李鳳磊　郝曉磊　田志剛

(中國科技大學(xué)免疫學(xué)研究所, 合肥230027)

·專家述評·

HBV小鼠模型與肝臟免疫學(xué)研究進(jìn)展

李鳳磊郝曉磊田志剛

(中國科技大學(xué)免疫學(xué)研究所, 合肥230027)

[摘要]乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus， HBV)嚴(yán)重威脅人類健康，免疫紊亂是主要病理學(xué)機(jī)制。由于HBV不能自然感染小鼠，研究者試圖創(chuàng)建HBV小鼠模型，以模擬HBV的免疫病理學(xué)過程。本文將介紹各種HBV小鼠模型的構(gòu)建方法，包括HBV轉(zhuǎn)基因技術(shù)、HBV病毒活體肝臟靶向轉(zhuǎn)染技術(shù)以及HBV自然感染人源化小鼠技術(shù)等，同時還分析了各HBV小鼠模型的優(yōu)缺點、利用這些模型所解決的一系列免疫學(xué)問題，以及該領(lǐng)域的發(fā)展展望。

[關(guān)鍵詞]乙型肝炎病毒；小鼠模型；轉(zhuǎn)基因；人源化；病毒免疫

李鳳磊(1986年-)，博士后研究員。2008年和2013年于中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)分別獲得理學(xué)學(xué)士和理學(xué)博士學(xué)位，主要從事肝臟免疫微環(huán)境和肝腸作用機(jī)制的研究。主要成果發(fā)表于Gastroenterology、J Immunol、Cell Mol Immunol等學(xué)術(shù)刊物。以第一負(fù)責(zé)人主持國家自然科學(xué)青年基金、中國博士后科學(xué)基金和中國博士后特別資助基金等。

田志剛(1956年- ),中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授、博士生導(dǎo)師,現(xiàn)任中國科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)研究所所長、中國免疫學(xué)會理事長、中國免疫學(xué)會英文會刊(Cell Mol Immunol)執(zhí)行主編、中文會刊《中國免疫學(xué)雜志》主編。2001 年國家杰出青年獲得者、2007 年教育部創(chuàng)新團(tuán)隊負(fù)責(zé)人、2008 和2011 年國家基金委《天然免疫與重大疾病發(fā)生發(fā)展》創(chuàng)新群體負(fù)責(zé)人、2008 年國家自然科學(xué)二等獎(首位)、2011 年國家科技進(jìn)步二等獎(第二位)。主要從事天然免疫和肝臟免疫學(xué)研究,以通訊作者在Cell、Nat Immunol、Immunity、J Clin Invest、J Exp Med、PNAS、Nature Commun、Gastroenterology、Hepatology、J Allergy Clin Immunol、PloS Pathogen、J Hepatol等SCI 收錄的國外雜志發(fā)表論文220篇。

1簡介

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)HBV是一種嗜肝性病毒，全世界約有20億人感染過HBV，其中3億會成為慢性HBV攜帶者并最終發(fā)展成肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌，每年有超過60萬人死于慢性HBV感染，因此HBV感染是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1]。

HBV基因組是約3.2 kb的雙鏈松散環(huán)狀DNA，包含一條完整的負(fù)義鏈以及部分的正義鏈。HBV感染肝細(xì)胞后，不穩(wěn)定的rcDNA (relaxed circular DNA)會形成穩(wěn)定的共價閉合環(huán)狀DNA (covalently closed circular DNA， cccDNA)，cccDNA可以轉(zhuǎn)錄出不同長度的mRNA，進(jìn)而翻譯成HBV各組分蛋白，包括表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)、e抗原(Hepatitis B virus e antigen， HBeAg)、核心抗原(Hepatitis B virus core antigen， HBcAg)和X抗原(Hepatitis B virus X antigen，HBxAg)，進(jìn)而包裝成新的病毒顆粒釋放到細(xì)胞外[2]。在HBV感染、誘導(dǎo)耐受以及致病的過程中免疫系統(tǒng)發(fā)揮著巨大的作用，因此HBV相關(guān)的免疫學(xué)研究極為重要。

