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淫羊藿素對(duì)淀粉樣蛋白25-35片段所致大鼠膽堿能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用

馮飛，陳乾，宋斌，熊德慶，羅勇

(遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義563003)

[摘要]目的 探索淫羊藿素(ICT)對(duì)淀粉樣蛋白25-35片段(Aβ25-35)所致膽堿能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。方法 40只18月齡SD大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組、ICT低劑量組(20 mg/kg)、ICT中劑量組(40 mg/kg)、ICT高劑量組(80 mg/kg)，模型及ICT治療組應(yīng)用ICT灌胃預(yù)處理3 d后，在大鼠鼠腦海馬內(nèi)注入Aβ25-35造模，ICT繼續(xù)灌胃2周后，水迷宮觀察各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力， ELISA檢測(cè)大鼠海馬內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AchE)和膽堿乙?；?ChAT)的含量。結(jié)果 模型組大鼠較對(duì)照組大鼠出現(xiàn)明顯學(xué)習(xí)記憶功能減退，且海馬組織中AchE和ChAT含量較對(duì)照組明顯下降。然而，ICT各劑量治療組較模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能減退明顯改善，且AchE和ChAT含量顯著增加。結(jié)論 ICT可通過(guò)改善腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)功能減輕Aβ25-35所致的大鼠學(xué)習(xí)記憶功能減退。

[關(guān)鍵詞]阿爾茨海默??； 淫羊藿素；膽堿乙?；福荒憠A酯酶

癡呆主要表現(xiàn)為獲得性高級(jí)功能的全面障礙，具有發(fā)病率高、致殘率高、病死率高等特點(diǎn)。其中，阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是老年期癡呆的最常見(jiàn)類(lèi)型。大腦內(nèi)乙酰膽堿系統(tǒng)對(duì)于記憶學(xué)習(xí)功能的形成和維持至關(guān)重要，現(xiàn)臨床治療癡呆仍多選用乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AchE)抑制劑，如他克林、多奈哌齊等。但上述藥物均只能改善癥狀或延緩疾病進(jìn)程，且價(jià)格昂貴，不良反應(yīng)多，臨床應(yīng)用受限。因此，繼續(xù)探索新的AD治療藥物具有重要意義。淫羊藿素(icartin，ICT)和淫羊藿苷均是淫羊藿中提取出的有效成分，屬于黃酮類(lèi)化合物。我們前期研究證實(shí)淫羊藿苷對(duì)多種AD模型大鼠具有防治作用[1-2]。ICT是淫羊藿苷在機(jī)體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物之一[3]，分子結(jié)構(gòu)明顯小于淫羊藿苷，含多酚羥基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有清除自由基、抗炎、免疫抑制、延緩衰老及神經(jīng)保護(hù)等作用[4-6]。但I(xiàn)CT是否可改善淀粉樣蛋白所致的大鼠學(xué)習(xí)記憶減退及對(duì)大鼠腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)有何影響尚不清楚。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD 大鼠，質(zhì)量(200±20) g，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)提供[許可證號(hào): scxk (渝) 2012-0005]。顆粒飼料飼養(yǎng)，光照時(shí)間12/12 h,室溫22～23 ℃。ICT購(gòu)買(mǎi)于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，用HPLC 法檢測(cè)純度為98.3 %。用蒸餾水配置成不同濃度備用。淀粉樣蛋白25～35片段(25～35 fragment of beta-amyloid, Aβ25-35)購(gòu)至上海強(qiáng)耀生物科技有限公司，用無(wú)菌生理鹽水(normal saline, NS)稀釋成5 g/L，37 ℃孵育1周，使其變?yōu)榫奂瘧B(tài)的Aβ25-35。膽堿乙?；?cholineacetylase, ChAT)、AchE的 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海齊一生物科技有限公司。江灣Ⅱ型腦立體定位儀：上海第二精密儀器廠產(chǎn)品。Morris水迷宮: 成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品。

1.2動(dòng)物分組及造模將40只18月齡SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、ICT低劑量組(20 mg/kg)ICT中劑量組(40 mg/kg)和ICT高劑量組(80 mg/kg)，每組8只。模型和ICT各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/100 g)，然后固定于大鼠腦立體定位儀上，向右側(cè)海馬區(qū)進(jìn)針，坐標(biāo)為：AP-4 mm(前囟后)，MR-2.8 mm(中線右側(cè))，H-3 mm(自腦膜起的深度)。定位后鉆開(kāi)顱骨，微量注射器垂直進(jìn)針3 mm，以0.2 uL/min的速度緩慢注入2 μL Aβ25-35(10μg)，留針5 min，對(duì)照組在相應(yīng)腦區(qū)注入等體積生理鹽水。ICT各組于造模前3 d開(kāi)始灌胃，持續(xù)至造模后2周[7]，正常組和模型組灌胃等體積蒸餾水，給藥時(shí)間固定在上午9～ 11時(shí)，每日1次。

