楊士珍，黃永震，賀 花，2，雷初朝，陳 宏,*

(1. 西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學重點實驗室，陜西楊凌，712100；2. 西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學學院，陜西楊凌，712100)

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動物DNA甲基化的研究現(xiàn)狀與應用前景

楊士珍1，黃永震1，賀 花1，2，雷初朝1，陳 宏1,*

(1. 西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學重點實驗室，陜西楊凌，712100；2. 西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學學院，陜西楊凌，712100)

隨著全基因組甲基化測序技術(shù)的發(fā)展，可以在全基因組范圍內(nèi)確定DNA甲基化的位置及其與基因調(diào)控間的關(guān)系。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳學修飾方式,在維持正常細胞功能、調(diào)控個體生長發(fā)育起著重要作用，已經(jīng)成為目前研究的熱點。本文綜合分析了DNA甲基化的表觀遺傳學特征，簡要介紹了DNA甲基化的作用機制，重點闡述了動物DNA甲基化的研究現(xiàn)狀。另外，本文對DNA甲基化研究應用的發(fā)展應用前景進行綜述。

DNA甲基化；動物；應用

表觀遺傳是指在基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達卻發(fā)生了可遺傳的變化，DNA甲基化是其重要的表觀遺傳修飾方式之一。在動物育種的研究中，動物的某一基因或者生產(chǎn)性狀受多種因素的影響和調(diào)控，其中，DNA甲基化在動物的正常發(fā)育、分化中就起著重要的作用，隨著表觀遺傳學在家畜遺傳育種研究中得到廣泛關(guān)注，DNA甲基化研究的進一步開展，其在家畜遺傳育種中發(fā)揮的作用也日益顯著。

1 DNA甲基化

表觀遺傳修飾雖然不會引起DNA序列的改變，但是它對器官的發(fā)育和個體的生長仍然有重要的影響。DNA甲基化是一種主要的基因組表觀遺傳修飾方式，在調(diào)控基因選擇性表達、維持基因組穩(wěn)定性以及保證機體正常生長發(fā)育等生命過程均發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

DNA甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化下，催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，從而將甲基基團連接到DNA分子的堿基上的反應過程[1]。通常情況下，真核生物中的DNA甲基化存在形式主要是5-甲基胞嘧啶(5-mC)，但也存在少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)以及7-甲基鳥嘌呤(7-mG)[2]。發(fā)生DNA甲基化修飾的主要位點是在與鳥嘌呤相連的胞嘧啶上，即聚集成簇的CpG二核苷酸位點，基因組中富含CpG二核苷酸位點的DNA片段被稱為CpG島，而某些基因型更易受DNA甲基化的影響，即對甲基基團更加敏感[3]。DNA甲基化參與了細胞的多種生理活動，比如基因的時空特異性表達、X染色體失活、衰老以及癌癥的發(fā)生等。

2 甲基化的作用機制

2.1 甲基轉(zhuǎn)移酶的分類及功能

根據(jù)目前的研究結(jié)果，哺乳動物中與甲基化有關(guān)的甲基化轉(zhuǎn)移酶主要有5種：DNMT1，DNMT2，DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L[4]。甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)主要在DNA復制時催化新生鏈上DNA發(fā)生甲基化，維持原本存在的甲基化。甲基轉(zhuǎn)移酶2(DNMT2)，其活性很低，該基因缺失對DNA甲基化影響不顯著．推斷可能不涉及DNA的甲基化，可能誘導RNA甲基化。DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L介導DNA的初始甲基化，即從頭甲基化[5]。

