楊天飛　鄭　桐　譚慶華　車筑平

(貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴陽550004)

阿司匹林對SD大鼠小腸黏膜生長抑素受體水平的影響①

楊天飛鄭桐②譚慶華③車筑平

(貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴陽550004)

①本文為貴州省科技廳基金(E2011-10)。

②廣東省潮州市潮州醫(yī)院，潮州521001。

③四川大學(xué)華西醫(yī)院，成都610000。

[摘要]目的：通過觀察非甾體消炎藥(Non-steroid anti-inflammatory drugs，NSAIDs)阿司匹林不同給藥途徑對大鼠小腸黏膜屏障及生長素抑素受體(Somatostatin receptors SSTR)水平的影響，探討阿司匹林的最佳給藥途徑。方法：32只SD大鼠隨機分為灌胃組、灌腸組、腹腔注射組及空白對照組四組，每組8只。對回腸黏膜損傷進行評分；ELISA檢測各組回腸組織SSTR水平;免疫組化檢測各組回腸組織SSTR的分布,圖像分析軟件測定IOD值。結(jié)果：(1)阿司匹林治療組回腸黏膜損傷指數(shù)比正常對照組高(P<0.05)，但各實驗組之間兩兩比較黏膜損傷評分無差別；(2)各亞型SSTR在大鼠小腸黏膜均有表達，以SSRT1及SSTR2為主(P<0.05)；(3)與空白對照組比較,實驗組大鼠小腸黏膜中SSTR1-5表達均降低(P<0.05)；(4)不同的給藥方式對SSTR1-5的影響不完全一致，部分P<0.05。(5)四組間SST濃度、IOD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：阿司匹林可以導(dǎo)致大鼠小腸黏膜的損傷。各亞型SSTR在大鼠小腸黏膜均有表達，阿司匹林可以導(dǎo)致小腸黏膜各型SSTR的表達下降，提示這種變化可能影響小腸黏膜的屏障功能。不同的給藥途徑對SSTR的影響不盡相同，提示我們使用阿司匹林時胃腸外給藥可能會減少腸道損傷的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]小腸黏膜；阿司匹林；生長抑素受體1-5；給藥途徑

非甾體抗炎藥(Non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)是一類不含有甾體結(jié)構(gòu)的抗炎藥，包括阿司匹林、雙氯芬酸、對乙酰氨基酚、塞來昔布等。NSAIDs廣泛運用于臨床，具有抗炎、抗風(fēng)濕、止痛、退熱和抗凝血等作用，但其胃腸道副作用不容忽視。NSAIDs導(dǎo)致小腸黏膜屏障的損害機制尚不完全明確，可能和多種保護因素及損害因素有關(guān)，生長抑素(Somatostatin,SST)就是其中的一個重要保護因素。然而，SST發(fā)揮作用的關(guān)鍵是生長抑素受體(Somatostatin receptor，SSTR)在細胞膜上的表達。 本研究通過對大鼠的實驗性研究，觀察阿司匹林對大鼠小腸黏膜的損傷及對生長素抑制激素受體(SSTR)的影響，探討提高保護腸黏膜屏障的辦法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑注射用精氨酸阿司匹林，海南靈康制藥有限公司生產(chǎn)。一抗試劑：兔抗鼠SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5單克隆抗體，二抗試劑：Sp免疫組化檢測試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。96孔ELISA試劑盒：SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5,上海豐翔生物有限公司生產(chǎn)。

1.1.2實驗動物及分組32只12周齡Sprague-Dawley大鼠，雌雄各半(重慶實驗動物中心提供)，體質(zhì)量(198.6±18.8)g。隨機分為實驗組(灌胃組、灌腸組、腹腔注射組)及空白對照組，每組8只。實驗組分別給予精氨酸阿司匹林(100 mg/kg)灌胃、灌腸、腹腔注射(采用灌胃針進行灌胃及灌腸，無菌注射針進行腹腔注射)，空白對照組不予特殊處理，以相同條件喂養(yǎng)。于14 d處死實驗動物后留取距回盲部5 cm回腸組織-80℃保存?zhèn)溆?，進行有關(guān)指標(biāo)的觀察和測定。在進行本實驗前，先做了預(yù)實驗提示：阿司匹林50 mg/kg，7 d，進行大體觀察、檢測相關(guān)指標(biāo)，沒有發(fā)現(xiàn)大體標(biāo)本有損傷，檢測指標(biāo)沒有差異，故增加劑量及時間為100 mg/kg，14 d，進行檢測；本實驗主要是觀察阿司匹林對小腸的影響，由于回腸末段淋巴濾泡相對豐富，病變多發(fā)部位，而且是臨床上結(jié)腸鏡檢查易于到達的部位，故選取距離回盲部5 cm。

