?

脊髓背角P2X4、P2Y12和P2Y13受體參與AM1241對CCI大鼠的鎮(zhèn)痛效應

田虹1，黃婷婷2，劉正律2，陳遠壽1，劉曉紅1，曾俊偉1

(1.遵義醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院生理學教研室, 貴州 遵義563099；2.貴州省麻醉與器官功能保護重點實驗室,貴州 遵義563099)

[摘要]目的 觀察鞘內(nèi)注射大麻素CB2受體激動劑AM1241對慢性坐骨神經(jīng)結扎(CCI)大鼠機械痛閾、脊髓背角P2X4、P2Y12和P2Y13受體表達變化的影響。方法 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠40只隨機分為5組(n=8): 假手術組、CCI組(坐骨神經(jīng)結扎+ 鞘內(nèi)注射0.005%DMSO生理鹽水)、1 pmol/LAM1241處理組(坐骨神經(jīng)結扎+鞘內(nèi)注射AM1241 1 pmol/L)、10 pmol/LAM1241處理組(坐骨神經(jīng)結扎+鞘內(nèi)注射AM1241 10 pmol/L)、100 pmol/LAM1241處理組(坐骨神經(jīng)結扎+鞘內(nèi)注射AM1241 100 pmol/L)。CCI組及不同濃度AM1241處理組大鼠均于鞘內(nèi)置管7 d之后行坐骨神經(jīng)結扎，連續(xù)14 d 鞘內(nèi)注射，每天2次；分別在術前1 d，術后第1、3、5、7、10、14天注射1 h后測定機械痛閾(MWT)，分別在術后第7，14天免疫印跡法(western blot)觀察脊髓背角P2X4、P2Y12和P2Y13受體表達變化。結果 ①CCI組術后第1、3、5、7、10、14天MWT顯著低于假手術組(P<0.05)，10 pmol/L AM1241和100 pmol/L AM1241 處理組術后第1、3、5、7天MWT明顯高于CCI組(P<0.01)；但10 pmol/L AM1241處理組術后第10、14天MWT與CCI組相比無明顯差異(P>0.05)；100 pmol/L AM1241 處理組術后第10、14天MWT仍高于CCI組(P<0.05)；②與假手術組相比，CCI組術后第7、14天脊髓背角P2X4、P2Y12和P2Y13受體表達顯著上調(P<0.01)；與CCI組相比，100 mol/L AM1241處理組在術后第7天抑制脊髓背角P2Y12和P2Y13受體表達(P<0.05)，在術后第14天抑制背角P2X4受體表達(P<0.05)。結論 大麻素CB2受體激動劑AM1241的鎮(zhèn)痛效應可能與抑制脊髓背角小膠質細胞P2X4、P2Y12和P2Y13受體表達有關。

[關鍵詞]神經(jīng)病理性疼痛；CB2受體；小膠質細胞

近年研究表明，大麻素CB2(Cannabinoid receptor 2)受體屬于視紫紅質G蛋白耦聯(lián)受體家族，高選擇性表達在脊髓背角小膠質細胞，參與了大麻類物質的鎮(zhèn)痛效應[1-2]。CB2受體可能和許多G蛋白以及體內(nèi)其他的效應系統(tǒng)耦聯(lián)，從而參與調節(jié)實驗動物足底注射致炎物質造成的炎性痛和外周神經(jīng)神經(jīng)損傷造成的病理性疼痛。在脊髓背角小膠質細胞還存在P2X4、P2Y12和P2Y13等多種嘌呤受體，有研究提示，鞘內(nèi)分別注射P2X4受體反義核酸、P2Y12受體拮抗劑、P2Y13受體拮抗劑均可以減輕坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型大鼠的熱痛敏和機械痛敏[3]。P2X4受體是一種允許Na+、Ca2+內(nèi)流的陽離子通道，P2Y12和P2Y13均屬于視紫紅質G蛋白耦聯(lián)受體家族。然而，當傷害性信息到達脊髓背角時，CB2受體活化是否通過調節(jié)P2X4、P2Y12和P2Y13受體表達活動而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應，目前尚不清楚。因此，本研究觀察鞘內(nèi)注射CB2受體激動劑AM1241對慢性坐骨神經(jīng)結扎(The chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI)大鼠機械痛閾及脊髓背角小膠質細胞P2X4、P2Y12、P2Y13受體表達變化的影響，探討CB2受體在神經(jīng)病理性疼痛的作用和機制。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器AM1241購自Sigma，溶于DMSO中，使用前以生理鹽水稀釋至1、10、100 pmol/L；山羊P2Y12受體一抗和山羊P2Y13受體一抗購自abcam；小鼠Beta-actin單克隆抗體購自novus，抗羊HRP-IgG和抗小鼠HRP-IgG購自Santa Cruz，PE-10導管購自美國健康醫(yī)療儀器國際公司；vonFrey纖維絲購自中國醫(yī)學科學院生物工程研究所。電泳儀、電泳槽、TRANS-BLOT SD半干電轉移系統(tǒng)均為美國BioRad產(chǎn)品。

