周駿輝，袁媛，黃璐琦

(道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

·專論·

SSR標(biāo)記在中藥材分子身份證體系構(gòu)建中的應(yīng)用△

周駿輝，袁媛*，黃璐琦

(道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR，simple sequence repeat)是真核基因組上一段短的重復(fù)序列，具有分布廣泛和保守性較高的特點(diǎn)，常用于遺傳多樣性分析和物種鑒定。針對(duì)現(xiàn)有鑒定方法難以完成藥材近緣種及種下水平基原鑒定，以及栽培產(chǎn)區(qū)擴(kuò)大導(dǎo)致急需建立中藥材種質(zhì)和農(nóng)家種鑒定方法的需求，本文簡(jiǎn)要介紹了SSR的概念和篩選方法，及其在中藥材分子身份證體系構(gòu)建中的應(yīng)用，旨在為中藥鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)體系建設(shè)提供參考。

SSR分子標(biāo)記；中藥材；遺傳多樣性；品種鑒定

中藥作為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要部分，已有上千年的歷史。作為中藥產(chǎn)業(yè)的源頭，藥材質(zhì)量對(duì)中藥可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。藥材真?zhèn)舞b定是中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的關(guān)鍵內(nèi)容之一，已有的研究往往僅側(cè)重于藥材基原種間水平的鑒別。然而中藥材品種繁多、產(chǎn)地廣泛，同種藥材在種下水平上也存在遺傳變異，如不同產(chǎn)地的綠桿天麻，其酯酶同工酶譜也不盡相同[1]。并且在長(zhǎng)期的栽培過程中形成了豐富的種質(zhì)資源和農(nóng)家品種，不同種質(zhì)資源和農(nóng)家品種在化學(xué)成分和藥理活性上也可能存在差異。田偉等[2]對(duì)山東丹參種質(zhì)資源進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示，10個(gè)種質(zhì)的產(chǎn)量和丹參酮的含量差異明顯，這將對(duì)藥材的質(zhì)量和臨床療效造成影響。

傳統(tǒng)鑒別技術(shù)主要是通過眼看、手摸、鼻聞、口嘗、水試、火試等方法對(duì)中藥材的藥用部分進(jìn)行鑒別[3]。然而對(duì)于那些親緣關(guān)系較近的正品及其混淆品，尤其是種下水平的基原鑒定，傳統(tǒng)方法就顯得力不從心。通過色譜、波譜等理化鑒定方法對(duì)中藥材的活性成分進(jìn)行檢測(cè)可以對(duì)藥材的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)[4]，但活性成分的含量會(huì)受到采收時(shí)期、產(chǎn)地、栽培方式、加工方式等多種因素的影響。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)在中藥鑒定中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：一方面，由于生命體基因組變異十分豐富，從而使藥用植物DNA的分子標(biāo)記也十分豐富；另一方面，DNA分子標(biāo)記可以對(duì)中藥材不同發(fā)育時(shí)期、不同組織器官進(jìn)行檢測(cè)，且不受環(huán)境和基因表達(dá)的影響。近年來，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已被應(yīng)用于中藥資源、中藥鑒定、藥材品質(zhì)形成及質(zhì)量評(píng)價(jià)等研究。如利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)梔子進(jìn)行種質(zhì)篩選，為優(yōu)良品種選育打下基礎(chǔ)[5]；對(duì)當(dāng)歸進(jìn)行遺傳多樣性分析，為種質(zhì)資源收集保存提供理論依據(jù)[6]；在天南星及其混偽品鑒別中，DNA分子標(biāo)記技術(shù)也發(fā)揮著重要作用[7]。

目前基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分子標(biāo)記技術(shù)主要包括RAPD(random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記)、AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)和SSR(simple sequence repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)序列)等。在這些類型的分子標(biāo)記中，SSR分子標(biāo)記只需要檢測(cè)少量DNA樣品，并且條帶簡(jiǎn)單一致。SSR序列還具有較高的多態(tài)性、共顯性、含量豐富的特點(diǎn)[8]，非常適合作為分子標(biāo)記用于中藥材的鑒定工作。

本文主要介紹了SSR的基本原理及分布特點(diǎn)，并對(duì)近年來SSR標(biāo)記在藥用植物研究中取得的成果進(jìn)行總結(jié)和分析，為其在中藥鑒定中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 SSR分子標(biāo)記概念

SSR是存在于真核生物基因組非編碼區(qū)的一段簡(jiǎn)單重復(fù)序列，在物種進(jìn)化過程中呈現(xiàn)較為保守的特性，因此常用于DNA指紋圖譜的構(gòu)建和物種鑒別。SSR序列也被稱為微衛(wèi)星序列(microsatellites)[9]和短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)，通常由2～6個(gè)重復(fù)的核苷酸構(gòu)成[10]。

