?

苦參對銅綠假單胞菌生物膜干預作用的體外研究

宋鴻1，金瑛2，王明勝2

(1.遵義醫(yī)學院 微生物學教研室，貴州 遵義563099；2.遵義醫(yī)學院 醫(yī)學與科技學院，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 觀察在體外苦參水煎液對銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.a)生物膜(Biofilm，BF)的影響及其與左氧氟沙星(Levofloxacin，LFX)的協同殺菌作用。方法 試管二倍稀釋法測定藥物的最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)；將不同濃度苦參水煎液作用于P.a, 結晶紫染色法及激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)評價藥物對菌株黏附力的影響；苦參水煎液單獨或聯合LFX作用于BF，采用連續(xù)稀釋法計數及CLSM對BF進行分析。結果 苦參水煎液能抑制P.a的黏附力；與LFX聯合作用后，BF內存活菌數明顯減少(P ≤0.05)。結論 苦參水煎液能抑制P.a生物膜的形成，并可增強LFX對BF內細菌的殺菌作用。

[關鍵詞]苦參；銅綠假單胞菌；細菌生物膜

在自然界中細菌常以浮游菌、菌落及生物膜(Biofilm，BF)3種形式存在，其中BF是細菌在自然界中生長最為普遍的一種模式。據美國CDC的統計，65% 的人類細菌性感染疾病都與BF的形成有關[1]。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，P.a)是一種常見的醫(yī)院感染條件致病菌，近年來研究發(fā)現該菌感染后在機體中常以BF的形式存在，BF的形成常使得P.a逃逸宿主免疫和抗菌藥物的殺傷作用，導致臨床治療時間延長，易產生耐藥[2]。中藥是我國醫(yī)藥文化中的瑰寶，它的作用機理廣泛，細菌對其不易產生耐藥性，近年來有研究報告有些中藥能抑制和破壞細菌BF的作用[3-6]，這為臨床治療此類感染性疾病提供了一定的參考依據。本課題主要探討苦參水煎液對P.a生物膜的影響，并與喹諾酮類抗菌藥物左氧氟沙星聯用后，對P.a的BF內細菌的抗菌活性影響，為臨床中西醫(yī)結合用藥治療P.a感染提供更多的實驗依據。

1材料與方法

1.1菌株銅綠假單胞菌PAO1由遵義醫(yī)學院微生物學教研室提供。

1.2主要試劑及儀器苦參為干烤的生藥，由遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院中藥房提供?？鄥⑺逡喊次墨I方法制備[7]，生藥濃度為1g/L，4 ℃保存，有效期為2周。LFX(揚子江藥業(yè)，批號：12051431)。熒光DNA染料SYTO9/PI購自美國Molecular Probes公司。激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)，酶標儀318C(上海三科有限公司)，麥氏比濁儀(法國生物梅里埃公司)。

1.3最低抑菌濃度MIC(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)的測定參照臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的試管2倍稀釋法確定苦參水煎液及LFX的MIC值。

1.4苦參水煎液對PAO1黏附性及BF形成的影響將細菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，用比濁儀將菌液調定為0.5麥氏單位，取10 μL加入到96孔板，立即加入不同濃度苦參水煎液，藥物終濃度為1/8MIC、1/4MIC及1/2MIC，空白對照組則不加任何藥物，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。24 h后小心吸出培養(yǎng)液，用生理鹽水沖洗2次，置通風處倒置，待風干后以每孔加入0.25g/L的結晶紫染液，室溫下染色 20 min，用生理鹽水沖洗3次，倒置風干后每孔加入95%乙醇150μL，10 min后檢測其在570 nm波長處的吸光度值(A570)。同時將無菌蓋玻片置于6孔板內，將不同濃度苦參水煎液與銅綠假單胞菌共同培養(yǎng)7 d，用SYTO9 /PI孵育，在氬激光(488 nm)激發(fā)下，CLSM觀察苦參水煎液對BF形成的影響，SYT09呈綠色熒光，表征活菌，PI呈紅色熒光，表征死菌[8]。

1.5苦參水煎液和左氧氟沙星對銅綠假單胞菌成熟生物膜的影響分空白對照組、1MIC苦參組、1MIC LFX組及1MIC苦參聯合1MIC LFX組4組。將0.5麥氏單位的菌懸液稀釋50倍，加入放置有無菌蓋玻片的6孔板中，37 ℃培養(yǎng)7 d形成成熟生物膜，各組分別加入藥物作用4、8、24 h后；取出蓋玻片，用無菌生理鹽水漂洗3次以充分洗脫浮游菌，將蓋玻片放入裝有10 mL無菌生理鹽水離心管中，超聲振蕩10 min，使玻片表面的生物膜脫落到試管內形成菌懸液，再用連續(xù)稀釋法進行活菌計數，重復3次計算平均值。同時將藥物作用24 h后蓋玻片用SYTO9 /PI孵育，CLSM觀察生物膜的情況。