1.2實驗動物分組健康成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心[許可證號SCXK(渝) 2007-0005]，體質量200～250g。大鼠40只隨機分為5組(n=8): 假手術組(sham)、CCI 組(慢性坐骨神經(jīng)結扎+ 鞘內(nèi)注射0.005%DMSO生理鹽水)、1pmol/LAM1241處理組(坐骨神經(jīng)結扎+鞘內(nèi)注射AM1241 1 pmol/L)、10 pmol/LAM1241處理組(坐骨神經(jīng)結扎+鞘內(nèi)注射AM1241 10 pmol/L)、100 pmol/LAM1241處理組(坐骨神經(jīng)結扎+鞘內(nèi)注射AM1241 100 pmol/L)。假手術組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)不進行結扎。其余大鼠在鞘內(nèi)置管7 d后進行坐骨神經(jīng)結扎，術后分別給予0.005%DMSO生理鹽水或不同濃度AM1241，連續(xù)14 d鞘內(nèi)注射，每天2次(早晨9∶00，下午18∶00)。

1.3鞘內(nèi)置管與CCI模型制作參照文獻[4]，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉3 mL/kg，麻醉，俯臥位, 于腰3～4間隙作長約 3 cm 的皮膚縱切口，切開該處背棘肌的后筋膜, 鈍性分離腰4棘突兩側肌肉，切除腰4棘突和鄰近椎板, 暴露腰3、腰4棘突間隙，以25G針穿破黃韌帶及硬脊膜，見清亮的腦脊液溢出。在破口處插入PE-10導管 2 cm (導管全長15 cm, 容量10 μL)，18G硬膜外穿刺針在大鼠皮下穿一隧道，導管的另一端送至頸背部，外露2 cm固定，外口用打火機封閉，防止腦脊液外溢。術后肌注青霉素8萬單位，連續(xù)3 d，以防感染。大鼠清醒后出現(xiàn)雙側下肢癱瘓，則說明脊髓損傷，不納入實驗；術后第2天，經(jīng)PE-10導管注入鹽酸利多卡因(2%，20 μL)，大鼠雙后足癱軟，30 min左右恢復，即為鞘內(nèi)置管成功，進行下一步實驗。

大鼠鞘內(nèi)置管7 d后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉3 mL/kg，麻醉后俯臥位固定；在股骨外側上方縱向切開皮膚，順肌紋鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，用5.0鉻制羊腸線輕度結扎左坐骨神經(jīng)干，共結扎4道，結扎間距約為1 mm；坐骨神經(jīng)結扎的輕重程度判斷標準為：①神經(jīng)微凹陷；②結扎后線環(huán)均可移動；③結扎瞬間可見小腿肌肉輕顫。CCI術后出現(xiàn)運動異常如拖足行走或左下肢無法抬高等均剔除實驗。術后大鼠3 d內(nèi)肌注青霉素抗感染。

參考文獻1.4機械痛閾測定[5]，各組大鼠分別于術前1 d、術后第1、3、5、7、10、14天測定大鼠機械痛閾：大鼠置于底部為金屬網(wǎng)的有機玻璃箱內(nèi)，適應環(huán)境至少30 min之后，用Von-Frey絲垂直刺激大鼠后肢足底5 s，刺激力量以觸絲彎曲為準。采用up-down法測定機械痛閾，選擇8根Von-Frey絲，標度分別為0.6、1、2、4、6、8、10和15g，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為則為陽性反應，記錄時間。測定首先從2g開始，當該力度的刺激不能引起抬足或舔足行為，則給予大一級力度的刺激; 如出現(xiàn)抬足或舔足行為則給予小一級力度的刺激，直至出現(xiàn)第1次陽性反應和陰性反應的騎跨,連續(xù)測定4次，平均值為閾值。最大力度為 15 g，每次刺激間隔30s。

