藥，提供了穩(wěn)定的表位呈遞，從而補償了蛋白水解造成的表位損失。另外，皮膚中KC、LC［7］、γδT 細胞［8］和肥大細胞［9］等之間復雜的相互作用提高了抗原經(jīng)皮致敏能力。

Novak等［10］首次提出皮膚的完整性在TCI中的重要性。當皮膚屏障結構完整時，靜息狀態(tài)的LC通過樹突在KC間形成網(wǎng)絡，能特異性地選擇并誘導CD4+Foxp3+調節(jié)性T細胞活化和增殖［11］，抑制T細胞活化，以維持外周免疫耐受；而當屏障功能受損，外界抗原刺激下，活化的LC誘導病原體特異性效應記憶T細胞和記憶調節(jié)性T細胞增殖，限制調節(jié)性T細胞活化［12］。皮膚屏障破壞還可激活KC分泌IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎癥細胞因子，促進LC的成熟和遷移，通過啟動類似固有免疫應答的炎癥過程充當佐劑。此外，不完整的皮膚屏障也可誘導抗微生物肽表達升高，參與固有免疫。由此可見，完整的皮膚是誘導耐受的前提。但有研究發(fā)現(xiàn)，即使在炎癥刺激下，LC也能夠誘導初始T細胞的免疫耐受，免疫活化絕大多數(shù)通過快速遷移的dDC介導［13］。也有實驗表明，在經(jīng)皮應用抗原后最初發(fā)生反應的是dDC而非LC，LC在應答早期呈現(xiàn)無反應狀態(tài)［14］。

四、經(jīng)皮免疫疫苗研究應用

鑒于皮膚中有豐富的不同活性的免疫細胞，根據(jù)TCI設計的疫苗具有更高的靶向性，誘導產(chǎn)生的免疫效應更為顯著。與傳統(tǒng)疫苗相比，TCI疫苗是一種安全有效、有望替代傳統(tǒng)針劑注射的新途徑［15］，可用于治療感染性、自身免疫性疾病和腫瘤，也成為過敏原特異性免疫治療的新選擇。

1.經(jīng)皮給藥系統(tǒng)：TCI疫苗包括各種細菌或病毒的減毒活疫苗、組分疫苗、基因工程疫苗等，另外一些蛋白質、多糖組分或重組DNA技術制備的過敏原也可作為疫苗抗原。一般認為，抗原經(jīng)皮免疫有胞內滲透、胞間滲透和毛囊滲透3種途徑。角質層具有完整而強大屏障結構，需應用各種遞送系統(tǒng)及佐劑使疫苗易于穿透。疫苗載體可以穩(wěn)定活化的疫苗，將其靶向至皮膚特定區(qū)域，或協(xié)同作為佐劑。最初實驗研究常用皮膚貼劑搭載抗原，目前常用的新型疫苗載體有納米顆粒、病毒樣載體、大腸桿菌、囊泡系統(tǒng)、微乳等，其中納米顆?；蛭⒘Ｓ捎谛再|穩(wěn)定、釋放可控和易被攝取，能有效增強抗原的免疫原性［16］，已被廣泛研究。一些促滲劑（如乙醇、二甲基亞砜、油酸），以及物理促滲技術（如低頻超聲、微針、離子導入、電穿孔、基因槍）的應用，也用于促進經(jīng)皮傳遞。其他遞送技術，如水凝膠貼劑［17-18］和經(jīng)毛囊遞送［19-20］逐步顯示其優(yōu)越性。佐劑的選擇主要根據(jù)反應類型的不同，包括ADP核糖基化外毒素、CpG基序、Toll樣受體配體和某些細胞因子等。不同特性的遞送系統(tǒng)誘導不同方向的免疫反應，如激光微孔技術可以誘導Th2反應，而CpG寡脫氧核苷酸作為佐劑能抑制IL-4、IL-5和IL-13的產(chǎn)生，調節(jié)免疫反應向Th1方向極化，二者的聯(lián)合可以調節(jié)Th1/Th2反應之間的平衡［21］。Zaric等［22］利用溶解性聚合物微針陣列載入納米膠囊包裹抗原，特異性靶向皮膚DC網(wǎng)絡，該反應中，LC能交叉激活抗原特異性CD8+T細胞，促進CD4+Th1和Th17細胞分化。不同趨化因子及其受體的差異性表達可以調節(jié)LC向引流淋巴結的遷移［23］，通過疫苗載體搭載特定的趨化因子能一定程度上調控免疫效應細胞和分子。