1.2方法

1.2.1小腸黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察采用Chiu氏6級評分法評價腸黏膜損傷程度(評分越高，損傷程度越重)[1]：0分：腸黏膜絨毛正常；1分：絨毛頂端上皮下出現(xiàn)囊狀間隙，并伴有毛細血管充血；2分：上皮下間隙擴大，中度固有層水腫，中央乳糜管擴張；3分：固有層明顯水腫，腸黏膜上皮層細胞變性、壞死，少數(shù)絨毛頂端脫落；4分：上皮細胞層變性壞死、脫落，部分絨毛脫落，固有層裸露，毛細血管擴張、充血；5分：絨毛脫落，固有層崩解，出血或潰瘍形成。光鏡下每個樣本隨機計數(shù)5個視野。

1.2.2生長抑素受體(SSTR1，SSTR2，SSTR3，SSTR4，SSTR5)免疫組織化學(xué)檢測及圖像分析采用免疫組織化學(xué)方法(SP法)，所有檢測項目均以PBS作為相應(yīng)的陰性對照。取回腸末段組織進行石蠟包埋-切片-脫蠟-修復(fù)抗原-一抗、二抗程序作用-加入酶標(biāo)鏈酶卵白素復(fù)合物-DAB室溫顯色-蘇木素復(fù)染-脫水-封片，顯微鏡觀察。陽性顯色為棕黃色。采用Image Pro plus圖像分析軟件進行半定量分析，每個樣本隨機檢測5個高倍視野(×400)，計算陽性細胞IOD值，得出5個高倍視野的均數(shù)，即代表該樣本陽性細胞IOD值。

1.2.3生長抑素受體(SSTR1，SSTR2，SSTR3，SSTR4，SSTR5)ELISA定量分析,每個樣本均設(shè)復(fù)孔。取上述回腸組織100 mg，剪碎為3×3 mm大小，加1 ml PBS液，低溫勻漿，放入1.5 ml離心管，以1 000 r/min,4℃，5 mim 離心，取上清液分裝待用。

2結(jié)果

2.1小腸形態(tài)組織學(xué)變化本組研究中小腸黏膜大體標(biāo)本觀察可見黏膜散在充血點，未見明顯的黏膜出血、潰瘍等病變。光學(xué)顯微鏡下組織學(xué)變化：對照組大鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，偶可見絨毛上皮缺損和少量炎性細胞浸潤。實驗組大鼠可見腸絨毛腫脹、縮短、增粗，頂端部分破損或斷裂，部分可見黏膜局灶糜爛、壞死，黏膜下間隙增大，固有層水腫明顯伴炎癥細胞浸潤,出現(xiàn)上皮細胞變性、壞死、剝脫，部分絨毛融合、縮短，甚至固有層裸露(圖1)。

灌胃組、灌腸組、腹腔注射組Chiu氏評分平均分別為2.13分、2.03分和1.82分，三組之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。與空白對照組0分相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2SSTR表達變化

2.2.1空白對照組各型SSTR的表達情況通過ELISA定量分析及免疫組化觀察SSTR的陽性表達，顯示各亞型SSTR在大鼠小腸黏膜中均有不同的表達，以SSTR1表達最高(P<0.05)、其次為SSTR2(P<0.05)，SSTR3、SSTR4、SSTR5的表達均較低(與SSTR1、SSTR2比較P<0.05)見表2及圖2。

Note：Compared with normal control group,1)P<0.05.

2.2.2ELISA定量分析大鼠回腸SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5灌胃組、灌腸組SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5水平與正常對照組比較降低(P<0.05)，三組阿司匹林處理組之間兩兩比較其水平無差異；腹腔注射組SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5水平與正常對照組比較也降低，但SSTR1、SSTR2、SSTR3與空白對照組比較無差異(P>0.05)，分別與灌胃組、灌腸組比較有差異(P<0.05)；腹腔注射組SSTR4、SSTR5水平與正常對照組比較有差異，分別與灌胃組、灌腸組比較無差異。見表3。

Note：Compared with SSTR1,1)P<0.05，compare with SSTR2,2)P<0.05.

