郭瑞霞，范麗君，李艷敏

河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

△女，1972年3月生，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：婦科腫瘤，E-mail：grx0322@sohu.com

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子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1基因的甲基化狀態(tài)及其mRNA、蛋白表達(dá)水平的檢測*

郭瑞霞△，范麗君，李艷敏

河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

△女，1972年3月生，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：婦科腫瘤，E-mail：grx0322@sohu.com

關(guān)鍵詞子宮內(nèi)膜腺癌；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1；DNA甲基化

摘要目的：探討子宮內(nèi)膜腺癌組織中胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1(IGFBP-rP1)基因的甲基化狀態(tài)及其與IGFBP-rP1 mRNA、蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。方法：采用甲基化特異性PCR檢測45例子宮內(nèi)膜腺癌、30例子宮內(nèi)膜單純性增生和30例子宮內(nèi)膜不典型增生組織中IGFBP-rP1基因啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化SP法分別檢測上述3種組織中IGFBP-rP1 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果：子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1基因在啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率高于其在第一外顯子區(qū)的甲基化率(χ2=6.429，P=0.011)。子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1基因在啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率低于子宮內(nèi)膜不典型增生組織和單純性增生組織(F=14.659，P=0.001)。子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1 mRNA和蛋白的表達(dá)均高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織和單純性增生組織(F=8.619、χ2=23.611，P均<0.05)；在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生IGFBP-rP1基因甲基化的子宮內(nèi)膜腺癌組織中，其mRNA的表達(dá)水平低于未甲基化組(t=4.758,P=0.001)，其蛋白的表達(dá)與甲基化狀態(tài)呈負(fù)關(guān)聯(lián)(rP=-0.625，P<0.001)。結(jié)論：子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1基因甲基化主要發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)，且呈低甲基化狀態(tài)；IGFBP-rP1啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化狀態(tài)可能是IGFBP-rP1基因在子宮內(nèi)膜腺癌組織中高表達(dá)的調(diào)控機(jī)制之一。

AbstractAim: To investigate the methylation of insulin like growth factor binding protein-related protein 1(IGFBP-rP1) gene and its relationship with the expressions of IGFBP-rP1 mRNA and protein in endometrial adenocarcinoma tissue. Methods: Methylation-specific PCR was used to detect the methylation status of IGFBP-rP1 gene in the promoter region and the first exon region in 45 cases of endometrial adenocarcinoma,30 cases of endometrial atypical hyperplasia, and 30 cases of simple endometrial hyperplasia tissue, and quantitative Real-time PCR and immunohistochemical SP method were respectively used to detect the mRNA and protein expressions of IGFBP-rP1.Results: The methylation rate of IGFBP-rP1 gene in the promoter region was higher than that in the first exon region in the endometrial adenocarcinoma tissue(χ2=6.429，P=0.011). The methylation rate of IGFBP-rP1 gene in the promoter region of endometrial adenocarcinoma tissue was significantly lower than those in endometrial atypical hyperplasia and simple endometrial hyperplasia tissue(F=14.659,P=0.001). The mRNA and protein expressions of IGFBP-rP1 gene in endometrial adenocarcinoma tissue were higher than those in endometrial atypical hyperplasia and simple endometrial hyperplasia tissue(F=8.619，χ2=23.611，P<0.05).The expression of IGFBP-rP1 mRNA in the endometrial adenocarcinoma tissue with the promoter methylation was lower than that without(t=4.758,P=0.001);the expression of IGFBP-rP1 protein in the endometrial adenocarcinoma tissue with the promoter methylation was negatively associated with the promoter methylation(rP=-0.625，P<0.001).Conclusion: The methylation of IGFBP-rP1 gene mainly exists in the promoter region of endometrial adenocarcinoma tissue in a low methylation status;the low methylation status in the promoter region of IGFBP-rP1 may be one of the regulatory mechanisms of the high expression of IGFBP-rP1 gene in endometrial adenocarcinoma.

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，以來源于子宮內(nèi)膜腺體的腺癌最常見，是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢[1]。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(insulin like growth factor binding protein，IGFBP)是胰島素樣生長因子系統(tǒng)(insulin-like growth factor system，IGFs)中的重要成員，而胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1(insulin like growth factor binding protein-related protein 1，IGFBP-rP1)因其與胰島素的強(qiáng)結(jié)合能力而受到廣泛關(guān)注[2-3]。作者所在課題組的前期研究[4-5]表明：IGFBP-rP1與胰島素抵抗有關(guān)，參與了子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生發(fā)展，但其表達(dá)調(diào)控機(jī)制不明。DNA甲基化是目前研究基因表達(dá)調(diào)控的熱點(diǎn)，在對(duì)結(jié)腸癌、賁門癌的研究[6-7]中發(fā)現(xiàn)IGFBP-rP1基因的異常甲基化狀態(tài)與其表達(dá)調(diào)控有關(guān)。該研究應(yīng)用甲基化特異性PCR檢測子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1基因CpG島的甲基化狀態(tài)，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化SP法分別檢測子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1基因mRNA和蛋白的表達(dá)，探究IGFBP-rP1基因甲基化狀態(tài)與其mRNA和蛋白表達(dá)的關(guān)系，進(jìn)一步闡明子宮內(nèi)膜腺癌發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年10月至2014年5月因子宮內(nèi)膜腺癌切除子宮的內(nèi)膜腺癌標(biāo)本45例，均經(jīng)病理證實(shí)且患者術(shù)前均未接受放化療，臨床資料完整。收集同期子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)膜單純性增生的內(nèi)膜標(biāo)本各30例為對(duì)照。以上標(biāo)本的采取均獲得患者知情同意。因新鮮組織標(biāo)本量所限，蛋白表達(dá)的研究選用子宮內(nèi)膜腺癌組織蠟塊，由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科提供。