2結果

2.1藥物的MIC測定試驗菌株PAO1對苦參水煎液、LEV的MIC分別為64 mg/mL，10 μg/mL。

2.2苦參水煎液對銅綠假單胞菌黏附性的影響用吸光度A值表示苦參對P.a黏附性的影響，1/8MIC、1/4MIC及1/2MIC苦參組吸光度值分別為(0.274±0.149)、(0.243±0.129)和(0.178±0.095)，與空白對照組(1.512±0.034)相比較，差異有統計學意義(P≤0.01)(見圖1)。這表明1/8MIC、1/4MIC及1/2MIC苦參可抑制細菌黏附性。

苦參水煎液與P.a共同培養(yǎng)7d，經SYTO9 /PI染色，SYTO9標記的是活菌，呈綠色熒光；PI標記的是死菌，呈紅色熒光；橙色或橘黃色熒光代表死菌和活菌重疊部分。圖2可見，空白對照組整個視野大量細菌黏附平鋪在載體上，細菌密集疊加在一起，有的呈片狀(見圖2 A)?？鄥⒔M僅有少量細菌黏附于載體(見圖2 B、C、D)。

2.3成熟BF經不同組合藥物作用后BF的改變及BF內的活菌數變化苦參水煎液單獨使用對生物膜內細菌的影響與空白對照組相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與空白對照組相比較，LFX單獨使用對生物膜內細菌有一定殺菌作用(P≤0.05)，但苦參水煎液與LFX聯用，能使生物膜內活菌數顯著減少，與LFX相比較，差異有統計學意義(P≤0.05，見表1)。

*與空白對照組比較，P≤0.01?！　D1　銅綠假單胞菌經不同濃度苦參作用后結晶紫半定量結果

A：空白對照組；B：1/2MIC苦參組；C：1/4MIC苦參組；D：1/8MIC苦參組。圖2　苦參對銅綠假單胞菌黏附力的影響(×630)

組別0h4h8h24h空白對照組156±23158±25166±21161±21苦參組157±17151±28156±12LFX組101±11*86±9*73±8*苦參+LFX組41±4*☆23±2*☆10±4*☆

*P≤0.05，與空白對照組比較；☆P≤0.05，LFX組比較。

CLSM觀察(見圖3)，經SYTO9 /PI染色，可見空白對照組、苦參組載體上細菌黏附濃密，活菌量明顯多于死菌量(見圖3 A,B)，LFE組、苦參與LFX聯合組可見死菌量明顯增多，呈紅色熒光(見圖3 C,D)。

A：空白對照組；B：苦參組；C： LEX組；D：苦參聯合LFX組。圖3　藥物對成熟BF的影響(×630)

3討論

苦參來源于豆科植物苦參的根，其主要有效成份為生物堿和黃銅類化合物，有清熱解毒、祛風殺蟲等作用。本研究結果顯示，1/8MIC、1/4MIC及1/2MIC的苦參水煎液作用P.a，CLSM下可見空白對照組載體上有大量的細菌黏附聚集，形成成熟BF，而苦參水煎液組載體表面幾乎沒有BF形成，僅見散在極少數P.a黏附其上。這表明苦參對P.a黏附有抑制作用。通過結晶紫半定量實驗可見對照組A570值>1.0，說明P.a生物膜形成能力較強，而各苦參水煎液組A570值均≤0.3，說明苦參抑制P.a形成生物膜。細菌黏附于物體表面是其生物膜形成的第一步。因此，苦參對P.a黏附力的抑制作用可能是其抑制BF形成的機制之一。

雖然蔬菜的腌制已經有非常悠久的歷史，腌制的蔬菜深受人們的喜愛，但是這些腌制的食品中含有亞硝酸鹽，亞硝酸鹽的含量如果過高，人體在食用之后不僅會出現組織缺氧等現象，嚴重時還會引發(fā)癌變[6]。對食品中的亞硝酸鹽進行具體測定時，需要與實際情況進行結合，將所有樣品的溫度控制在35℃以下，并且保證一定的干燥性。脂對亞硝酸鹽含量測定的影響如表3所示。

CGF特殊的纖維蛋白網狀結構，也是骨組織再生的基礎。3D立體網格的結構可以增強上述生長因子滲透能力，促進干細胞的遷徒分化能力，加快細胞的增殖，使得骨的形成時間縮短，增加骨組織形成量。

