陳俊娜　孫曉琳　董仕超　鄒　凱　劉　歡　王　巖　王　雪　劉　芳　謝基明　王玉珍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

Rab5a促進(jìn)CpG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素的表達(dá)①

陳俊娜孫曉琳董仕超鄒凱劉歡王巖王雪劉芳謝基明②王玉珍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

[摘要]目的：采用穩(wěn)定表達(dá)Rab5a及其顯性負(fù)性突變體Rab5aN133I的巨噬細(xì)胞系RAW264.7，研究Rab5a及其突變體過表達(dá)后對CpG誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素的表達(dá)的影響。方法：通過脂質(zhì)體法將Rab5a及其突變體Rab5aN133I的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中，用G418選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)Rab5a、Rab5aN133I的細(xì)胞系。通過RT-PCR、Real time-PCR和Western blot方法鑒定穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。用CpG刺激穩(wěn)定表達(dá)Rab5a、Rab5aN133I的細(xì)胞系8 h后檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-β的表達(dá)量變化。結(jié)果：RAW264.7轉(zhuǎn)染Rab5a真核表達(dá)載體后Rab5a的表達(dá)量顯著高于對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P<0.05)。Rab5a過表達(dá)后，在CpG刺激作用下RAW264.7分泌的TNF-α、IL-1β顯著升高(P<0.01)，IFN-β的分泌也顯著升高(P<0.05)，而Rab5aN133I過表達(dá)后上述細(xì)胞因子的分泌均有所恢復(fù)。結(jié)論：Rab5a促進(jìn)了CpG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素的表達(dá)，Rab5a可能是TLR9信號通路的正向調(diào)控蛋白。

[關(guān)鍵詞]Rab5a;CpG;TLR9;TNF-α;IL-1β;IFN-β

Rab5a存在于質(zhì)膜、早期內(nèi)體和網(wǎng)格蛋白覆蓋的囊泡上，作用是調(diào)控胞吞過程中胞吞泡和早期內(nèi)體的融合以及囊泡的再循環(huán)。Rab5a在發(fā)揮功能時不斷地進(jìn)行著GTP/GDP的循環(huán)[1]，富集并激活胞內(nèi)多種效應(yīng)分子，調(diào)控各早期內(nèi)體之間以及胞吞泡和早期內(nèi)體之間的融合。大量的研究證實，若Rab5a蛋白突變，可以引起細(xì)胞形態(tài)和功能發(fā)生異常，提示改變Rab5a蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，則可能導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生。

Toll樣受體(TLR)作為模式識別受體家族中最重要的一員，在啟動天然免疫應(yīng)答和促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的過程中起著至關(guān)重要的作用[2]。TLR9是Ⅰ型跨膜蛋白受體，它可以直接識別微生物的含有未甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤(CpG)序列的DNA[3]。人工合成的含有CpG基序的寡聚脫氧核苷酸(CpG ODN)可以模擬原核生物的DNA，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，通過信號傳導(dǎo)從而促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放，促進(jìn)或抑制炎癥反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[4]。

本實驗在建立穩(wěn)定表達(dá)Rab5a以及Rab5a顯性負(fù)突變Rab5aN133I的RAW264.7細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，研究Rab5a對CPG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IFN-β表達(dá)的影響，并探討Rab5a發(fā)揮作用的功能位點。本研究有利于深入理解天然免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制，為探索感染性疾病治療的靶標(biāo)提供科學(xué)的依據(jù)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞系與試劑RAW264.7細(xì)胞株(北京協(xié)和細(xì)胞庫)，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Sigma公司)，胎牛血清(蘭州民海生物試劑有限公司)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen)，反轉(zhuǎn)錄酶、Trizol(TaKaRa)，DEPC(天根生物科技有限公司)，含有CpG基序的寡核苷酸CpG ODN(5′-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3′) 全鏈硫代修飾(上海生工)，Real time mix(北京康為世紀(jì))，BCA蛋白檢測試劑盒(PIERCE公司)，抗體anti-Rab5a、anti-β actin(Santa Cruz公司)。

1.2實驗方法

1.2.1小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7的培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞株解凍后接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1~2 d換液或傳代一次。