2.TCI疫苗在過敏性疾病中的應用：過敏原特異性免疫治療是唯一能夠阻止過敏性疾病病情進展的具有長期療效的治療途徑［24］，而傳統(tǒng)的皮下免疫方法由于其療程長，過敏原若經(jīng)針劑入血可能引發(fā)全身不良反應，患者依從性不高。皮膚是發(fā)生免疫耐受誘導的理想部位，由于皮膚中具有豐富的抗原提呈細胞，TCI疫苗能有效增強療效，縮短療程，減少非特異性反應的發(fā)生。有雙盲、安慰劑對照研究表明，經(jīng)皮過敏原特異性免疫治療能夠顯著改善患者過敏癥狀［25］，治療中過敏原特異性IgG4升高。一項針對兒童季節(jié)性過敏性結膜炎的前瞻性研究［26］顯示，每周應用含過敏原的皮膚貼片24 h治療12周后，患兒的過敏癥狀顯著改善，抗組胺藥使用量減少，且未出現(xiàn)局部或全身不良反應。

早在1957年，就有研究者嘗試將過敏原提取物反復應用于破損皮膚來治療花粉和塵螨過敏。有實驗發(fā)現(xiàn)，在小鼠正常無損皮膚上外用抗原可以誘導機體產(chǎn)生Th1型細胞因子和IL-10，局部引流淋巴結內CD4+Foxp3+調節(jié)性T細胞數(shù)量增多，高濃度抗原外用可以有效抑制皮下免疫所誘導的應答反應［27］。與一般TCI疫苗不同，過敏原疫苗需具備針對皮膚DC更高的靶向性，通過佐劑抑制過敏原特異性Th2反應的啟動，減少IL-4和IL-5的產(chǎn)生，增加IFN-γ分泌，誘導Th1反應的極化。既往研究發(fā)現(xiàn)，利用膠帶剝離造成小鼠皮膚角質層破壞可以誘導IL-12和IFN-γ的產(chǎn)生，上調MHC-II類分子及LC表面CD11c和CD86、CD40、CD54的表達，有助于過敏原保護性免疫反應的誘導。近年來，應用各種新型皮膚遞送系統(tǒng)優(yōu)化疫苗設計，減少了非特異性免疫反應的發(fā)生。利用激光微孔技術針對變應性哮喘小鼠進行經(jīng)皮過敏原治療，發(fā)現(xiàn)疫苗可誘導IgG2a和Foxp3+CD4+T細胞增多，下調Th1/Th2/Th17反應，顯著抑制相關促炎因子的產(chǎn)生［28］。一種新型納米疫苗載體DermAll［29］，含有特征性表達卵清蛋白的質粒DNA，能減少IL-4和IL-5分泌，阻止過敏原誘導的Th2反應的進展，平衡Th1/Th2反應，有效減輕致敏小鼠過敏癥狀。偶聯(lián)碳水化合物的過敏原能特異性靶向至抗原提呈細胞，并通過掩蓋B細胞表位使疫苗分子呈現(xiàn)低變應原性［30］。需注意的是，由于真皮富含肥大細胞，皮膚屏障破壞及高劑量的過敏原可能引起局部瘙癢、紅斑、風團甚至全身過敏等不良反應，但當皮膚貼劑應用次數(shù)增加，局部不良反應也隨之減弱，其安全性還需更深入的評估。

五、結語

TCI優(yōu)于傳統(tǒng)免疫接種方式，具有廣闊的應用前景，對多種疾病特別是過敏性疾病的防治有重要意義。TCI誘導不同方向免疫反應，尤其是皮膚免疫耐受方面的具體機制尚未完全明確。大多數(shù)研究基于動物模型，但動物與人類皮膚存在結構差異，需建立更多研究實現(xiàn)動物模型向人體的轉化。并非所有的疫苗都適于皮膚接種，研究中必須評估其安全性和有效性。各種改良的疫苗遞送系統(tǒng)及其在相關疾病上的臨床應用尚待進一步發(fā)掘。

［1］Wang LF,Lin JY,Hsieh KH,et al.Epicutaneous exposure of protein antigen induces a predominant Th2-like response with high IgE production in mice［J］.J Immunol,1996,156（11）:4077-4082.

［2］Glenn GM,Rao M,Matyas GR,et al.Skin immunization made possible by cholera toxin［J］.Nature,1998,391（6670）:851.