研究顯示銅綠假單胞菌PAO1在體外培養(yǎng)3d能形成早期BF，7d形成成熟BF[9]。有成熟BF包裹的P.a由于物理屏障的保護作用對環(huán)境因子的耐受性增強。此外，BF內細菌由于氧、營養(yǎng)物質等缺乏其代謝率降低，也導致BF內細菌對外界因子不敏感。因此，許多對浮游菌敏感的藥物由于不能滲入BF內或滲入BF內的藥物濃度降低，而不能發(fā)揮有效的抗菌作用。近年來研究發(fā)現單用1MIC或2MIC苦參水煎液不能有效殺滅生物膜內的細菌[10]，而LFX雖然殺菌活性不依賴于細菌的生長率，其對BF也有一定的滲透力， 但單用LFX也只能殺滅BF內部分細菌[11]。本次研究選用成熟BF 的模型進行抗菌實驗，研究發(fā)現苦參水煎液與LFX聯合作用可見BF內活菌數量較單獨用藥組顯著減少，提示苦參水煎液能有效增強LFX對BF的滲透性，對清除BF內P.a起到增效作用，這為臨床中西醫(yī)結合用藥治療P.a引起的相關性感染疾病提供了實驗依據。但關于苦參對LFX增效作用機制還有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] Costerton J W，Stewart P S，Greenberg E P，et al.Bacterial biofilms：a common cause of persistent infections[J].Science,1999,284(5418)：1318-1322.

[2] Tunney M M, Ramage G, Field T R, et al. Rapid Colorimetric Assay for Antimicrobial Susceptibility Testing ofPseudomonasaeruginosa[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2004,48(5):1879-1881.

[3] 李軍，陳衛(wèi)民. 慢性難治性感染、細菌生物膜形成與中西醫(yī)結合治療[J]. 中醫(yī)中藥，2011,9(32)：383-385.

[4] 曹林忠，黨永生，張曉剛，等. 中藥干預細菌生物膜形成的研究進展[J]. 中醫(yī)正骨，2013,25(1):35-37.

[5] 穆海霞，陳俊清. 五倍子與阿奇霉素協同對金黃色葡萄球菌生物被膜的體外抗菌作用[J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志，2011,32(1)：93-94.

[6] 向麗，李蓉，周鐵軍，等. 五倍子鞣質對生物被膜型白假絲酵母的干預作用[J]. 安徽農業(yè)科學，2012,40(27)：13262-13269.

[7] 徐叔云. 藥理實驗方法學[M]. 第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002:1647-1661.

[8] 陳波曼，余加林，劉官信，等. SYT09/PI熒光探針標記的銅綠假單胞菌PAO1菌株生物被膜形成的動態(tài)觀察[J]. 第三軍醫(yī)大學學報，2008,30(5)：390-392.

[9] 溫紅俠，陳一強，朱蓮娜，等. 綠原酸對銅綠假單胞菌生物膜干預作用的體外研究[J]. 中華醫(yī)院感染學雜志，2009,19(12)：1478-1481.

[10] 周強，鄧晨暉，張文，等. 苦參提取物與頭孢他啶聯用對銅綠假單胞菌生物被膜清除作用影響的體外研究[J]. 新中醫(yī)，2008,40(12)：98-99.

[11] 孔晉亮，劉曉嵐，陳一強，等. 黃芩水煎液聯合左氧氟沙星對銅綠假單胞菌生物被膜的影響[J]. 天津醫(yī)藥，2008,36(5)：331-333.

[收稿2015-04-23;修回2015-05-28]

(編輯：譚秀榮)

Intervention of sophora flavescen aqueous-extracts onPseudomonasaeruginosabiofilm in vitro

SongHong1，JinYing2，WangMingsheng2

(1.Department of Microbiology, Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China；2.Medicine & Technology School Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)

[Abstract]Objective To observe the inhibitory effects of sophora flavescen aqueous-extracts on biofilm of Pseudomonas aeruginosa and the synergism of bactericidal effect between sophora flavescen aqueous-extracts and levofloxacin (LFX) on biofilm of Pseudomonas aeruginosa in vitro.Methods Minimal inhibitory concentrations (MICs) were measured by doubling dilution. The effects of sophora flavescen aqueous-extracts at different concentrations on Pseudomonas aeruginosa adhesion were evaluated by crystal violet staining methods for biofilm quantitation and confocal laser scanning microscopy for biofilm formation. After the biofilm was treated by sophora flavescen aqueous-extracts, LFX and the combination of both, the effects on Pseudomonas aeruginosa biofilm were measured by serial dilutions for viable bacterial counts and observed through confocal laser scanning microscopy for biofilm destruction.Results Compared with control group, sophora flavescen aqueous-extracts groups inhibited Pseudomonas aeruginosa to adhere onto the surface of the object after incubation for 7 days. Combined with sophora flavescen aqueous-extracts, LFX obviously reduced the amount of viable bacteria on Pseudomonas aeruginosa biofilm compared with sophora flavescen aqueous- extracts or LFX alone (P ≤0.05).Conclusion Sophora flavescen aqueous- extracts can inhibit biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and enhance the bactericidal effect of LFX on Pseudomonas aeruginosa within biofilm in vitro.

[Key words]sophora flavescens; Pseudomonas aeruginosa；bacterial biofilm

[文獻標志碼][中圖法分類號] R379 A

[文章編號]1000-2715(2015)03-0235-04

[基金項目]貴州省科學技術基金資助項目(NO：黔科合G字LKZ[2011]37)；遵義醫(yī)學院與科技學院大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目(NO：[2011]1906)。