1.5免疫印跡法在大鼠CCI術后第7、14天，乙醚麻醉處死大鼠，取CCI損傷側腰段脊髓背角(L4-6)。RIPA法裂解組織，提取總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。每孔上樣量50 μg，SDS-PAGE 電泳，半干轉儀將凝膠中的蛋白轉移至 PVDF 膜上，加入山羊抗P2X4、P2Y12、P2Y13受體一抗(1∶500)，加入小鼠抗β-actin單抗(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜。PBS 洗膜，加入抗羊HRP-IgG(1∶2 500)和抗小鼠HRP-IgG(1∶2500)，室溫反應1 h。加入化學發(fā)光劑后，X射線曝光顯影。掃描分析軟件系統(tǒng)(LabworksTMAnalysis Software) 分析數(shù)據(jù)，以每個條帶的積分光密度(IOD) 值與相對應的β-actin的IOD值之比表示蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1鞘內(nèi)注射AM1241 MWT的變化與假手術組相比，CCI組大鼠MWT在術后第1天迅速降低，并在14 d內(nèi)持續(xù)處于低水平(P<0.01)；與CCI組相比，1 pmol/L AM1241處理組大鼠MWT變化不明顯(P>0.05).10 pmol/L AM1241處理組MWT在術后第3、5、7天明顯升高(P<0.05)；100pmol/L AM1241處理組MWT在術后第3、5、7 d升高更為明顯(P<0.05)。在術后第10、14天，100 pmol/LAM1241處理組大鼠MWT升高減緩但仍高于CCI組(P<0.05，見圖1)。機械痛測定說明AM1241以劑量依賴的關系發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應，在CCI早期鎮(zhèn)痛效應更為明顯。

*P<0. 05, **P<0. 01，與sham相比; +P<0. 05, ++P<0. 01與CCI相比。圖1　鞘內(nèi)注射AM1241后MWT的變化

2.2鞘內(nèi)注射AM1241對CCI大鼠脊髓背角P2X4受體表達的影響在痛閾測定中，100 pmol/L AM1241表現(xiàn)了較好的鎮(zhèn)痛效應，因此，western blot實驗中，觀察100 pmol/L AM1241鞘內(nèi)注射后脊髓背角P2X4、P2Y12和P2Y13受體表達的變化。與假手術組相比，CCI組術后第7、14天，脊髓背角P2X4受體表達水平增強(P<0.01)；與CCI組相比，100 pmol/L AM1241處理組術后第7天時P2X4受體表達變化不明顯(P>0.05)，在術后14 d時P2X4受體表達顯著下調(P<0.05，見圖2)。

A:Western blot檢測P2X4受體蛋白表達;B: Western blot P2X4受體表達直方圖分析。++P<0.01,與sham組比較; *P<0.05,與CCI組相比。圖2　各組大鼠脊髓背角P2X4受體表達

2.3鞘內(nèi)注射AM1241對CCI大鼠脊髓背角P2Y12和P2Y13受體表達的影響與假手術組相比，CCI組術后第7、14天脊髓背角P2Y12和P2Y13受體表達均出現(xiàn)明顯上調(P<0.01)；與CCI組相比，100 pmol/L AM1241處理組術后第7天時P2Y12和P2Y13受體表達明顯下調(P<0.01,P<0.05)；術后14 d P2Y12和P2Y13受體表達無明顯差異(P>0.05，見圖3、圖4)。

A:Western blot檢測P2Y12受體蛋白表達;B:Western blot P2Y12受體表達直方圖分析。 ++P<0.01,與sham組比較; **P<0.01與CCI組相比。圖3　各組大鼠脊髓背角P2Y12受體表達

A:Western blot檢測P2Y13受體蛋白表達;B:Western blot P2Y13受體表達直方圖分析。++P<0.01,與sham組比較; *P<0.05,與CCI組相比。圖4　各組大鼠脊髓背角P2Y13受體表達

