王碧君，郭藝紅，張慧紅，李　婧，楊新紅

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450052

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PPARγ上調(diào)對PCOS患者卵巢顆粒細胞P450arom mRNA的表達及T轉(zhuǎn)化效應(yīng)的影響*

王碧君，郭藝紅#，張慧紅，李婧，楊新紅

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450052

關(guān)鍵詞多囊卵巢綜合征；卵巢顆粒細胞；過氧化物酶體增殖物激活受體γ；細胞色素P450芳香化酶；T轉(zhuǎn)化效應(yīng)

摘要目的：探討PPARγ上調(diào)對PCOS患者卵巢顆粒細胞P450arom mRNA表達的調(diào)控作用及對T轉(zhuǎn)化效應(yīng)的影響。方法：提取10例雄激素正常的PCOS 患者(NA-PCOS組)、10例伴高雄激素血癥的PCOS患者(HA-PCOS組)及10例僅因輸卵管因素不孕患者(對照組)的卵巢顆粒細胞，分別給予0、1、10 nmol/L的PPARγ激動劑羅格列酮培養(yǎng)48 h后，采用RT-PCR測定PPARγ、P450arom mRNA的表達，采用 ELISA法測定培養(yǎng)液中E2值，計算T轉(zhuǎn)化率。結(jié)果：PPARγ上調(diào)后，3組患者P450arom mRNA的表達均降低，T轉(zhuǎn)化率下降，尤其是HA-PCOS組(P<0.05)。PPARγ上調(diào)(10 nmol/L羅格列酮處理)后，HA-PCOS組卵巢顆粒細胞中PPARγ mRNA的表達水平和T轉(zhuǎn)化率負(fù)相關(guān)，P450arom mRNA的表達水平和T轉(zhuǎn)化率正相關(guān)(r=-0.633、0.829,P<0.05)。結(jié)論：PPARγ可能通過抑制P450arom參與PCOS高雄激素血癥的發(fā)生。

AbstractAim: To explore the effects of up-regulation of PPARγ on expression of P450arom mRNA and T transforming effects in the ovarian granulosa cells from patients with polycystic ovarian syndrome(PCOS). Methods: A total of 30 patients were included, with 10 in NA-PCOS group(PCOS with normal androgen),10 in HA-PCOS group(PCOS with hyperandrogenism) and 10 in control group. Granulosa cells were prepared and treated with 0,1,10 nmol/L rosiglitazone for 48 h.The expressions of PPARγ mRNA and P450arom mRNA were measured by RT-PCR. After intervention, the E2 value in broth was determined by ELISA and T transforming rate was calculated.Results: After the up-regulation of PPARγ, the expression of P450arom mRNA and the T transforming rate in the 3 groups were decreased,especially in the HA-PCOS group. In HA-PCOS group(being treated by 10 nmol/L rosiglitazone)，the expression of PPARγ mRNA was negatively associated with T transforming rate,and the expression of P450arom mRNA was positively associated with T transforming rate(r=-0.633,0.829,P<0.05).Conclusion: PPARγ may participate in the pathogenesis of PCOS with high androgen level by down-regulating the expression of P450arom.

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種以卵泡發(fā)育障礙為主的病因復(fù)雜、表現(xiàn)異質(zhì)的代謝紊亂綜合征[1]。高雄激素血癥是PCOS最主要的內(nèi)分泌特征之一[2]，對體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局有一定的負(fù)面影響[3]。細胞色素P450芳香化酶(cytochrome P450 aromatase，P450arom)是顆粒細胞中催化雄激素生成雌激素的關(guān)鍵酶，其活力受抑制導(dǎo)致雄激素轉(zhuǎn)化障礙[4]，是造成高雄激素血癥的直接因子。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)是核受體超家族的成員，其表達量與PCOS患者卵泡液總睪酮、游離雄激素指數(shù)呈正相關(guān)[5]。二者在卵巢顆粒細胞中存在怎樣的調(diào)控關(guān)系及如何影響T轉(zhuǎn)化效應(yīng)目前尚不清楚。作者觀察了不同濃度的PPARγ激動劑羅格列酮對PCOS患者卵巢顆粒細胞P450arom mRNA 的表達及 T 轉(zhuǎn)化效應(yīng)的影響，為進一步深入研究 PPARγ對卵巢顆粒細胞 P450arom 的影響提供前期實驗基礎(chǔ)。

1對象與方法

1.1研究對象選擇2013年11月至2014年2月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精-胚胎移植助孕的25~30歲的患者,按照設(shè)計要求分別選擇雄激素正常的PCOS患者10例(NA-PCOS組),伴高雄激素血癥的PCOS患者10例(HA-PCOS組)以及同期僅因輸卵管因素導(dǎo)致不孕的患者10例(對照組)。PCOS的診斷按照2003年鹿特丹PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：有糖尿病家族史、遺傳病史、免疫性不孕、卵巢缺如或腹盆腔手術(shù)史、畸形子宮以及內(nèi)分泌疾病史者。該研究獲鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，且所有受試對象均簽署知情同意書。