1.2.2細(xì)胞篩選RAW264.7 細(xì)胞(4×105)接種于6孔板中，DMEM培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)。將1 μg的真核表達(dá)質(zhì)粒：空質(zhì)粒(pcDNA3.1)、Rab5a過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1/mRab5a)、Rab5a N133I顯性負(fù)突變質(zhì)粒(pcDNA3.1/tRab5a)與Lipofectamine 2000試劑溫和混勻后室溫放置20 min，以便形成質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物，然后將復(fù)合物加入到待轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染8 h后換液。48 h后加入G418(800 μg/ml)作用3周，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

1.2.3細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-β表達(dá)量的測定采用RT-PCR和Real time-PCR檢測Rab5a過表達(dá)及失活突變后對CpG刺激的巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IFN-β的影響。實驗中使用的引物序列見表1。

表1本實驗中使用的引物序列

Tab.1Primers used in experiment

Note：1 is the specific primers,2 are the Real time fluorescence quantitative PCR primers.

1.3統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan法進(jìn)行多重比較分析，P<0.05時認(rèn)為具有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1CpG促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞中Rab5a mRNA的表達(dá)有研究發(fā)現(xiàn)Rab5主要定位在早期胞內(nèi)體中，首先我們檢測了巨噬細(xì)胞中Rab5a是否受到TLR9活化的影響，用0.3 μmol/L的CpG刺激RAW264.7細(xì)胞0、2、4、8、12、24 h后RT-PCR研究Rab5a mRNA的表達(dá)水平。如圖1所示，CpG刺激后，Rab5a的mRNA表達(dá)水平在2 h和4 h時有所升高，隨后降低并恢復(fù)至正常水平。接著我們利用Real time-PCR進(jìn)行了定量分析，如圖2所示，CpG刺激2 h和4 h后Rab5a的表達(dá)水平顯著升高，而12 h時Rab5a的表達(dá)水平又恢復(fù)到正常水平。這種轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)變化提示，Rab5a的表達(dá)受到TLR9配體CpG的調(diào)控。

2.2Rab5a穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株的鑒定如圖3A的RT-PCR結(jié)果所示，pcDNA3.1/mRab5a、pcDNA3.1/tRab5a的mRNA水平與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pcDNA3.1的細(xì)胞相比，高出約2倍左右。該結(jié)果說明我們已經(jīng)得到了表達(dá)上述三種質(zhì)粒的細(xì)胞株。為了進(jìn)一步驗證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們隨后利用Real time-PCR和Western blot的方法進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。如圖3B和3C，所得結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相似。根據(jù)RT-PCR、Real time-PCR和Western blot的結(jié)果來看，我們已經(jīng)得到了穩(wěn)定表達(dá)mRab5a及其突變體的細(xì)胞株。

2.3Rab5a促進(jìn)CpG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IFN-β的表達(dá)從前期的實驗結(jié)果我們可以得出，用TLR9的配體CpG活化巨噬細(xì)胞后，

mRab5a的表達(dá)水平有所升高，提示Rab5a可能參與了TLR9的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。為了闡明Rab5a在CpG誘導(dǎo)的TLR9的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用，我們首先檢測了Rab5a對CpG刺激巨噬細(xì)胞后分泌細(xì)胞因子的影響。TNF-α、IL-1β的分泌主要是受MyD88依賴途徑的調(diào)控，如圖4和圖5所示，Rab5a過表達(dá)后，顯著地促進(jìn)了CpG誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TNF-α和IL-1β的分泌。相反的，失活突變的Rab5a則可以抑制TNF-α、IL-1β的分泌。IFN-β的分泌受轉(zhuǎn)錄因子IRF7的調(diào)控，如圖6所示，Rab5a過表達(dá)后也顯著地促進(jìn)了IFN-β的表達(dá)，而失活突變的Rab5a則失去了這種促進(jìn)功能。