SSR最早在人類基因組的研究中被提出，隨后在其他真核生物中，如哺乳動(dòng)物、鳥類、魚類、酵母和植物中均有報(bào)道[11]。在植物基因組中，每隔21～65 kb就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)SSR位點(diǎn)[12]，且不同基因型中SSR序列的核苷酸重復(fù)數(shù)目也不盡相同。由于SSR具有這種分布廣泛、含量豐富、種類繁多的特點(diǎn)，其作為分子標(biāo)記在物種多態(tài)性分析方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。尤其是SSR呈現(xiàn)出的DNA多態(tài)性，能夠?qū)τH緣關(guān)系較近的物種進(jìn)行區(qū)分，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒別方法在近緣物種鑒別中的不足。

2 SSR分子標(biāo)記的獲取

SSR分子標(biāo)記主要是從基因組序列、轉(zhuǎn)錄組序列和EST序列(expressed sequence tag，表達(dá)序列標(biāo)簽)中獲得。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，全基因組測(cè)序的成本不斷降低，產(chǎn)生了大量的中藥材基因序列[13]，這些數(shù)據(jù)便是SSR分子標(biāo)記的重要來源。SSR通常長(zhǎng)度為100～200 bp，并且其兩端序列相對(duì)保守，可以由這些保守序列設(shè)計(jì)特異性引物。目前常用的SSR篩選軟件有SSRHunter、MISA和ssr.pl(http：//www.gramene.org/db/markers/ssrtool)等。

從基因組序列中已獲得了靈芝[14]、黃芩[15]、丹參[16]等中藥材的SSR分子標(biāo)記，但是大部分藥用植物的基因數(shù)據(jù)仍未公布。由于SSR序列在物種進(jìn)化過程中是相對(duì)保守的，即SSR側(cè)翼序列在屬內(nèi)種間或有較近親緣關(guān)系的屬間有一定的保守性，甚至有部分SSR位點(diǎn)在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的分類群中也具有保守性[17]，因此，也可利用近緣物種的基因數(shù)據(jù)獲取SSR序列。如在豆科植物黃芪的研究中，因?yàn)辄S芪自身的基因信息非常有限，所以很難采用黃芪基因組序列設(shè)計(jì)相關(guān)SSR引物，利用已報(bào)道的大豆引物也可成功擴(kuò)增出黃芪的SSR序列[18]。

與基因組序列相似，轉(zhuǎn)錄組序列也能作為SSR分子標(biāo)記的來源[19]，其更多地體現(xiàn)出基因編碼區(qū)域的信息，可以更直接地用于基因表達(dá)及其藥材性狀相關(guān)的研究。且轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的成本更低、所包含的信息更多，在中藥資源和中藥鑒定研究中將發(fā)揮重要的作用。

EST(expressed sequence tag，表達(dá)序列標(biāo)簽)是通過對(duì)cDNA文庫(kù)克隆進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序所獲得的5’或3’端序列，長(zhǎng)度一般為 300～500 bp，可代表生物體某一時(shí)間內(nèi)某組織中表達(dá)的基因。以EST數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)構(gòu)建SSR標(biāo)記，即EST-SSR，是目前較為流行的方法。EST-SSR具有很好的保守性，在不同物種間的通用性較好。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄了藥用植物的大量EST序列，可用于EST-SSR的開發(fā)，降低了EST-SSR的開發(fā)成本和時(shí)間。盡管EST數(shù)據(jù)庫(kù)可以為SSR標(biāo)記提供大量來源，但能夠用于引物設(shè)計(jì)的EST數(shù)目卻相對(duì)較低[20]。這是因?yàn)镋ST序列長(zhǎng)度普遍小于1000 bp，而在這有限的長(zhǎng)度內(nèi)，含有重復(fù)序列的EST只有很少一部分，并且在篩選引物過程中還會(huì)排除一定數(shù)量的EST序列，這就導(dǎo)致了EST數(shù)據(jù)庫(kù)在進(jìn)行SSR構(gòu)建時(shí)的利用率較低。如NCBI上有10 260條球孢蟲草EST序列，但是最終能夠用于構(gòu)建SSR分子標(biāo)記的只有718條序列[21]。

3 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析結(jié)果是構(gòu)建中藥材DNA指紋圖譜及其DNA身份證的基礎(chǔ)。由于SSR序列表現(xiàn)出較高的多態(tài)性和共顯性，并且符合孟德爾遺傳定律，使得SSR分子標(biāo)記非常適合親緣關(guān)系較近物種間遺傳多樣性和遺傳變異的比較[22]。

中藥材種質(zhì)或農(nóng)家品種的遺傳多樣性往往與其本身的特性相關(guān)，不同種質(zhì)或農(nóng)家種間的SSR序列會(huì)存在差異。如采集自同一生境下的野生居群魚腥草，利用SSR分子標(biāo)記分析結(jié)果表明，其單株樣本間同樣存在遺傳變異[23]。

篩選適合的SSR標(biāo)記組合，首先需要進(jìn)行中藥材種質(zhì)或農(nóng)家品種的遺傳多樣性分析。如利用SSR標(biāo)記對(duì)不同產(chǎn)區(qū)三七種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，在此基礎(chǔ)上篩選合適的標(biāo)記，將易感病類型以及遺傳一致度較低的品種進(jìn)行區(qū)分，從而為三七選種和純化提出依據(jù)[24]。