1.2控制性超促排卵患者接受標(biāo)準(zhǔn)長方案促排卵治療，采用鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心常規(guī)方法受精，進行胚胎移植和黃體支持[6]。移植后剩余胚胎冷凍保存。

1.3標(biāo)本收集及測定

1.3.1血樣采集及性激素測定月經(jīng)周期第2～4天，HCG注射當(dāng)日晨抽血約4 mL，用電化學(xué)免疫發(fā)光法(德國2010自動化檢測儀)以及試劑盒(GmbH,德國)測定血清 E2、 P及LH值。

1.3.2卵巢顆粒細胞的分離及羅格列酮干預(yù)處理

收集患者雙側(cè)卵巢直徑≥14 mm的清亮、無血染的卵泡液，離心。PBS、淋巴細胞分離液(Ficoll)分別購于美國Hyclone公司和天津灝洋生物制劑公司。用M199細胞培養(yǎng)液調(diào)整卵巢顆粒細胞的密度為(2~4)×105mL-1，取96孔板，每孔加入0.5 mL；培養(yǎng)48 h加入1 μmol/L的雄烯二酮并分別加入終濃度為0、1、10 nmol/L的羅格列酮[7]，培養(yǎng)24 h。PBS反復(fù)洗細胞3次，-84 ℃凍存。每個濃度及對照均設(shè)1個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。

1.3.3RT-PCR測定卵巢顆粒細胞PPARγ mRNA和P450arom mRNA的表達用Trizol法(試劑購于美國Invitrogen公司)提取3組患者卵巢顆粒細胞的RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；按照試劑盒(美國Promega公司)說明書進行RT-PCR操作。引物序列:PPARγ(274 bp)上游引物5’-CAGGAGCAGAGCAAAGA-3’，下游引物5’-GGACTCAGGGTGGTTCA-3’；P450arom(314 bp)上游引物5’-CAGCGGTCTCCCTTGATA-3’，下游引物5’-TCTTCTCGGCATTTCTCC-3’； GAPDH(580 bp)上游引物5’-GCACCGTCAAGGCT GAGAAC-3’， 下游引物5’-TGGTGAAGACGCCAGT GGA-3’。所用引物均由北京全式金生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s(P450arom為54 ℃)，72 ℃ 2 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸6 min。陰性對照組均采用去RNase水代替cDNA。PCR產(chǎn)物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，使用D-140圖像分析紀(jì)錄系統(tǒng)、Quantity One軟件進行半定量分析，以目的基因與內(nèi)參GAPDH積分吸光度的比值作為目的基因的相對表達量。

1.3.4培養(yǎng)液中E2激素測定及T轉(zhuǎn)化率計算羅格列酮干預(yù)24 h后，各樣本取1 mL培養(yǎng)液，按照ELISA試劑盒(聯(lián)世生物科技公司，中國)說明書測定E2值。T轉(zhuǎn)化率=E2測定值/加入雄烯二酮值。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 15.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較各組卵巢顆粒細胞PPARγ、P450arom mRNA及T轉(zhuǎn)化率的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗；采用Spearman相關(guān)分析確定PPARγ、P450arom mRNA和T轉(zhuǎn)化率的關(guān)系。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.13組患者一般資料及血清性激素水平比較見表1。

表1　3組患者一般資料及血清性激素水平比較(n=10)

*:與對照組比較，P<0.05。

2.23組患者卵巢顆粒細胞中PPARγ與 P450arom mRNA表達水平比較結(jié)果見圖1、2和表2、3。由表2、3可知，未加羅格列酮時，與對照組相比，HA-PCOS組和NA-PCOS組患者卵巢顆粒細胞中PPARγ mRNA高表達、P450arom mRNA低表達。加入羅格列酮后，3組卵巢顆粒細胞中均出現(xiàn)PPARγ mRNA高表達、P450arom mRNA低表達，且在HA-PCOS組表現(xiàn)最明顯。

圖1　不同濃度羅格列酮干預(yù)后3組患者卵巢顆粒細胞PPARγ mRNA RT-PCR結(jié)果

1~3：對照組；4~6：NA-PCOS組；7~9：HA-PCOS組；1、4、7：加入0 nmol/L 羅格列酮；2、5、8：加入1 nmol/L羅格列酮；3、6、9：加入10 nmol/L羅格列酮。

圖2不同濃度羅格列酮干預(yù)后3組患者卵巢顆粒細胞P450arom mRNA RT-PCR結(jié)果

1~3：對照組；4~6：NA-PCOS組；7~9：HA-PCOS組；1、4、7：加入0 nmol/L 羅格列酮；2、5、8：加入1 nmol/L羅格列酮；3、6、9：加入10 nmol/L羅格列酮。