2.2 DNA甲基化調(diào)節(jié)基因表達的機制

DNA甲基化功能的本質(zhì)是甲基化機制的建立、維持和去除甲基。DNA甲基化調(diào)節(jié)基因表達的機制主要有兩種：①5-甲基胞嘧啶(5 mC)伸入DNA雙螺旋的大溝，此處是眾多蛋白質(zhì)因子與DNA結(jié)合的部位，且含有豐富的能被轉(zhuǎn)錄因子識別的GC序列，但CpG發(fā)生甲基化后，轉(zhuǎn)錄因子就不能結(jié)合到DNA上，從而影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)DNA的結(jié)合效率；②DNA甲基化導致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，從而抑制基因表達。伴隨個體發(fā)育，當需要某些基因保持“沉默”時，將迅速發(fā)生甲基化，此時基因轉(zhuǎn)錄抑制，基因不表達；若需要恢復轉(zhuǎn)錄活性，則被去甲基化[6]。

DNA的甲基化主要發(fā)生在啟動子、轉(zhuǎn)座子、增強子、沉默子和基因本體等部位。通常認為啟動子的DNA甲基化對基因的表達有抑制作用，而基因本體的DNA甲基化與基因的表達關(guān)系因物種或細胞類型不同而異。增強子的DNA甲基化狀態(tài)與基因活性呈反比關(guān)系，沉默子則相反呈正相關(guān)。轉(zhuǎn)座子的DNA高度甲基化抑制其轉(zhuǎn)座活性，從而維持基因組的穩(wěn)定性[7]。

3 動物DNA甲基化研究現(xiàn)狀

3.1 DNA甲基化與肌肉生長發(fā)育

家畜個體的肉質(zhì)是遺傳育種中一個重要的性狀，在肌細胞分化過程中，表觀修飾如DNA甲基化、組蛋修飾和染色質(zhì)重塑等，都發(fā)生了很明顯的變化，并受到精確調(diào)控[8]。侯偉媛[9]等人在研究Akt基因?qū)∪饧毎谋碛^調(diào)控時發(fā)現(xiàn)，Akt基因的轉(zhuǎn)錄水平會增加Dnmtl的蛋白穩(wěn)定性，上調(diào)Dnmt1水平，維持DNA甲基化和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，經(jīng)IL-6處理后的細胞可以觀察到Akt能夠磷酸化Dnmtl核定位信號肽，激活Dnmtl從胞質(zhì)向核內(nèi)轉(zhuǎn)運[10]。

Akt基因還可以通過磷酸化修飾組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的Ezh2來降低Ezh2與組蛋白H3結(jié)合能力，減弱催化甲基化生成的能力，H3K27me3水平減少。而H3K27me3甲基化是非常重要的組蛋白修飾形式，可以調(diào)控肌肉分化特異基因表達，使肌細胞分化以及肌管形成順利進行[11]。

3.2 DNA甲基化與脂肪組織生長發(fā)育

近年來的研究發(fā)現(xiàn)[12],DNA甲基化在脂肪組織生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用:DNA甲基化可以調(diào)控脂肪細胞分化轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔助因子以及很多脂肪組織特異性基因的表達,從而調(diào)控脂肪組織的生長發(fā)育。

研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中PPARγ啟動子的DNA甲基化程度在不同發(fā)育階段是不同的,且健康動物和肥胖動物PPARγ啟動子的DNA甲基化存在差異。脂肪組織PPARγ啟動子DNA甲基化的升高導致其mRNA表達下降[13]。這說明脂肪組織中DNA甲基化存在差異，而DNA甲基化在脂肪細胞分化過程中同樣發(fā)揮著重要的作用[14]。研究發(fā)現(xiàn),在脂肪細胞分化過程中DNA甲基化是動態(tài)變化的[15]。脂肪細胞分化受到轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的精細調(diào)控,目前已發(fā)現(xiàn)DNA甲基化能調(diào)控多個脂肪細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔助因子基因的表達。例如，脂肪細胞分化的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一的C/EBPα，在前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞的過程中,C/EBPα基因啟動子區(qū)的CpG甲基化水平有升高的現(xiàn)象。