4 DNA指紋圖譜與分子身份證

隨著中藥材栽培產(chǎn)區(qū)的不斷擴(kuò)大，同一種質(zhì)在不同產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)了性狀特征發(fā)生改變的現(xiàn)象，這可能導(dǎo)致新種質(zhì)的出現(xiàn)；另一方面，在引種的過程中也出現(xiàn)了盲目引種的情況，加劇了種質(zhì)混亂，難以從源頭上保證藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。

分子身份證是在指紋圖譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的電泳圖譜，與指紋圖譜的區(qū)別在于分子身份證把品種特征數(shù)字化后，采用資源特征分析軟件分析得出字符串形式的結(jié)果，這種結(jié)果可以簡(jiǎn)單明確地區(qū)分品種間的差異[25]。分子身份證既能夠鑒別生物個(gè)體之間的差異，又能對(duì)生物個(gè)體的特征進(jìn)行鑒定，易于存檔記錄和分析比較。分子身份證已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物和果蔬的種質(zhì)研究中，而在中藥材領(lǐng)域還處于剛剛起步的階段。

利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建DNA指紋圖譜可以有效區(qū)分表型特征相似的近緣物種、種質(zhì)資源以及農(nóng)家種。即依據(jù)SSR序列多態(tài)性信息，采用不同SSR序列組合，建立每種藥材及其種質(zhì)或農(nóng)家種的DNA指紋圖譜，構(gòu)建中藥材分子身份證體系。如利用3對(duì)SSR引物即可區(qū)分出忍冬、紅白忍冬和4種山銀花[26-27]；僅用兩對(duì)SSR引物就能夠鑒別出恩施產(chǎn)區(qū)的厚樸和其他湖北省產(chǎn)地的厚樸[28]。將這些SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果轉(zhuǎn)化為數(shù)字信息，即構(gòu)建了中藥材分子身份證。如在大豆抗性基因相關(guān)的SSR標(biāo)記的研究中，一個(gè)大豆品系的分子身份證為3434142，其含義為第一條SSR引物擴(kuò)增出來的帶型為3，第二條SSR引物擴(kuò)增出來的帶型為4，以此類推[25]。由于SSR分子標(biāo)記的多態(tài)性和特異性，每個(gè)物種的分子身份證也是獨(dú)一無二的。這種數(shù)字化的種質(zhì)信息不僅利于保存，更能簡(jiǎn)單而準(zhǔn)確地鑒別種質(zhì)差異。本課題組篩選獲得一套金銀花引物，可同時(shí)區(qū)分不同產(chǎn)地的5份金銀花種質(zhì)，構(gòu)建了金銀花分子身份證體系[29]。

5 小結(jié)

中藥材是我國(guó)獨(dú)特且具有戰(zhàn)略意義的寶貴資源，在2015年頒發(fā)的《中藥材保護(hù)和發(fā)展規(guī)劃(2015～2020年)》中表明，中藥資源是戰(zhàn)略資源，其種植和保護(hù)都是至關(guān)重要的。隨著中藥工業(yè)產(chǎn)值的激增，中藥材種質(zhì)資源的保存和管理，以及藥材質(zhì)量控制都需要明確且有效的方法和標(biāo)準(zhǔn)。SSR分子標(biāo)記已在物種鑒定、遺傳多樣性分析等方面發(fā)揮了重要作用，將其應(yīng)用到中藥材物種、種質(zhì)資源以及農(nóng)家種鑒定，建立標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)和分子身份證體系，不僅有利于中藥材質(zhì)量控制，還在中藥材種質(zhì)資源保護(hù)、評(píng)價(jià)與利用以及中藥材新品種選育等領(lǐng)域均發(fā)揮重要的推動(dòng)作用。

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ApplicationofSSRMarkersinEstablishmentofMolecularIdentityforTraditionalChineseMedicinalMaterials

ZHOU Junhui，YUAN Yuan*，HUANG Luqi

(StateKeyLaboratoryofDao-diHerbs，NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChineseAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

SSR (simple sequence repeat) is eukaryotic DNA sequence that consists of repeat motifs.Because of its wide distribution and high conservation，SSR markers have been widely used in studying genetic diversity and genetic relationships.The existing identification methods are incompetent for differentiating closely related species or infra-species of traditional Chinese medicinal materials.Because of the increasing of traditional Chinese medicinal materials production areas，a more efficient identification method is needed.This review provides brief information on mapping and application of SSR markers，and can be a reference for identifying traditional Chinese medicinal materials.

SSR markers；traditional Chinese medicinal materials；genetic diversity；variety identification

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.001

2015-11-06)

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(20140703)；科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)(2015FY111500)

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袁媛，研究員，研究方向：分子生物學(xué)；Tel(010)6401441-2847，E-mail：y_yuan0732@163.com