2.3免疫組化顯示回腸黏膜SSTR分布情況(圖2)及量變情況(表4)灌胃組、灌腸組各型SSTR的IOD值與正常對照組比較降低(P<0.05)，三組阿司匹林處理組之間兩兩比較其水平無差異；腹腔注射組各型SSTR的IOD值與正常對照組比較也降低，但SSTR1、SSTR2、SSTR3與空白對照組比較無差異(P>0.05)，分別與灌胃組、灌腸組比較有差異(P<0.05)；腹腔注射組SSTR4、SSTR5的IOD值與正常對照組比較有差異，分別與灌胃組、灌腸組比較無差異。

Note：Compared with normal control group,1)P<0.05，compare with intraperitoneal injection group,2)P<0.05.

2.4SST表達變化ELISA定量分析SST水平及免疫組化觀察SST的表達情況顯示，灌胃組、灌腸組、腹腔注射組與正常對照組比較無差異(P>0.05)。三組阿司匹林處理組中，三組間兩兩比較其水平?jīng)]有差異(P>0.05)，見表5及圖3。

表5SST 在各組大鼠腸黏膜中表達情況

Tab.5Changes SST in local site of ileum mucosa in rat

Note：Compared with normal control group,1)P<0.05，compared with intraperitoneal injection group,2)P<0.05.

Note：Compared with normal control group,1)P>0.05.

3討論

NSDIAs相關(guān)性小腸損害主要有糜爛及潰瘍、小腸慢性失血、蛋白丟失、回腸吸收功能障礙,腸穿孔、大出血、腸腔狹窄(有環(huán)形狹窄和隔狀狹窄)導(dǎo)致的腸梗阻等[2-4]。本研究中，大鼠小腸黏膜肉眼大體觀察損傷不明顯，部分標(biāo)本可見少許黏膜充血及黏膜下出血點，但在顯微鏡下可明確的看到小腸絨毛腫脹、縮短、增粗，頂端部分破損或斷裂，黏膜局灶糜爛、壞死，黏膜下間隙增大等改變。根據(jù)Chiu氏評分結(jié)果實驗組與空白對照組是有差異的，這說明NSAIDs的對大鼠小腸黏膜屏障的破壞是肯定的。本組資料大體損害不明顯，與其他研究有差異[2-4]，在不同給藥途徑之間的黏膜損傷比較以灌胃組明顯，但無統(tǒng)計學(xué)意義。分析原因可能與藥物的種類、劑型及用藥時間相關(guān)，尤其是用藥時間的影響，根據(jù)文獻報道，NSAIDs引起小腸病變，尤其是較嚴重的病變，如潰瘍、小腸狹窄等大都見于是長期或大量服用NSAIDs患者[4,5]。

SSTR可以表達在全身大多數(shù)器官和組織，在大腦、胃腸道、垂體、內(nèi)分泌和外分泌的胰腺、腎上腺、甲狀腺、免疫細胞、視網(wǎng)膜細胞都有SSTR的存在[6,7]。SSTR是生長抑素(SST)發(fā)揮作用的重要介質(zhì)。SST是腸道重要的神經(jīng)內(nèi)分泌遞質(zhì),具有對包括機體免疫功能在內(nèi)的廣泛生理調(diào)節(jié)功能[8]?？梢酝ㄟ^多種途徑減輕腸道黏膜炎癥、增強天然免疫和促進上皮修復(fù)的作用，廣泛的運用于臨床。內(nèi)源性SST對腸黏膜漿細胞的發(fā)育具有重要的正性調(diào)控作用，外源性補充SST可有效改善內(nèi)源性SST缺乏的狀態(tài),維護腸黏膜獲得性體液免疫[9]。眾多研究還表明，在很多人類腫瘤如類癌、嗜鉻細胞癌、胃泌素瘤、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌等中均證明有SSTR的表達,這就為SST及其類似物應(yīng)用于腫瘤的治療提供了可能[10,11]。通過本實驗數(shù)據(jù)也可以觀察到，各型生長抑素受體在大鼠的小腸道黏膜均有不同程度的表達，其中以SSTR1及SSTR2為主。SSTR具有識別不同信使的能力，并能通過一些直接或間接的偶聯(lián)系統(tǒng)啟動生物學(xué)反應(yīng)。從SSTR的生理作用上看，各型SSTR之間起到一個協(xié)同作用。在給予阿司匹林處理后，SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5的處理組的表達均低于空白對照組，灌胃組、灌腸組與空白對照組比較，差異有顯著性。而同期的研究表明，相同狀態(tài)下，內(nèi)源性SST的分泌并沒有明顯變化[12]。說明阿司匹林導(dǎo)致SSTR1-5的表達降低，使得內(nèi)源性的SST或外源性的SST不能充分的起到黏膜保護屏障的作用，導(dǎo)致小腸黏膜屏障的破壞，引起小腸黏膜糜爛及潰瘍、慢性失血、蛋白丟失、功能障礙等臨床表現(xiàn)。提示我們，可否通過人為的干預(yù)，使SSTR的表達增加，促進SST的生理作用，使腸黏膜屏障得以修復(fù)、炎癥反應(yīng)得以減少呢？由于各型SSTR之間的作用有協(xié)同性，并且天然的 SST 與 5 種亞型受體結(jié)合幾乎無選擇性而結(jié)合力都較強，是否只需要促使其中的一種或兩種亞型受體表達增加就能夠起到預(yù)防或治療作用呢？這有待我們進一步的研究。