3.3 DNA甲基化與胚胎生長發(fā)育

一般認為胚胎發(fā)育過程是多種因素的共同結(jié)果，其中DNA甲基化起著重要作用。研究表明，DNA甲基化在生殖細胞形成早期至胚胎發(fā)生中經(jīng)歷了一系列動態(tài)變化：精子形成早期，來自父方的印記全部被消除，父方等位基因在精母細胞形成精子時產(chǎn)生新的甲基化模式，在進行減數(shù)分裂時，此類特異性的修飾可隨之進入到精細胞，雖然其對DNA一級結(jié)構(gòu)沒有影響，但會使特異性基因表達發(fā)生變化。卵細胞也具備同樣變化[16]。受精卵在植入子宮前的最初幾次卵裂中，去甲基化酶清除了DNA分子上從親代遺傳下來的甲基化標志，在胚胎著床之后，除了具備CpG島啟動子區(qū)域之外，所有基因都會重新進行一次劇烈的甲基化，并在隨后的發(fā)育過程中，組織特異基因經(jīng)歷選擇性去甲基化而形成特異表達細胞類型[17]。

3.4 DNA甲基化與細胞癌變

在轉(zhuǎn)錄開始時，可通過對CpG島(啟動子區(qū)域)甲基化作用進行基因表達調(diào)控，正常狀態(tài)時，非甲基化的CpG島被廣泛的表達，而在癌變細胞里，此類非甲基化狀態(tài)的CpG島卻被甲基化修飾。利用去甲基化劑5-氮胞昔對組織細胞進行處理時，可令DNA去甲基化并使某些基因染色體發(fā)生重組現(xiàn)象，對基因去甲基化是使得組織細胞基因不穩(wěn)定易發(fā)生癌變的一類原因[18,19]。單基因水平及基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化改變在細胞癌變中亦發(fā)揮重要作用。抑癌基因的異常甲基化引起的表達抑制,可導致腫瘤細胞的增殖失控和侵襲轉(zhuǎn)移,在許多腫瘤的研究中也都發(fā)現(xiàn)了基因組整體DNA低甲基化所導致的染色體不穩(wěn)定性。

4 DNA甲基化的應用前景

4.1 DNA甲基化在轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)上應用前景

目前，低效率的體細胞核移植技術(shù)顯著制約著該技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)上的廣泛應用，而克隆效率低下的主要原因是供體體細胞核沒有被受體卵胞質(zhì)完全的重編程,主要是表觀遺傳修飾的變化，而DNA甲基化是其最主要的方面。

基因的甲基化狀況(特別是啟動子區(qū)域)有調(diào)控基因表達的作用,異常的DNA甲基化表觀修飾引起的基因表達異常有可能是克隆動物表型異常和缺陷的原因[20,21]。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)[22]，轉(zhuǎn)基因克隆過程可能會引起胎盤中印跡基因的DNA甲基化的不完全重編程使胎盤發(fā)育失敗,進而可能導致了克隆動物器官發(fā)育異常以及死亡。蘇建民等[23]研究利用亞硫酸氫鹽測序法和亞硫酸氫鹽聯(lián)合限制性內(nèi)切酶法對印跡基因PEG10在轉(zhuǎn)基因克隆牛胎盤上的甲基化狀況進行了研究。結(jié)果顯示PEG10在圍產(chǎn)期死亡且有發(fā)育缺陷的轉(zhuǎn)基因克隆牛的胎盤上的DNA甲基化程度異常高,而存活組表現(xiàn)出較為正常的DNA甲基化程度。

由此可見，研究此過程中的DNA甲基化并且實現(xiàn)人為控制DNA甲基化和去甲基化及特定基因位點甲基化和去甲基化在轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)中非常重要。