［3］Tay SS,Roediger B,Tong PL,et al.The skin-resident immune network［J］.Curr Dermatol Rep,2014,3（1）:13-22.

［4］Jang S,Park JS,Won YH,et al.The expression of toll-like receptors（TLRs） in cultured human skin fibroblast is modulated by histamine［J］.Chonnam Med J,2012,48（1）:7-14.DOI:10.4068/cmj.2012.48.1.7.

［5］Igyártó BZ,Haley K,Ortner D,et al.Skin-resident murine dendritic cell subsets promote distinct and opposing antigen-specific T helper cell responses［J］.Immunity,2011,35（2）:260-272.DOI:10.1016/j.immuni.2011.06.005.

［6］Kumamoto Y,Linehan M,Weinstein JS,et al.CD301b+dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity［J］.Immunity,2013,39（4）:733-743.DOI:10.1016/j.immuni.2013.08.029.

［7］Nakajima S,Igyarto BZ,Honda T,et al.Langerhans cells are critical in epicutaneous sensitization with protein antigen via thymic stromal lymphopoietin receptor signaling［J］.J Allergy Clin Immunol,2012,129 （4）:1048-1055.DOI:10.1016/j.jaci.2012.01.063.

［8］Strid J,Sobolev O,Zafirova B,et al.The intraepithelial T cell response to NKG2D-ligands links lymphoid stress surveillance to atopy［J］.Science,2011,334（6060）:1293-1297.DOI:10.1126/science.1211250.

［9］Otsuka A,Kubo M,Honda T,et al.Requirement of interaction between mast cells and skin dendritic cells to establish contact hypersensitivity［J］.PLoS One,2011,6（9）:e25538.DOI:10.1371/journal.pone.0025538.

［10］Novak N,Bieber T.2.Dendritic cells as regulators of immunity and tolerance［J］.J Allergy Clin Immunol,2008,121（2 Suppl）:S370-S374,S413.DOI:10.1016/j.jaci.2007.06.001.

［11］Gomez De Agüero M,Vocanson M,Hacini-Rachinel F,et al.Langerhans cells protect from allergic contact dermatitis in mice by tolerizing CD8+T cells and activating Foxp3+regulatory T cells［J］.J Clin Invest,2012,122（5）:1700-1711.DOI:10.1172/JCI59725.

［12］Seneschal J,Clark RA,Gehad A,et al.Human epidermal Langerhans cells maintain immune homeostasis in skin by activating skin resident regulatory T cells［J］.Immunity,2012,36（5）:873-84.DOI:10.1016/j.immuni.2012.03.018.

［13］Shklovskaya E,O′Sullivan BJ,Ng LG,et al.Langerhans cells are precommitted to immune tolerance induction ［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108 （44）:18049-18054.DOI:10.1073/pnas.1110076108.

［14］Rattanapak T,Birchall JC,Young K,et al.Dynamic visualization of dendritic cell-antigen interactions in the skin following transcutaneous immunization［J］.PLoS One,2014,9（2）:e89503.DOI:10.1371/journal.pone.0089503.

［15］Engelke L,Winter G,Hook S,et al.Recent insights into cutaneous immunization:How to vaccinate via the skin［J］.Vaccine,2015,33（37）:4663-74.DOI:10.1016/j.vaccine.2015.05.012.

［16］Mittal A,Raber AS,Lehr CM,et al.Particle based vaccine formulations for transcutaneous immunization ［J］.Hum Vaccin Immunother,2013,9（9）:1950-5.DOI:10.4161/hv.25217.

［17］Matsuo K,Ishii Y,Quan YS,et al.Transcutaneous vaccination using a hydrogel patch induces effective immune responses to tetanus and diphtheria toxoid in hairless rat［J］.J Control Release,2011,149（1）:15-20.DOI:10.1016/j.jconrel.2010.05.012.

［18］Mazzitelli S,Pagano C,Giusepponi D,et al.Hydrogel blends with adjustable properties as patches for transdermal delivery［J］.Int J Pharm,2013,454 （1）:47-57.DOI:10.1016/j.ijpharm.2013.06.081.

［19］Sloat BR,Kiguchi K,Xiao G,et al.Transcutaneous DNA immunization following waxing-based hair depilation［J］.J Control Release,2012,157 （1）:94-102.DOI:10.1016/j.jconrel.2011.08.038.