從本研究結(jié)果中我們了解到阿司匹林可以引起各型SSTR的表達均降低，但是，內(nèi)源性的SST并沒有明顯變化，也給我們提出了新的思考：SSTR可能受到了什么影響呢？SST廣泛的分布于中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、垂體、胸腺、輸卵管、卵巢等[13]，影響其變化的因素很多。對SST表達有調(diào)節(jié)作用的細胞內(nèi)因子主要有Ca2+、cAMP、cGMP和NO。其中，cAMP對SST表達和分泌都有促進作用,因而是調(diào)節(jié)SST功能最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在本組實驗中SST沒有變化，提示我們這些因素可能沒有受到影響，或是各種變化的因素之間相互抵消了引起SST的變化。SSTR結(jié)構(gòu)上是完整的糖蛋白，通過G蛋白與腺苷酸環(huán)化酶、鉀離子通道、鈣離子通道相偶聯(lián),作用于細胞內(nèi)相應(yīng)的效應(yīng)系統(tǒng)[14]。SSTR的表達下降是否是非甾體消炎藥影響了其與G蛋白的偶聯(lián)或是非甾體消炎藥對腸黏膜的損傷，破壞了其完整的蛋白結(jié)構(gòu)，有待我們進一步研究。

NSAIDs廣泛用于臨床，可以有不同的用藥途徑，不同的用藥途徑之間有沒有差別呢？從本實驗數(shù)據(jù)還可觀察到，在不同方法處理組之間生長抑素受體的表達不完全相同，與空白對照組比較，腹腔注射組SSTR1、SSTR2、SSTR3的表達較空白對照組降低，但沒有差異性。與灌胃組及灌腸組比較,腹腔注射組SSTR1，SSTR2及SSTR3的表達要高，有差異性。提示我們：一方面不同的給藥途徑對各型生長抑素受體的表達的影響不盡相同；另一方面，腹腔注射阿司匹林對SSTR表達的抑制作用較低是否與此種給藥途徑的阿司匹林生物利用度較低有關(guān)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示灌胃組、灌腸組的SSTR1、SSTR2、SSTR3的表達下降較腹腔注射組明顯，但是，在SSTR4和SSTR5的表達中卻沒有類似的結(jié)果，其原因還有待我們進一步的思考及研究。

綜上所述，NSAIDs(阿司匹林)不同給藥途徑均可導(dǎo)致大鼠小腸黏膜損害，損傷程度可能與藥物的種類、劑型及用藥時間相關(guān)。各型SSTR在小腸黏膜重疊表達，以SSTR1、SSTR2為主。NSAIDs可以使各型SSTR的表達下降，減弱SST的作用，從而破壞腸道黏膜屏障功能，造成腸道黏膜的損傷，引起相應(yīng)的臨床癥狀。不同的給藥途徑對SSTR的影響不盡相同，提示我們可否通過提高SSTR的表達或者采用不同的給藥方式減少腸道損傷的發(fā)生。通過本研究也給我們提出了新的問題：SSTR可能受到了什么樣的影響？是什么因素造成了不同的給藥途徑對各型SSTR的影響不一致？不同的給藥途徑的阿司匹林生物利用度是否受影響？通過人為的干預(yù)SSTR的表達是否能達到預(yù)防NSAIDs對小腸黏膜的損害預(yù)期？這些問題都有必要進一步深入研究。

參考文獻：

[1]Chiu CJ,Mcardle AH,Brown R,etal.Intestinal mucosal lesion in low-flow states.I.A morphological,hemodynamic,and metabolic reappraisal[J].Arch Surg,1970,101(4):478-483.

[2]Maiden L,Thjodleifsson B,Theodors A,etal.A quantitative analysis of NSAID-induced small bowel pathology by capsule enteroscopy[J].Gastroenterology,2005,128(5):1172-1178.

[3]Graham DY,Opekun AR,Willingham FF,etal.Visible small-intestinal mucosal injury in chronic NSAID users[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2005,3(1):55-59.