1.2試劑甲基化試劑盒購自美國ZYMO Research公司,DNA提取試劑盒、Trizol試劑、免疫組化SP試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，甲基化引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TOYOBO公司，Taq酶、qRT-PCR引物及內(nèi)參購自南京諾唯贊生物科技有限公司。兔抗人IGFBP-rP1多克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.3甲基化檢測

1.3.1CpG島的預(yù)測運(yùn)用在線軟件Meth Primer預(yù)測IGFBP-rP1基因5’端CpG島的情況，結(jié)果顯示IGFBP-rP1基因5’端有兩個(gè)CpG島存在，這兩個(gè)CpG島跨越了啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子區(qū)，故而選取啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子區(qū)進(jìn)行分析。

1.3.2IGFBP-rP1基因甲基化狀態(tài)檢測用DNA提取試劑盒提取組織DNA，紫外分光光度儀檢測DNA含量和純度，DNA Methylation-Gold kit(購自美國ZYMO Research公司)進(jìn)行甲基化修飾。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列、退火溫度及擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。反應(yīng)體系(50 μL)：2×Taq MasterMix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，模板DNA 1 μg，其余用RNase-free水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán)；最終72 ℃徹底延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果拍照保存。陰性對(duì)照采用滅菌蒸餾水取代DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。不同組織中IGFBP-rP1基因的甲基化狀態(tài)有3種情況：完全甲基化、非甲基化和半甲基化，其中完全甲基化和半甲基化均計(jì)為甲基化。

表1　IGFBP-rP1基因甲基化引物

F:上游引物；R:下游引物。

1.4IGFBP-rP1 mRNA的表達(dá)檢測應(yīng)用Trizol試劑提取組織RNA，紫外分光光度儀檢測RNA含量和純度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)為cDNA，所得cDNA稀釋10倍備用。qRT-PCR:反應(yīng)體系(20 μL):SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μL,上、下游引物(1.0 μmol/L)各0.8 μL，稀釋后的cDNA 2 μL，蒸餾水補(bǔ)足。反應(yīng)條件:95 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。采用2-ΔΔCt法計(jì)算IGFBP-rP1 mRNA的表達(dá)水平。

1.5IGFBP-rP1蛋白的表達(dá)檢測蠟塊依次經(jīng)烘烤，二甲苯、梯度乙醇脫蠟、水化，抗原修復(fù)后按照免疫組化SP試劑盒步驟操作。一抗兔抗人IGFBP-rP1多克隆抗體按150稀釋后使用，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的棕色顆粒即為陽性，用雙盲法閱片和判斷結(jié)果。染色強(qiáng)度分為無、弱、中、強(qiáng)4級(jí)，分別計(jì)為0、1、2、3分；視野內(nèi)陽性細(xì)胞百分比按0%～、10%～、26%～、51%～100%分4級(jí)，分別計(jì)為0、1、2、3分。兩項(xiàng)評(píng)分的乘積為0分判為陰性，≥1分則判為陽性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)比較3種組織中IGFBP-rP1基因啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子區(qū)的甲基化率以及3種組織中IGFBP-rP1蛋白的陽性表達(dá)率，采用單因素方差分析比較3種組織中IGFBP-rP1 mRNA表達(dá)水平的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較不同IGFBP-rP1甲基化狀態(tài)的子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1 mRNA的表達(dá)水平，采用Pearson列聯(lián)系數(shù)分析子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1基因的甲基化狀態(tài)與其蛋白表達(dá)的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1不同組織IGFBP-rP1基因啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子區(qū)的甲基化水平見圖1、2，表1。子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1基因在啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率高于其在第一外顯子區(qū)的甲基化率(χ2=6.429,P=0.011)。

圖1　IGFBP-rP1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)

M:甲基化；U:非甲基化；1:完全甲基化狀態(tài)；2:半甲基化狀態(tài)；3:非甲基化狀態(tài)；4:空白對(duì)照。

圖2　IGFBP-rP1基因第一外顯子區(qū)的甲基化狀態(tài)

M:甲基化；U:非甲基化；1:完全甲基化狀態(tài)；2:半甲基化狀態(tài)；3:非甲基化狀態(tài)；4:空白對(duì)照。

表1　不同組織IGFBP-rP1基因啟

*：與其他兩種組織相比，P<0.017。

2.2不同組織中 IGFBP-rP1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況見表2、圖3。IGFBP-rP1蛋白主要表達(dá)于胞質(zhì)，但在子宮內(nèi)膜腺癌胞核中也可見其表達(dá)；整體來看子宮內(nèi)膜腺癌組織中棕染細(xì)胞多，且染色深。由表2可知，子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1 mRNA的表達(dá)水平和蛋白的陽性表達(dá)率高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織和單純性增生組織。