4.2 DNA甲基化在誘導多能干細胞技術(shù)上的應用前景

DNA甲基化作為一種關(guān)鍵的表觀遺傳因素,能夠維持細胞長期的表觀遺傳記憶,在細胞重編程中具有重要作用[24.25]。目前的研究表明,體細胞被誘導為iPSCs的過程中經(jīng)歷了一系列有序的生物學事件,包括外源基因的表達、全基因組組蛋白修飾的改變、間充質(zhì)細胞向上皮樣細胞的轉(zhuǎn)化(Mesenchymal-to-epithelialtransition,MET)、內(nèi)源多能性轉(zhuǎn)錄因子的激活和全集因組DNA的去甲基化等[26]，所以在誘導體細胞重編程中，DNA甲基化是一個重要障礙。探索DNA甲基化與去甲基化確切的分子機制是理解其在體細胞誘導重編程中作用的基礎(chǔ)，研究細胞是如何在確保某些基因發(fā)生去甲基化的同時, 而又使另外一些基因發(fā)生重新甲基化是進一步探索DNA甲基化在細胞重編程過程中作用的關(guān)鍵，也是誘導多能干細胞技術(shù)在動物生產(chǎn)上廣泛應用的關(guān)鍵。

4.3 DNA甲基化在動物遺傳育種上的應用前景

近年來，DNA甲基化被作為一種新的分子遺傳標記在動物遺傳育種上的應用研究主要集中在下面幾個方面：(1)用來預測畜禽雜種優(yōu)勢；(2)可以作為檢測動物生長性狀、胴體性狀的輔助選擇標記。雜種優(yōu)勢本質(zhì)上源于親子代基因的差異表達[27]。此外，DNA甲基化也會影響畜禽生長性狀和胴體性狀。Xiong等[28]發(fā)現(xiàn)雜交種DNA甲基化降低與基因表達增強有關(guān)，可能與雜種優(yōu)勢表達有關(guān)。總體甲基化程度與雜種優(yōu)勢無關(guān)，而特異位點上的甲基化的改變對雜種優(yōu)勢有顯著效應。研究表明，胴體性狀在個體中性甲基化百分差異水平之間均無顯著的差異(\%P\%>0．05)；瘦肉率和瘦肥肉比例在個體全部甲基化百分差異水平之間存在顯著的差異(\%P\%<0．05)；胴體重、肩部最厚處背膘厚、平均背膘厚和骨率在個體特殊甲基化百分差異水平之間存在顯著的差異(\%P\%<0．05)。

由此可見，DNA甲基化作為一種新的分子遺傳標記在動物遺傳育種上有著長遠和十分重要的應用意義。在將DNA甲基化作為分子標記補充應用于生產(chǎn)實際時應針對不同性狀，將雜種后代甲基化控制在適當?shù)乃?，從而能夠生產(chǎn)出質(zhì)優(yōu)效高的畜禽產(chǎn)品，提高畜牧業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟和社會效益。

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Research and Application of DNA Methylation in Animal Genetics and Breeding

YANG Shi-zhen1, HUANG Yong-zhen1, HE Hua1, 2, LEI Chu-zhao1, CHENG Hong1*

(1KeyLaboratoryofagriculturalmolecularbiology,Collegeofanimalscienceandtechnology,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling,Shaanxi, 712100; 2,Collegeofanimalmedicine,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling,Shaanxi712100,Shaanxi,)

With the development of whole genome methylation sequencing technology, the location of DNA methylation and its relationship with gene regulation can be determined in the whole genome wide range. As an important epigenetic modification, DNA methylation plays an important role in maintaining normal cell function and regulating the growth and development of individuals, and has become a hot research topic in the present study. In this paper, we comprehensively analyze the epigenetic characteristics of DNA methylation, briefly introduce the mechanism of DNA methylation, and focus on the research status of DNA methylation in animal. In addition, this paper summarizes the problems in the application of DNA methylation research, as well as the prospects for the development of the application.

DNA methylation; Animal; Application

2016-07-01

2016-07-10

本項目由國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CARS-38)資助，中國博士后科學基金面上項目(2015M570857, 2015M570856)，陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2015KTCL02-08，2014KTZB02-02-02-02)，西北農(nóng)林科技大學2015年大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目資助完成。

楊士珍(1995-)，女，河北張家口人，主要從事動物遺傳與育種研究。

S823

A

1001-9111(2016)05-0051-04

*通訊作者：陳宏 (1955-)，男，陜西西安人，教授，博士生導師，主要從事分子遺傳與家畜育種。