[4]Thiefin GL.Toxic effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs on the small bowel,colon,and rectum[J].Joint Bone Spine,2005,72(4):286-294.

[5]Ballian N,Brunicardi FC,Wang XP.Somatostatin and its receptors in the development of the endocrine pancreas[J].Pancreas,2006,33(1):1-12.

[6]Bates CM,Kegg H,Grady S.Expression of somatostatin receptors 1 and 2 in the adult mouse kidney[J].Regul Pept,2004,119(1/2):11-20.

[7]Mastrodimou N,Thermos K.The somatostatin receptor (sst1) modulates the release of somatostatin in rat retina[J].Neurosci Lett,2004,356(1):13-16.

[8]Adebayo D,Bjarnason I.Is non-steroidal anti-inflammaory drug (NSAID) enteropathy clinically more important than NSAID gastropathy?[J].Postgrad Med J,2006,82(965):186-191.

[9]譚慶華,范華,吳浩,等.生長抑素對獼猴小腸黏膜漿細胞分泌IgA的影響[J].中國藥理學(xué)通報,2007,23(12):1560-1564.

[10]Szepeshazi K,Schally AV,Nagy A,etal.Preclinical evaluation of therapeutic effects of targeted cytotoxic analogs of somatostatin and bombesin on human gastric carcinomas[J].Cancer,2003,98(7):1401-1410.

[11]Virgolini I,Traub T,Leimer M,etal.New radiopharmaceuticals for receptor scintigraphy and radionuclide therapy[J].Q J Nucl Med,2000,44(1):50-58.

[12]鄭桐,楊天飛,車筑平,等.阿司匹林對SD大鼠小腸內(nèi)源性保護因素影響的初探[J].中國免疫學(xué)雜志,2014,30(6):726-730.

[13]Patel YC.Somatostatin and its receptor family[J].Front Neuroendocrinol,1999,20(3):157-198.

[14]Bousquet C,Puente E,Buscail L,etal.Antiproliferation effect of somatostatin and analogs[J].Chemotherapy,2001,47(2):30-39.

[收稿2015-05-15修回2015-09-15]

(編輯許四平)----------------------------------------------

Effect of aspirin on somatostatin receptors level in SD rat′s intestinal mucosa

YANGTian-Fei，ZHENTong，TANQing-Hua,CHEZhu-Ping.TheFirstAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,China

[Abstract]Objective:To investigate the optimal administration approach of using aspirin by observing the effects of the rats intestinal mucosal barrier and somatostatin receptors level with different administration approaches of using non-steroid anti-inflammatory drugs-aspirin.Methods: 32 SD rats were randomly divided into 4 groups:oral intake group,enema group,intraperitoneal injection group and control group.Every group had 8 rats.The ileum mucosal injury was scored.The level and distribution of SSTRs in every group was detected by ELISA and immunohistochemistry,respectively,The IOD score in each group was measured by image analysis.Results: (1) The scores of ileum mucosal injury in aspirin experimental groups were significantly higher than that in control group (P<0.05),but there were no difference among aspirin experimental groups.(2) All subtypes of SSTR were expressed in rat intestinal mucosa.However,SSRT1 and SSTR2 were expressed mainly(P<0.05).(3) The expressions of SSTR1-5 on intestinal mucosa in aspirin experimental groups were significantly less than that in control group (P<0.05).(4) There was incompletely no same effects of SSTR1-5 in intestinal mucosa by different approaches (P<0.05).(5) There were no significant difference of SST concentration and IOD score among all groups (P>0.05).Conclusion: Aspirin can damage the rat intestinal mucosa.Aspirin could lead to the decrease of SSTR1-5 expression in the intestinal mucosa.All subtypes of SSTR in rat small intestine mucosa were expressed,suggesting that aspirin could affect the barrier function of the intestine.There were different influences on SSTR1-5 expression by different administration approaches，suggesting aspirin by parenteral approach may reduce the intestinal damage.

[Key words]Intestinal Mucosa；Aspirin；SSTR1-5；Approach

通訊作者及指導(dǎo)教師：譚慶華(1968年-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事消化內(nèi)鏡研究，現(xiàn)工作于四川華西大學(xué)醫(yī)院，E-mail:tanqh2007@163.com。

作者簡介：楊天飛(1975年-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事消化內(nèi)科及消化內(nèi)鏡研究，現(xiàn)就職于貴州省貴陽市貴航貴陽醫(yī)院，E-mail:1046567047@qq.com。

中圖分類號R574.53

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0178-06