3討論

脊髓作為疼痛中樞敏化的重要部位，對慢性疼痛的形成發(fā)揮重要作用，這其中存在多種機制的參與，特別是CB2的作用。以往研究報道，CB2受體激動劑MDA7、NESS400和JWH-133對于化療藥物紫杉酚造成的大鼠痛覺過敏以及脊神經(jīng)結扎的小鼠痛覺過敏，具有良好的鎮(zhèn)痛效應[6]。此前，有文獻研究證明，鞘內(nèi)注射AM1241并不能影響正常大鼠的機械痛閾或熱痛閾[7]。在本實驗結果顯示，大麻素CB2受體激動劑AM1241顯著減輕CCI大鼠的機械痛敏癥狀，表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛效果。有關CB2R激活后發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機理，一般認為是抑制了痛覺感受神經(jīng)元的敏感性和興奮性，而且也抑制了背角膠質細胞的激活和隨后的一些神經(jīng)活性物質釋放，從而使痛覺過敏減輕[8-9]。在本實驗中，大麻素CB2受體激動劑AM1241在1～7 d以劑量依賴的方式顯著減輕CCI大鼠的機械痛敏癥狀，表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛效果；在7d之后，鎮(zhèn)痛效應不佳。根據(jù)文獻報道，在CCI大鼠，小膠質細胞急劇激活主要在3～7 d，而且CB2受體也主要存在于小膠質細胞[10]。由此推測，AM1241發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應的靶點可能是背角小膠質細胞。

在坐骨神經(jīng)結扎以及施用gp120的神經(jīng)痛大鼠，給予CB2受體興奮劑AM1710可以抑制脊髓背角小膠質細胞激活和P38MAPK磷酸化，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[11]；本實驗中，鞘內(nèi)注射AM1241對于CCI大鼠7d的P2Y12和P2Y13受體表達表現(xiàn)了明顯的抑制作用。大鼠的P2Y12與P2Y13受體相比，二者氨基酸序列一致性達到49%[12]，然而，Wilkerson 等人觀察到，背角小膠質細胞P38MAPK磷酸化可以促進P2Y13受體基因表達，但對于P2Y12受體基因表達沒有明顯作用，可見影響這兩種受體表達的因素并不一樣[13]。P38MAPK磷酸化減弱很可能是CB2受體激活后抑制P2Y13受體表達的重要機制，但并不是抑制P2Y12受體表達的機制。由于CB2受體激活，導致了CCI痛敏狀態(tài)下小膠質細胞P38MAPK磷酸化減弱，造成了P2Y13受體基因表達下降，蛋白合成減少。以往實驗報道，CB2受體活化后可以與Gi/o藕聯(lián)，可以抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，胞內(nèi)cAMP濃度降低，PKA活性下降；此外，有報道，CB2 受體激活可以增強LPS/IFN-γ誘導的小鼠小膠質細胞中細胞外信號調節(jié)激酶 1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)和氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)的激活[14]。在本實驗中，CB2受體活化后哪些下游信號分子或蛋白激酶磷酸化有可能抑制P2Y12受體基因表達或蛋白合成，尚有待探索。在CCI術后7～14 d，星形膠質細胞或神經(jīng)元釋放的神經(jīng)活性物質作用于小膠質細胞，也可以促進P2Y12和P2Y13受體表達上調，對此AM1241已經(jīng)不能抑制。另外也提示，P38MAPK磷酸化并非影響P2Y13受體合成或表達的唯一因素。

P2X4受體是一種允許Na+、Ca2+內(nèi)流的陽離子通道。在HEK-293細胞、海馬神經(jīng)元、C8-B4小膠質細胞、肺泡Ⅱ型細胞的胞膜、溶酶體、囊泡均有表達[15]。目前認為P2X4受體高選擇性表達在脊髓背角小膠質細胞，在脊神經(jīng)結扎、坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷以及CCI大鼠均可見背角小膠質細胞P2X4受體與離子鈣接頭蛋白-1(ionized calcium binding adapter molecule 1，IBa-1)表達共定位且表達同時上調，P2X4受體激活后誘發(fā)腦源性神經(jīng)生長因子(Brain derived neurotrophic factor, BDNF)釋放，后者促進背角感覺傳遞神經(jīng)元去極化，突觸傳遞效能增加，參與中樞痛敏的形成與維持[16]。最近研究發(fā)現(xiàn)干擾素-γ以及干擾素調節(jié)因子-5(interferon regulatory factor-5, IRF5)可以促進小膠質細胞P2X4受體表達，丙戊酸可以抑制P2X4受體表達[17-18]。在本實驗中，從AM1241并不影響CCI大鼠損傷早期P2X4受體表達來看，CB2與P2X4受體之間可能不存在直接的相互作用，P38MAPK磷酸化減弱也不影響P2X4受體基因表達或蛋白合成。但CCI大鼠損傷晚期，AM1241有可能抑制一些星形膠質細胞源性的神經(jīng)活性物質刺激背角小膠質細胞P2X4受體表達的效應，所以，P2X4受體表達下調。