1.1肝臟免疫應(yīng)答肝臟是人體最大的代謝器官，也是典型的天然免疫優(yōu)勢器官[3]。肝臟有特殊的血供，其70%的血液由肝門靜脈提供，其中富含食物抗原和腸道微生物代謝產(chǎn)物。動脈血與靜脈血在血管壁疏松的肝竇處混合，并通過肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC, liver sinusoidal endothelial cell)與肝實質(zhì)發(fā)生廣泛的物質(zhì)交換。肝臟中存在著大量的天然免疫細(xì)胞，包括枯否細(xì)胞(Kupffer cell)、樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell， DC)、自然殺傷細(xì)胞(Natural Killer cell， NK cell)、自然殺傷T細(xì)胞(Natural Killer T cell， NKT cell)[4]；另一方面，肝臟中表達(dá)高濃度的負(fù)調(diào)性細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)；肝臟同時也高表達(dá)抑制性受體，比如程序性死亡配體(Programmed death ligand 1, PD-L1)以及細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)等[5]。這種獨特的生理結(jié)構(gòu)和免疫細(xì)胞組成使得肝臟一方面可以清除病原體，另一方面，又可對食物來源的抗原以及部分嗜肝性病毒形成耐受。

1.2HBV免疫應(yīng)答的研究模型HBV宿主具有嚴(yán)格的種屬限制，除人類外，黑猩猩和樹鼩也可以被HBV病毒感染，但是黑猩猩只能形成急性的HBV感染，不能形成慢性攜帶[6]，樹鼩模型則沒有清晰的免疫學(xué)背景，無法進(jìn)行免疫學(xué)研究[7]。

實驗小鼠是一種成熟的免疫學(xué)研究工具，但是其不能被HBV自然感染，因此研究者通過轉(zhuǎn)基因、肝臟靶向性轉(zhuǎn)染和構(gòu)建人源化小鼠的方法，構(gòu)建了多種用于免疫學(xué)研究的HBV的小鼠模型(圖1)，接下來將從模型構(gòu)建和免疫學(xué)應(yīng)用兩個方面對其進(jìn)行總結(jié)。

2HBV小鼠模型的構(gòu)建歷史

HBV轉(zhuǎn)基因(HBV transgenic，HBV-Tg)小鼠為了研究HBV各組分蛋白在感染過程中的作用， Chisari[8]和Babinet等[9]在1985年首先構(gòu)建了初代的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，他們將HBV基因組片段加載于不同的質(zhì)粒中，并通過胚胎注射將該片段與啟動子序列同源重組于小鼠的基因組上，使其能夠表達(dá)HBsAg和HBx蛋白。隨后，HBV其他組分的轉(zhuǎn)基因小鼠也相繼問世[10]，例如Burk等[11]構(gòu)建的HBV small S轉(zhuǎn)基因鼠，Koike等[12]構(gòu)建的HBx轉(zhuǎn)基因鼠，Milich等[13]構(gòu)建的HBeAg轉(zhuǎn)基因鼠，Guidotti等[14]構(gòu)建的HBcAg轉(zhuǎn)基因鼠等等。Chisari等[15]在1986年構(gòu)建了一種利用Alb啟動子實現(xiàn)肝臟特異性表達(dá)HBV組分的轉(zhuǎn)基因鼠，其只有肝臟高表達(dá)HBV large S蛋白。該小鼠因為其肝細(xì)胞表型變化及免疫耐受狀態(tài)跟人類HBV患者相似，而被得到廣泛應(yīng)用[16,17]。不過隨著周齡的增長，該小鼠會逐漸降低其HBsAg表達(dá)，隨之其肝炎水平也會逐步下降，其機(jī)制可能和DNA甲基化相關(guān)[18]。Chisari研究組[19，20]進(jìn)一步成功構(gòu)建了HBV全病毒轉(zhuǎn)基因鼠，重組1.3倍的HBV基因組于小鼠基因組中可以使其表達(dá)HBV的全部組分，并包裝出完整的HBV病毒顆粒，該毒顆粒在電子顯微鏡下觀察與HBV病毒顆粒無差別，且對黑猩猩具有感染性。

HBV轉(zhuǎn)基因小鼠極大地促進(jìn)了HBV病毒學(xué)的研究，它揭示了HBV各組分在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與合成途徑[14]。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠是第一種建立在近交系小鼠上的模型，有清晰的免疫學(xué)背景，便于免疫機(jī)制探索和實驗干預(yù)，相較于樹鼩和黑猩猩模型有巨大的優(yōu)勢[21,22]。HBV轉(zhuǎn)基因鼠在胚胎期即開始表達(dá)HBV成分并形成先天免疫耐受，實驗者必須重建HBV特異性免疫應(yīng)答或使獲得性免疫缺陷來間接研究HBV免疫應(yīng)答[23,24]。盡管如此，強(qiáng)免疫佐劑依然可以誘導(dǎo)該小鼠產(chǎn)生HBV特異性免疫應(yīng)答，并使其HBV抗原表達(dá)降低，這對現(xiàn)有的T細(xì)胞選擇學(xué)說是一個挑戰(zhàn)[25]。

HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型也有先天的不足。首先，它不能用于研究HBV病毒感染肝細(xì)胞的過程；其次，cccDNA對HBV慢性攜帶狀態(tài)的形成至關(guān)重要[26]，但HBV轉(zhuǎn)基因小鼠不具有cccDNA，不能用于研究cccDNA與免疫系統(tǒng)的相互作用。

2.1高壓注射介導(dǎo)的HBV攜帶小鼠為了解決HBV轉(zhuǎn)基因鼠對HBV中樞耐受的問題，使小鼠在成年期攜帶HBV的模型被逐漸建立。Feitelson等[27]首先將3.2 kb的HBV基因組直接肝內(nèi)注射給獲得性免疫缺陷的Nude小鼠，在小鼠血清中觀察到長達(dá)7個月的HBsAg表達(dá)，然而因為免疫缺陷，Nude小鼠不能用于免疫學(xué)研究。

Chisari研究組[28,29]嘗試用高壓注射的方法將pT-MCS-HBV1.3質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠肝臟，該質(zhì)粒只能在正常小鼠體內(nèi)存在7 d，而獲得性免疫缺陷的NOD-SCID小鼠則可以維持HBV1.3表達(dá)長達(dá)60 d，這說明免疫系統(tǒng)會限制該質(zhì)粒在成年小鼠肝臟中的表達(dá)。

陳定信研究組[30]在2006年換用了不同的質(zhì)粒骨架，構(gòu)建了pAAV-HBV1.2高壓注射小鼠模型， 60%的C57BL/6小鼠可以維持表達(dá)該質(zhì)粒超過20周，而BALB/c小鼠則不能形成攜帶，替換載體骨架也不能形成HBV長期表達(dá)，說明機(jī)體免疫狀態(tài)和載體效應(yīng)共同決定著HBV載體的表達(dá)。

小鼠體內(nèi)無法自然形成HBV cccDNA，藍(lán)柯研究組[31]用高壓注射的方法將loxP-Cre系統(tǒng)導(dǎo)入到小鼠肝臟，并剪接出rcccDNA以模擬HBV病毒的持續(xù)攜帶?？墒?，經(jīng)過剪切的rcccDNA中仍有殘留的loxP位點，進(jìn)而導(dǎo)致HBV聚合酶和 Large S蛋白不能正常轉(zhuǎn)錄翻譯，因此HBV-cccDNA模型小鼠還需要進(jìn)一步優(yōu)化。

高壓注射方法構(gòu)建的HBV小鼠模型容易操作，可以利用不同的質(zhì)粒骨架誘導(dǎo)急性的HBV排斥和慢性HBV耐受，后者也非常適合用于抗HBV藥物的篩選[32]。然而，高壓注射模型誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答多是針對載體本身而不是HBV，并且該模型不能模擬HBV自然感染過程且感染效率低(約5%~10%)，從而限制了其研究的意義。

2.2載體介導(dǎo)的HBV攜帶小鼠為了提高HBV感染小鼠的效率，腺病毒載體(Adenovirus, Ad)和腺相關(guān)病毒載體(Adenovirus associated virus，AAV)被用來將HBV基因組帶入到肝實質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，從而形成了載體介導(dǎo)的HBV攜帶小鼠[33]。

Protzer教授研究組[34]首先運用加載了1.3倍HBV基因組的腺病毒尾靜脈感染小鼠，1×109i.u高劑量感染使小鼠持續(xù)表達(dá)HBV病毒蛋白組分長達(dá)2個月，并伴隨著高滴度的HBV DNA。而1×108i.u的低劑量腺病毒更可誘導(dǎo)長達(dá)100 d以上的HBV持續(xù)感染(HBsAg，HBeAg滴度均持續(xù)高于100 U/ml)，且不引起體內(nèi)抗表面抗原抗體(anti-HBs)的產(chǎn)生[35]。類似的，腺相關(guān)病毒也可將HBV基因組導(dǎo)入成年小鼠肝臟，并誘導(dǎo)慢性HBV攜帶及HBsAg和HBeAg持續(xù)性高表達(dá)[36, 37]。近來，AAV8也被成功用于1.2 kb HBV基因組的轉(zhuǎn)染，其成功誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生長達(dá)6個月的HBV抗原，尤為重要的是，該模型小鼠可自然產(chǎn)生肝纖維化并伴隨膠原沉積和TGF-β上調(diào)[38]。值得注意的是，腺病毒載體還可以激活免疫系統(tǒng)，非復(fù)制型腺病毒作為載體表達(dá)HBV核心蛋白及修飾后的聚合酶，成功激活了HBV耐受小鼠的HBV特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答[39]。因此，載體介導(dǎo)的HBV肝臟靶向轉(zhuǎn)染模型中的免疫應(yīng)答大多也是由載體本身決定，這仍舊限制著免疫學(xué)研究的深入。