表2　不同組織中

*：與其他兩種組織相比，P<0.017。

圖3　不同組織中IGFBP-rP1蛋白的表達(dá)(SP，×400)

2.3子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1基因的甲基化狀態(tài)與其mRNA和蛋白表達(dá)的關(guān)系見表3、4。由表3、4可知，在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生IGFBP-rP1基因甲基化的子宮內(nèi)膜腺癌組織中，其mRNA的表達(dá)水平低于未甲基化組；其蛋白的表達(dá)與甲基化狀態(tài)呈負(fù)關(guān)聯(lián)。

表3　子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1

表4　子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1

3討論

IGFs是研究胰島素抵抗的熱點(diǎn)，是一個(gè)由配體(IGF-1、IGF-2)，細(xì)胞表面受體(IGF-1R、IGF-2R)，胰島素受體，IGFBP以及IGFBP蛋白酶組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。IGFBP-rP1是IGFBPs家族中重要的一員，因其與胰島素的高結(jié)合力而得到廣泛關(guān)注。研究表明：此基因在膠質(zhì)瘤[8]中表現(xiàn)為促癌作用，而在肝細(xì)胞癌[9]、胃癌[10]、賁門癌[7]中則表現(xiàn)為抑癌作用。該研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1基因mRNA和蛋白的表達(dá)量均高于子宮內(nèi)膜單純性增生組織和不典型增生組織，充當(dāng)促癌基因的角色。

遺傳學(xué)改變已不足以解釋腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，而更多地需依賴表觀遺傳學(xué)改變給予進(jìn)一步闡釋。DNA甲基化作為化學(xué)修飾的一種形式，能在不改變核苷酸序列的前提下使其遺傳表現(xiàn)發(fā)生變化，是表觀遺傳學(xué)的重要內(nèi)容，也是目前研究的熱點(diǎn)。DNA的甲基化大多發(fā)生于CpG二核苷酸的胞嘧啶上。在哺乳動(dòng)物中CpG以兩種形式存在：一種是分散于DNA序列，另一種呈現(xiàn)高度聚集狀態(tài)，稱之為CpG島，主要位于基因的啟動(dòng)子區(qū)和外顯子區(qū)[11]。DNA的異常甲基化包括高甲基化及低甲基化兩種狀態(tài)。DNA的高甲基化是許多抑癌基因表達(dá)丟失的重要途徑之一。在正常組織里，CpG島是非甲基化的，一旦發(fā)生甲基化，會(huì)影響相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，進(jìn)而抑制基因的表達(dá)。DNA的低甲基化是指分布于正常組織中的甲基化位點(diǎn)發(fā)生去甲基化，從而引起基因表達(dá)的改變。該研究結(jié)果表明：在子宮內(nèi)膜腺癌組織中，IGFBP-rP1基因甲基化主要發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)，且呈低甲基化狀態(tài)?；虻牡图谆嬖谟诙喾N腫瘤之中，最早是由Feinberg等[12]發(fā)現(xiàn)，而后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種基因的低甲基化狀態(tài)，且甲基化的區(qū)域也不盡相同，如c-erbB-2基因[13]啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化狀態(tài)，SNCG基因[14]第一外顯子區(qū)的低甲基化狀態(tài)，Ras基因[15]第一內(nèi)含子區(qū)的低甲基化狀態(tài)。該研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1 mRNA的表達(dá)水平和蛋白的陽性表達(dá)率高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織和單純性增生組織，在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生IGFBP-rP1基因甲基化的子宮內(nèi)膜腺癌組織中，其mRNA的表達(dá)水平低于未甲基化組；其蛋白的表達(dá)與甲基化狀態(tài)呈負(fù)關(guān)聯(lián)，提示此基因啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化狀態(tài)是其在子宮內(nèi)膜腺癌組織中高表達(dá)的調(diào)控機(jī)制之一。目前認(rèn)為DNA低甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制可能為：低甲基化或去甲基化會(huì)活化某些原癌基因；低甲基化使染色質(zhì)和基因組不穩(wěn)定，突變頻率增加，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步探究。DNA甲基化是可逆的化學(xué)修飾過程，這就提示著逆轉(zhuǎn)異常甲基化狀態(tài)可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為臨床上疾病的診治提供了新的思路。

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*河南省科技攻關(guān)省部共建項(xiàng)目201201001

Detection of methylation of IGFBP-rP1 gene and relationship with its mRNA and protein expressions in endometrial adenocarcinoma tissue

GUORuixia，F(xiàn)ANLijun，LIYanmin

Key-DisciplinesLaboratoryofClinical-MedicineofHenan,Zhengzhou450052

Key wordsuterine endometrial adenocarcinoma；insulin like growth factor binding protein-related protein 1；DNA methylation

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.015

中圖分類號(hào)R737.33