綜上所述，大麻素CB2受體激動劑AM1241抑制了大鼠坐骨神經(jīng)損傷造成的早期機械痛敏，其鎮(zhèn)痛機制與調節(jié)嘌呤P2Y12和P2Y13受體相關。深入探討CB2受體與P2受體相互作用及其機制，有助于我們深刻理解疼痛，為下一步研發(fā)以CB2或P2受體為靶點的新型鎮(zhèn)痛藥物提供新的思路。

[1] Racz I, Nadal X, Alferink J,et al. Crucial role of CB2 cannabinoid receptor in the regulation of central immune responses during neuropathic pain[J]. J Neurosci，2008,28(46):12125-12135.

[2] Wilkerson J L, Gentry K R, Dengler E C, et al. Immunofluorescent spectral analysis reveals the intrathecal cannabinoid agonist, AM1241, produces spinal anti-inflammatory cytokine responses in neuropathic rats exhibiting relief from allodynia[J]. Brain Behav，2012, 2(2): 155-177.

[3] Kobayashi K, Yamanaka H, Yanamoto F, et al. Multiple P2Y subtypes in spinal microglia are involved in neuropathic pain after peripheral nerve injury[J]. Glia, 2012, 60(10): 1529-1539.

[4] 李敏,肖菊平,曾俊偉,等.脊髓糖皮質激素受體在神經(jīng)病理性疼痛中的作用[J].第三軍醫(yī)大學學報,2012, 34(17) : 1719-1721.

[5] McGaraughty S, Wismer C T, Zhu C Z,et al. Effects of A-317491, a novel and selective P2X3/P2X2/3 receptor antagonist, on neuropathic, inflammatory and chemogenic nociception following intrathecal and intraplantar administration[J]. Br J Pharmacol, 2003,140(8):1381-1388.

[6] Naguib M, Xu J J, Diaz P, et al. Prevention of paclitaxel-induced neuropathy through activation of the central cannabinoid type 2 receptor system[J]. Anesth Analg, 2012, 114(5): 1104-2011.

[7] Wilkerson J L, Gentry K R, Dengler E C, et al. Immunofluorescent spectral analysis reveals the intrathecal cannabinoid agonist, AM1241, produces spinal anti-inflammatory cytokine responses in neuropathic rats exhibiting relief from allodynia[J].Brain Behav,2012, 2(2):155-177.

[8] Deng L, Guindon J, Cornett B L,et al.Chronic cannabinoid receptor 2 activation reverses paclitaxel neuropathy without tolerance or cannabinoid receptor 1-dependent withdrawal[J].Biol Psychiatry,2015，77(5):475-487.

[9] Sun Y, Zhang W, Liu Y,et al. Intrathecal injection of JWH015 attenuates remifentanil-induced postoperative hyperalgesia by inhibiting activation of spinal glia in a rat model[J].Anesth Analg,2014，118(4):841-853.

[10] Dieb W, Hafidi A. Astrocytes are involved in trigeminal dynamic mechanical allodynia: potential role of D-serine[J]. J Dent Res, 2013, 92(9): 808-813.

[11] Wilkerson J L, Gentry K R, Dengler E C, et al. Intrathecal cannabilactone CB(2)R agonist, AM1710, controls pathological pain and restores basal cytokine levels[J]. Pain, 2012, 153(5): 1091-1106.

[12] Fumagalli M, Trincavelli L, Lecca D, et al. pharmacological characterisation and distribution of the rat G-protein-coupled P2Y(13) Receptor[J]. Biochem Pharmacol, 2004, 68(1): 113-124.

[13] Kobayashi K, Yamanaka H, Yanamoto F, et al. Multiple P2Y subtypes in spinal microglia are involved in neuropathic pain after peripheral nerve injury[J]. Glia, 2012,60(10): 1529-1539.

[14] Correa F, Hernangomez M, Mestre L, et al. nandamide enhances IL-10 production in activated microglia by targeting CB (2) receptors: roles of ERK1/2, JNK, and NF-kappaB[J].Glia, 2010, 58(2):135-147

[15] Xu J, Chai H, Ehinger K,et al.Imaging P2X4 receptor subcellular distribution, trafficking, and regulation using P2X4-pHluorin[J].J Gen Physiol，2014，144(1):81-104.