2.3肝臟人源化小鼠常規(guī)HBV小鼠模型由于種屬限制性，仍然不具有HBV感染過程、cccDNA的形成以及HBV的擴(kuò)散等。最合適的HBV研究靶標(biāo)仍舊是人肝實質(zhì)細(xì)胞，但是人原代肝實質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中會逐漸丟失HBV的受體鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)而無法再被HBV感染[40]。因此，研究人員嘗試將人的肝實質(zhì)細(xì)胞移植入小鼠體內(nèi)，以使人其維持正常的生理活性，然后再被HBV體內(nèi)感染。

Ilan等[41]首先對SCID小鼠重建小鼠免疫系統(tǒng)，后將HBV病毒感染過人肝組織移植到該小鼠的腎包膜下，構(gòu)建成了第一個人源化肝臟的HBV小鼠模型，該模型中HBV可以持續(xù)存在約20 d，但是滴度非常低。

近年來，肝臟替代的人源化小鼠模型得到了飛快的發(fā)展，三種肝臟自發(fā)或者被誘導(dǎo)凋亡的小鼠模型陸續(xù)被構(gòu)建。其中應(yīng)用最廣泛的是uPA/SCID小鼠，該小鼠是在肝臟特異性Alb啟動子下表達(dá)uPA基因，造成小鼠肝細(xì)胞的自發(fā)死亡[42]。uPA小鼠與SCID小鼠雜交后獲得T/B細(xì)胞缺失的uPA/SCID小鼠以便于外源的人肝細(xì)胞的植入[43]。uPA轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育比較困難，技術(shù)要求高，因此鄧宏魁研究組[44]利用Tet on系統(tǒng)構(gòu)建了Ad.TRE-uPA/SCID小鼠，實現(xiàn)了可控的肝臟死亡，優(yōu)化了uPA小鼠系統(tǒng)。延胡索二酰乙酰乙酸水解酶(Fumarylacetoace-tate hydrolase，F(xiàn)ah)是酪氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，F(xiàn)ah缺陷會導(dǎo)致代謝產(chǎn)物在肝細(xì)胞中積累，引發(fā)小鼠肝細(xì)胞的死亡[45]。Azuma等[46]將Fah缺陷鼠與Rag2-/-γc-/-鼠雜交后獲得免疫系統(tǒng)重度缺陷的FRG缺陷鼠，人來源的肝細(xì)胞在其中達(dá)到了80%以上的高比例重建。在肝臟人源化FRG小鼠中，HBV感染效率高達(dá)50%~80%，宿主肝細(xì)胞呈現(xiàn)HBcAg和Fah雙陽性[47]。TK-NOG模型是在NOD/SCID/γc-/-小鼠中轉(zhuǎn)入Ⅰ型單純皰疹病毒胸苷激酶(TK)，這種小鼠在無毒性劑量的GCV作用下會自發(fā)肝細(xì)胞的死亡，為人源化細(xì)胞的植入騰出了空間[48]。TK-NOG人源小鼠也可以構(gòu)建出高比例的人源化肝臟，并使HBV在小鼠體內(nèi)完成完整的生命周期，以用于科學(xué)研究與藥物測試[49]。以上模型小鼠均不具有人免疫系統(tǒng)，因此研究者嘗試?yán)酶闻K和免疫系統(tǒng)雙人源化來解決這一問題[50-52]。雙人源化小鼠模型已經(jīng)獲得了初步的成果，對NOG小鼠同時轉(zhuǎn)輸HBV感染的人肝實質(zhì)細(xì)胞和人HBV特異性的CTL細(xì)胞，成功誘導(dǎo)出HBV特異性的肝炎模型，并用于人免疫耐受機(jī)制的研究[53]。