參考文獻(xiàn)1.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)予以定向航行實(shí)驗(yàn)[8]，各組小鼠制模后給藥第9 ～13天進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，每天上下午各1次，取2次平均值為每天的成績(jī)以評(píng)價(jià)其學(xué)習(xí)和記憶能力。第14天給藥1 h后采用Morris水迷宮進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)大鼠找到安全島的時(shí)間為逃避潛伏期，游泳路徑長(zhǎng)度為搜索距離。

1.4ELISA檢測(cè)大鼠海馬區(qū)ACh E和ChAT的含量第14天Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將各組大鼠用10%水合氯醛( 0.3 mL /100 g) 腹腔注射麻醉，然后迅速取出腦組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗表面血液，用濾紙吸干，去除軟腦膜和血管，分離出海馬組織，加生理鹽水制成10% 的組織勻漿，以3 500 r/min的速度離心10 min，取上清液，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)用ELISA 法測(cè)定AchE和ChAT 含量。

2結(jié)果

2.1ICT對(duì)Aβ25-35所致大鼠學(xué)習(xí)記憶減退的影響Aβ25-35造模后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)記憶功能下降。經(jīng)ICT(20～80 mg)治療后，大鼠在治療后的逃避潛伏期(見(jiàn)表1)及搜索距離(見(jiàn)表2)較模型大鼠明顯縮短，提示ICT可減輕Aβ25-35所致大鼠學(xué)習(xí)記憶減退。

組別逃避潛伏期(s)d10d11d12d13d14對(duì)照組21.6±10.217.5±8.014.4±6.312.6±3.113.6±4.2模型組44.6±27.0*34.7±20.6*27.9±10.6*22.9±8.3*19.2±5.1*ICT20mg/kg38.5±20.427.7±12.618.3±7.914.1±5.3#14.3±3.9#ICT40mg/kg39.2±21.529.3±13.716.8±6.4#14.5±6.1#13.8±4.3#ICT80mg/kg32.5±18.925.8±13.316.4±6.0#11.9±4.2#13.4±3.7#

與對(duì)照組相比 *P< 0.05，與模型組相比 #P< 0.05。

組別搜索距離(m)d10d11d12d13d14對(duì)照組13.1±7.112.6±7.210.7±4.58.6±3.49.4±3.1模型組36.8±22.8*32.8±16.6*25.0±8.8*17.9±7.5*15.3±5.6*ICT20mg/kg33.9±20.927.7±12.418.0±7.612.4±5.110.9±4.5#ICT40mg/kg33.5±18.226.4±14.116.0±6.4#10.6±4.8#9.6±4.1#ICT80mg/kg28.8±16.822.1±8.714.8±5.7#7.6±4.1#8.8±3.3#

與對(duì)照組相比， *P< 0.05；與模型組相比， #P< 0.05。

2.2ICT對(duì)癡呆模型大鼠海馬組織中AchE和ChAT含量的影響Aβ25-35造模后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬組織中AchE和ChAT含量明顯下降。ICT各劑量治療組大鼠灌胃2周后，與模型組相比，AchE和ChAT含量均顯著增加(見(jiàn)表3)。

組別AchE(nmol/L)ChAT(nmol/L)對(duì)照組30.1±4.279.1±16.2模型組26.5±4.9*60.5±12.7*ICT(20mg/kg)30.8±6.2#72.2±19.0#ICT(40mg/kg)34.7±4.0##79.9±9.7##ICT(80mg/kg)35.0±3.6##81.7±8.7##

與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3討論

全球范圍內(nèi)大約有3500萬(wàn)人患有癡呆，其中大部分是AD，預(yù)計(jì)到2030年這個(gè)數(shù)目將達(dá)到6500萬(wàn)人[9]，但目前尚缺乏有效的對(duì)因治療藥物。理想的癡呆動(dòng)物模型是篩選抗癡呆藥物的重要前提，常用的癡呆模型仍主要模擬癡呆特征性的行為學(xué)、組織形態(tài)學(xué)和生化指標(biāo)改變。其中，單側(cè)海馬內(nèi)注射一種神經(jīng)毒性物質(zhì)Aβ能誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶能力減退，可復(fù)制出癡呆的行為學(xué)改變和部分病理生理學(xué)特征，該模型常用于篩選抗癡呆藥物[7]，故本實(shí)驗(yàn)采用單側(cè)海馬內(nèi)注射Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)毒性模型。結(jié)果表明，模型組大鼠在水迷宮中的逃避潛伏期及搜索距離明顯延長(zhǎng)，海馬組織中ChAT及AchE含量顯著下降，表明造模大鼠存在明顯學(xué)習(xí)記憶能力減退和膽堿能神經(jīng)功能的降低，與既往研究的結(jié)果一致[7]，可用于藥物篩選。