［20］Mittal A,Raber AS,Schaefer UF,et al.Non-invasive delivery of nanoparticles to hair follicles:a perspective for transcutaneous immunization ［J］.Vaccine,2013,31 （34）:3442-3451.DOI:10.1016/j.vaccine.2012.12.048.

［21］Hessenberger M,Weiss R,Weinberger EE,et al.Transcutaneous delivery of CpG-adjuvanted allergen via laser-generated micropores［J］.Vaccine,2013,31（34）:3427-3434.DOI:10.1016/j.vaccine.2012.09.086.

［22］Zaric M,Lyubomska O,Poux C,et al.Dissolving microneedle delivery of nanoparticle-encapsulated antigen elicits efficient crosspriming and Th1 immune responses by murine Langerhans Cells［J］.J Invest Dermatol,2015,135 （2）:425-34.DOI:10.1038/jid.2014.415.

［23］Li N,Peng L,Chen X,et al.Transcutaneous vaccines:novel advances in technology and delivery for overcoming the barriers［J］.Vaccine,2011,29（37）:6179-6190.DOI:10.1016/j.vaccine.2011.06.086.

［24］Senti G,von Moos S,Kündig TM.Epicutaneous immunotherapy for aeroallergen and food allergy［J］.Curr Treat Options Allergy,2014,1（1）:68-78.

［25］Senti G,von Moos S,Tay F,et al.Epicutaneous allergen-specific immunotherapy ameliorates grass pollen-induced rhinoconjunctivitis:a double-blind,placebo-controlled dose escalation study［J］.J Allergy Clin Immunol,2012,129（1）:128-135.DOI:10.1016/j.jaci.2011.08.036.

［26］Agostinis F,Forti S,Di Berardino F.Grass transcutaneous immunotherapy in children with seasonal rhinoconjunctivitis［J］.Allergy,2010,65（3）:410-411.DOI:10.1111/j.1398-9995.2009.02189.x.

［27］田陽子,李巍,劉玉峰.卵清蛋白經(jīng)皮誘導免疫耐受機制初探［J］.中國皮膚性病學雜志,2011（08）:601-603.Tian YZ,Li W,Liu YF.Immune tolerance induced by application of antigen onto intact skin and its mechanism ［J］.Chin J Derm Venereol,2011（08）:601-603.

［28］Bach D,Weiss R,Hessenberger M,et al.Transcutaneous immunotherapy via laser-generated micropores efficiently alleviates allergic asthma in Phl p 5-sensitized mice［J］.Allergy,2012,67（11）:1365-1374.DOI:10.1111/all.12005.

［29］Garaczi E,Szabo K,Francziszti L,et al.DermAll nanomedicine for allergen-specific immunotherapy［J］.Nanomedicine,2013,9（8）:1245-1254.DOI:10.1016/j.nano.2013.05.011.

［30］Weiss R,Scheiblhofer S,Machado Y,et al.New approaches to transcutaneous immunotherapy:targeting dendritic cells with novel allergen conjugates［J］.Curr Opin Allergy Clin Immunol,2013,13（6）:669-676.DOI:10.1097/ACI.0b013e328364f4df.

Mechanisms of transcutaneous immunization and its application in allergic diseases

Liu Xiaochun,Yao Xu

Department of Allergy and Rheumatology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

Transcutaneous immunization（TCI）is a novel immunotherapy approach that induces systemic immune responses via topical application of antigens and adjuvants onto the skin.It is a safe and effective method,and is expected to serve as an attractive alternative to traditional vaccination.TCI induces immune responses in different directions,but the exact mechanism of skin immune tolerance is still unclear.Most studies on TCI are based on animal models.However,there are structural differences between animal skin and human skin,so more researches are needed to achieve the translation of TCI from bench to bedside.Not all vaccines are suitable for cutaneous inoculation,so vaccines for TCI should be evaluated for their safety and efficacy.Various reformed vaccine delivery systems are needed to be further explored in related diseases.

Skin diseases;Anaphylaxis;Immunity;Vaccines;Therapeutic uses

Yao Xu,Email:dryao_xu@126.com

姚煦，Email：dryao_xu@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.06.024

國家自然科學基金（81171501、81371735、81573045）；江蘇省自然科學基金（BK20150166）；2014 年亞美醫(yī)學基金會（MMAAP）皮膚病項目基金

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81171501,81371735,81573045）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China （BK20150166）;Milstein Medical Asian American Partnership（MMAAP）Foundation Research Project Award in Skin Disease in 2014

2015-10-14）

（本文編輯：吳曉初）