表2　3組患者卵巢顆粒

*:3組間兩兩比較，P均<0.05。

表3　3組患者卵巢顆粒

*:3組間兩兩比較，P均<0.05。

2.33組患者卵巢顆粒細胞 T 轉(zhuǎn)化率下降幅度的比較見表4。

表4　3組患者卵巢顆粒細胞 T 轉(zhuǎn)化率下降幅度

A：添加0 nmol/L羅格列酮與1 nmol/L羅格列酮時T轉(zhuǎn)化率下降幅度；B：添加1 nmol/L羅格列酮與10 nmol/L羅格列酮時T轉(zhuǎn)化率下降幅度；C：添加0 nmol/L羅格列酮與10 nmol/L羅格列酮 時T轉(zhuǎn)化率下降幅度;*:與對照組相比,P<0.05。

2.43組患者卵巢顆粒細胞中P450arom、PPARγ mRNA的表達和T轉(zhuǎn)化率的相關(guān)性分析見表5。

表5　3組患者卵巢顆粒細胞中PPARγ、

*：P<0.05；A：T轉(zhuǎn)化率與PPARγ mRNA；B：T轉(zhuǎn)化率與P450arom mRNA。

3討論

高雄激素血癥可導(dǎo)致PCOS患者排卵障礙，降低育齡期婦女妊娠率。目前，探索高雄激素血癥的發(fā)病機制及臨床治療仍是PCOS相關(guān)研究的熱點。有研究[8]顯示女性P450arom基因多態(tài)性和PCOS發(fā)病相關(guān)。但PCOS患者體內(nèi)P450arom表達水平尚有爭議，部分學(xué)者認(rèn)為PCOS患者高雄激素狀態(tài)是因為P450arom底物發(fā)生了變化，P450arom活性仍正常甚至亢進，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PCOS患者體內(nèi)P450arom表達或活性降低[9-10]。該研究結(jié)果顯示伴或不伴高雄激素血癥PCOS患者的卵巢顆粒細胞中P450arom mRNA水平均低于對照組，與大部分學(xué)者的研究結(jié)果相同，此外，作者還發(fā)現(xiàn)HA-PCOS組P450arom mRNA的表達低于NA-PCOS組，提示P450arom mRNA低表達可能參與PCOS高雄激素血癥的發(fā)生。

既往研究[5]多認(rèn)為PCOS患者卵巢顆粒細胞中PPARγ呈高表達，但2013年胡衛(wèi)紅等[7]研究發(fā)現(xiàn)

PCOS患者卵巢顆粒細胞中PPARγ mRNA含量較低，但其組間樣本量差異較大可能影響其結(jié)果。該研究結(jié)果顯示PCOS患者卵巢顆粒細胞中PPARγ mRNA表達高于對照組，并且PPARγ mRNA在HA-PCOS組內(nèi)表達更高，提示它與PCOS高雄激素血癥的發(fā)生相關(guān)。

Faut等[11]學(xué)者認(rèn)為PPARγ與竇卵泡凋亡相關(guān)，通過影響卵泡生長影響妊娠結(jié)局;而P450arom的芳香化作用發(fā)生異常會導(dǎo)致卵泡中的T/E2升高影響卵泡發(fā)育[12]。有學(xué)者[13-14]行聚類分析發(fā)現(xiàn)PPARγ合成異常與PCOS和高雄激素血癥發(fā)生相關(guān)。作者所在的課題組前期研究(未發(fā)表)表明，PCOS患者卵巢顆粒細胞PPARγ mRNA表達水平高于對照組， 且與卵泡液雄激素水平呈正相關(guān)，與P450arom呈負(fù)相關(guān)。該研究結(jié)果顯示: HA-PCOS組和NA-PCOS組卵巢顆粒細胞P450arom mRNA的表達和T轉(zhuǎn)化率存在差異；PPARγ上調(diào)后，HA-PCOS組P450arom mRNA表達降低和T轉(zhuǎn)化效應(yīng)下降變化更明顯。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，加入10 nmol/L羅格列酮的HA-PCOS組卵巢顆粒細胞中PPARγ mRNA的表達水平和T轉(zhuǎn)化率負(fù)相關(guān)，P450arom mRNA的表達水平和T轉(zhuǎn)化率正相關(guān)，提示PPARγ可能通過抑制P450arom參與PCOS高雄激素血癥的發(fā)生。該研究為探索PCOS高雄激素血癥的發(fā)生機制奠定了基礎(chǔ)，并為其治療提供了理論依據(jù)。

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*衛(wèi)生部醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究課題W2012FZ065

Effects of up-regulation of PPARγ on expression of P450arom mRNA and T transforming effects in ovarian granulosa cells from patients with PCOS

WANGBijun,GUOYihong,ZHANGHuihong,LIJing,YANGXinhong

ReproductiveMedicineCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordspolycystic ovarian syndrome;ovarian granulosa cell;peroxisome proliferator activated receptor γ;cytochrome P450 aromatase;T transforming effect

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.016

中圖分類號R711.6

通信作者#，女，1968年1月生，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：生殖醫(yī)學(xué)，E-mail:13613863710@163.com