[16] Beggs S, Trang T, Salter M W. P2X4R+ microglia drive neuropathic pain[J].Nat Neurosci，2012，15(8):1068-1073.

[17] Masuda T, Iwamoto S, Yoshinaga R, et al. Transcription factor IRF5 drives P2X4R+-reactive microglia gating neuropathic pain[J]. Nat Commun,2014, 5: 3771.

[18] Lu W H, Wang C Y, Chen P S, et al. Valproic acid attenuates microgliosis in injured spinal cord and purinergic P2X4receptor expression in activated microglia[J]. J Neurosci Res,2013, 91(5): 694-705.

[收稿2015-04-07;修回2015-05-28]

(編輯：譚秀榮)

基礎醫(yī)學研究

基礎醫(yī)學研究

P2X4, P2Y12, P2Y13receptors in spinal dorsal horn are involved in AM1241 - induced analgesia in rats with chronic constriction injury

TianHong1,HuangTingting2,LiuZhenglv2,ChenYuanshou1,LiuHongtao1,ZengJunwei1

(1.Department of Physiology, Zunyi Medical University， Zunyi Guizhou 563099, China；2.Guizhou Key Laboratory of Anesthesia and Organ Protection, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To investigate the effect of intrathecal injection AM1241, a selective CB2 (Cannabinoid receptor 2) receptor agonist, on mechanical withdrawl threshold (MWT) and the expression of P2X4, P2Y12and P2Y13receptors in spinal dorsal horn of rats with chronic constriction injury (CCI) of the sciatic nerve.Methods Forty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups (n=8): sham group (sham operation), CCI group (CCI+intrathecal injection of 0.005% DMSO saline solution), 1 pmol/L AM1241 group, (CCI+intrathecal injection of 1 pmol/L AM1241), 10 pmol/L AM1241 group (CCI+intrathecal injection of 10 pmol/L AM1241), 100 pmol/L AM1241 group (CCI+intrathecal injection of 100 pmol/L AM1241). Rats in CCI group and all AM1241 groups were treated with with chronic constriction injury of the sciatic nerve after 7d of intrathecal tude. The intrathecal injection was administered twice a day for 14 days. MWT were evaluated at 1, 3, 5, 7, 10 and 14d after surgery. The expression of P2X4, P2Y12and P2Y13receptors in dorsal horn was assessed by western blot at 7 and 14 post-operative days. Results 1)MWT in CCI group was significantly lower than sham group at 1, 3, 5, 7, 10 and 14d after surgery (P<0.05). MWT in 10 pmol/L AM1241 group was markedly longer than CCI group at 1, 3, 5, 7 d (P<0.01).MWT in 100 pmol/L AM1241 group was significantly longer than CCI group at 1, 3, 5, 7 d and 14d after surgery (P<0.01 at 1, 3, 5, 7 post-operative days; P<0.05 at 10, 14 post-operative days). 2)Compared with the sham group,the P2X4, P2Y12and P2Y13receptors expression in CCI group were markedly enhanced on 7d and 14d after surgery (P<0.01). Compare with the CCI group, the expression of P2Y12and P2Y13in 100 pmol/L AM1241 group was suppressed on 7d (P<0.01), the expression of P2X4in 100 pmol/L AM1241 group was suppressed on 14d after surgery (P<0.01).Conclusion Analgesia effect of cannabinoid CB2receptor agonist AM1241 may be related to the inhibition of the expression of P2X4, P2Y12and P2Y13receptors in the spinal dorsal horn microglial cells.

[Key words]neuropathic pain；CB2 receptor；microglial

[文獻標志碼][中圖法分類號] R347.7 A

[文章編號]1000-2715(2015)03-0230-05

[基金項目]2012教育部科學技術重點項目(NO:2012125); 2010年貴州省科技廳資助項目(NO:黔科合J字(2010)2264) ; 遵義醫(yī)學院重點學科項目(NO:XZXK-20120702); 遵義醫(yī)學院大學生創(chuàng)新訓練重點項目(NO：院發(fā)[2014]5807) 。[通信作者]曾俊偉，女， 博士, 副教授，研究方向：痛覺的神經(jīng)化學機制，E-mail:junweizeng@sohu.com。