3討論

Rab蛋白參與了細(xì)胞內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程，包括囊泡的形成、遷移和融合[5,6]。但是，越來越多的證據(jù)顯示出Rab成員具有其他的生物學(xué)功能。如定位于晚期內(nèi)體的GTP酶Rab7，它可以通過調(diào)控胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的內(nèi)陷和降解，從而參與到生長因子調(diào)節(jié)的細(xì)胞凋亡過程中[7]；與甲狀腺相關(guān)的腺癌中，Rab5a和Rab7的表達(dá)均有所增加[8]；在宮頸鱗癌(Cervical squamous cell carcinomas，CSCC) 組織中，Rab5a在EGFR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用，而Rab21則在EGFR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用[9]；Rab25與乳腺癌的發(fā)病密切相關(guān)；Rab39a與caspase-1結(jié)合后促進(jìn)了經(jīng)由caspase-1介導(dǎo)的IL-1β的分泌[10]。這些證據(jù)證明了Rab家族能夠參與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)之外的多種生物進(jìn)程，但是Rab家族的成員是否或如何參與調(diào)節(jié)天然免疫中TLR9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)還有待探索。巨噬細(xì)胞是固有免疫應(yīng)答中最重要的細(xì)胞亞群，是廣泛地存在于人體中的具有強(qiáng)大吞噬能力的一類細(xì)胞。除吞噬功能外，巨噬細(xì)胞中存在的模式識別受體被活化后，能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的Ⅰ型干擾素和促炎性因子。本實驗中我們研究了Rab5a對TLR9信號通路的調(diào)控作用。TLR9被相應(yīng)的配體CpG激活后，通過MyD88依賴的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑傳遞信號。MyD88依賴途徑活化產(chǎn)生IL-6、IL-1β、IL-12、TNF-α等細(xì)胞因子，同樣依賴于MyD88的IRF7也可以誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素如IFN-β的產(chǎn)生[11]。我們的實驗結(jié)果表明，Rab5a過表達(dá)后，促進(jìn)了CpG誘導(dǎo)的促炎性因子TNF-α、IL-1β和Ⅰ型干擾素IFN-β細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而失活突變的Rab5aN133I阻斷了這種效應(yīng)。由于TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要輸出結(jié)果是細(xì)胞因子，我們的研究表明Rab5a可以促進(jìn)CpG誘導(dǎo)的TLR9信號。

綜上所述，Rab5a正向調(diào)控巨噬細(xì)胞中CpG誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素的表達(dá)，Rab5a可能是一個新的正向調(diào)控TLR9信號通路的蛋白。

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[收稿2015-04-25修回2015-06-16]

(編輯張曉舟)

Rab5a promotes expression of pro-inflammatory cytokines and type Ⅰ IFN in CpG induced macrophages

CHENJun-Na,SUNXiao-Lin，DONGShi-Chao,ZOUKai,LIUHuan,WANGYan,WANGXue,LIUFang,XIEJi-Ming,WANGYu-Zhen.CollegeofLifeSciences,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot010018,China

[Abstract]Objective:Using the macrophage cell lines RAW264.7 stably expressing Rab5a and its dominant negative mutant Rab5aN133I as models to analyze the effect and the mechanism of Rab5a,Rab5aN133I on CpG-induced production of pro-inflammatory cytokines and type Ⅰ IFN.Methods: The eukaryotic expression vectors of Rab5a and Rab5aN133I were transfected into RAW264.7 cells by liposome,and screened with G418.The G418-resistant colonies were obtained and amplified.The transformed cell lines were identified by RT-PCR,Real time-PCR and Western blot.The production of cytokines were measured after transformed cell lines of Rab5a and Rab5aN133I was stimulation with CpG for 8 h.Results: Rab5a expression in transfected cells was significantly higher than the control cell group (P<0.05).Overexpression of Rab5a significantly promoted the production of TNF-α，IL-1β (P<0.01) and IFN-β (P<0.05) in CpG stimulated RAW264.7.The production of cytokines was restored in Rab5aN133I transfected cell line.Conclusion: Rab5a promotes CpG-induced pro-inflammatory cytokines and type Ⅰ IFN in macrophages,it may be act as a positive regulator in TLR9 signaling pathway.

[Key words]Rab5a；CpG；TLR9；TNF-α；IL-1β；IFN-β

通訊作者及指導(dǎo)教師：王玉珍(1976年-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子免疫學(xué)方面的研究，E-mail:wangyuzhen817@126.com。

作者簡介：陳俊娜(1988年-)，女，在讀碩士，主要從事分子免疫學(xué)的研究。

中圖分類號R392.1
①本文為國家自然科學(xué)基金項目(No.31270922,81360397,81560677)。
②內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，呼和浩特010020。

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0165-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.004 10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.005