學(xué)習(xí)記憶與中樞膽堿能系統(tǒng)有著密切的關(guān)系，中樞膽堿能系統(tǒng)可通過(guò)隔區(qū)-海馬-邊緣葉和大腦皮質(zhì)兩條通路特異性地調(diào)節(jié)第一級(jí)記憶轉(zhuǎn)入第二級(jí)記憶的過(guò)程。因此，中樞膽堿能神經(jīng)元是構(gòu)成學(xué)習(xí)記憶的重要生物學(xué)基礎(chǔ)。腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元退變以及乙酰膽堿的合成、儲(chǔ)存、釋放減少被認(rèn)為是造成癡呆最重要的病理因素之一。ChAT可催化乙酰輔酶A和膽堿生成乙酰膽堿，是乙酰膽堿在腦內(nèi)合成的關(guān)鍵酶；AchE則是乙酰膽堿水解的限速酶，可催化乙酰膽堿分解成膽堿和乙酸，ChAT和AchE共同維持乙酰膽堿的動(dòng)態(tài)平衡。由于乙酰膽堿極不穩(wěn)定，容易水解，很難準(zhǔn)確測(cè)定其含量。因此，在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)測(cè)定ChAT和AchE間接反映腦內(nèi)乙酰膽堿水平[10]。

本研究模型組大鼠海馬區(qū)內(nèi)注射Aβ25-3514 d后，海馬組織中ChAT及AchE含量較對(duì)照組明顯下降，同時(shí)伴有逃避潛伏時(shí)間和搜索距離的明顯延長(zhǎng)，表明大鼠學(xué)習(xí)記憶功能受到損害。ICT治療后海馬組織中ChAT及AchE含量較模型組明顯增加，且同時(shí)改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提示ICT可能通過(guò)增加腦內(nèi)乙酰膽堿水平，產(chǎn)生抗Aβ25-35神經(jīng)毒性作用。ICT抗Aβ25-35神經(jīng)毒性作用的確切機(jī)制有待進(jìn)一步求證。

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[收稿2015-04-08;修回2015-05-11]

(編輯：譚秀榮)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

Protective effects of icaritin on intracerebral cholinergic neuron damaged by 25-35 fragment of beta-amyloid in rats

FengFei，ChenQian，SongBin，XiongDeqing，LuoYong

(Department of Neurology, The Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563003，China)

[Abstract]Objective To explore the protective effect of Icaritin (ICT) on intracerebral cholinergic neuron damaged by 25-35 fragment of beta-amyloid.Methods 40 SD rats (12 months) were randomly divided into control group, model group, ICT low dose group (20 mg/kg), ICT middle dose group (40 mg/kg) and ICT high dose group (80 mg/kg). The model group and ICT treatment groups were injected with A beta25-35in hippocampal area following ICT pretreatment of 3 days, and to measure the AChE and ChAT content through ELISA after 2 weeks of ICT intragastric administration.Results The rats in model group existed learning and memory dysfunction and the content of AChE and ChAT in the hippocampus of model group was significantly decreased than control group. Compared with model group, the learning and memory dysfunction was obviously improved and the content of AChE and ChAT in ICT treatment groups was increased significantly.Conclusion ICT can improve the learning and memory ability through protecting intracerebral cholinergic neuron function from damage caused by A beta in rats.

[Key words]alzheimer’s disease;icaritin;AchE;ChAT

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中圖法分類(lèi)號(hào)]R592A

[文章編號(hào)]1000-2715(2015)03-0248-03

[通信作者]羅勇，男，主任醫(yī)師，碩士，研究方向：神經(jīng)病學(xué)研究，E-mail:luoyongtt@163.com。

[基金項(xiàng)目]貴州省遵義市匯川區(qū)科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO:遵匯科合 [2014]16)；遵義市聯(lián)合科學(xué)技術(shù)資助項(xiàng)目(NO:遵義市科合社字[2014]27)。