肝臟人源化小鼠模型相較于其他的小鼠模型有明顯的優(yōu)勢，即其有完整的HBV感染和復(fù)制的過程，該模型現(xiàn)在已用于固有免疫系統(tǒng)抗HBV功能的研究以及高親和力抗體的篩選[54，55]，但是其系統(tǒng)構(gòu)建過于復(fù)雜且不穩(wěn)定。人肝實質(zhì)細(xì)胞的來源是其限制因素之一，而iPS誘導(dǎo)成肝細(xì)胞的研究為該問題提供了解決思路[56]。雖然人源化小鼠的肝實質(zhì)細(xì)胞來源于人類，但是其他參與HBV疾病進(jìn)程的細(xì)胞，比如Kupffer細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、星形細(xì)胞等，依然無法被人源化取代，這也限制了其科學(xué)意義。

3基于HBV小鼠模型的免疫學(xué)研究

3.1免疫防御免疫系統(tǒng)對HBV的防御作用直接體現(xiàn)于HBV高壓注射模型中，正常小鼠在注射HBV DNA后會在 2~3周內(nèi)會徹底清除HBV；但是獲得性免疫細(xì)胞和NK細(xì)胞缺陷的小鼠可以被HBV持續(xù)感染長達(dá)81 d[28]。

天然免疫系統(tǒng)中抗HBV免疫應(yīng)答最典型的代表是Ⅰ型干擾素家族。IFN-α與其受體結(jié)合以后會活化胞內(nèi)Jak/Stat途徑，進(jìn)而啟動下游一系列干擾素刺激基因(IFN-stimulated gene，ISG)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，ISG可以限制胞內(nèi)病毒的復(fù)制。對Upa/scid/beige小鼠進(jìn)行長期的IFN-α處理，可以誘導(dǎo)其ISG表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)，并最終導(dǎo)致HBsAg和HBeAg表達(dá)的顯著下調(diào)[57]。在體外培養(yǎng)體系和人源化小鼠的研究發(fā)現(xiàn)IFN-α還可以通過表觀遺傳學(xué)的機(jī)制抑制HBV復(fù)制，IFN-α?xí)龠M(jìn)與cccDNA結(jié)合的組蛋白的低乙酰化，并且招募轉(zhuǎn)錄共抑制子結(jié)合cccDNA，進(jìn)而抑制HBV的復(fù)制[58]。對人源化小鼠注射病毒類似物發(fā)現(xiàn)，小鼠和人的肝實質(zhì)細(xì)胞對干擾素的反應(yīng)性并不同，人肝實質(zhì)細(xì)胞表達(dá)更高水平的IFN-λ，而表達(dá)低水平的IFN-α和IFN-β[59]，這也暗示HBV感染過程的物種差異性。

獲得性免疫系統(tǒng)在抗HBV免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)一般通過裂解殺傷被病毒感染的細(xì)胞的方式清除病毒，但是有趣的是CTL細(xì)胞卻通過一種非細(xì)胞毒性依賴的方式清除HBV病毒[60-62]。HBV特異性CTL轉(zhuǎn)輸可以有效清除HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的HBV表達(dá)，但是其并不引起肝細(xì)胞死亡，而是通過分泌IFN-γ和TNF-α來影響HBV RNA結(jié)合蛋白的穩(wěn)定性，進(jìn)而達(dá)到抑制HBV復(fù)制的目的[63]。腺病毒載體介導(dǎo)的HBV載體急性感染小鼠后7 d，血清中抗體產(chǎn)生而病毒組分消失，這直接說明了體液免疫應(yīng)答也同樣發(fā)揮著抗HBV的作用[28]。

3.2免疫耐受HBV在免疫系統(tǒng)的多個層面上誘導(dǎo)免疫耐受[64]。對HBV感染的肝臟人源化小鼠進(jìn)行IFN-α注射，8~12 h后HBV RNA下調(diào)，但是24 h后其又上調(diào)。與未感染組相比，HBV感染的肝細(xì)胞胞內(nèi)ISG，MyD88和TAO-1表達(dá)均下調(diào)，進(jìn)一步的研究表明IFN-α在HBV感染的肝細(xì)胞內(nèi)不能夠誘導(dǎo)STAT-1的核內(nèi)轉(zhuǎn)運，說明HBV直接抑制肝實質(zhì)細(xì)胞IFN-α信號[65, 66]。最近我們研究組發(fā)現(xiàn)，HBV感染會上調(diào)miRNA146a的表達(dá)，而其在HBx抑制IFN-α信號的過程中發(fā)揮著重要作用[67]。因此，我們設(shè)計了一種小干擾RNA來阻斷HBx對IFN-α的抑制[68]，其在體內(nèi)外均展示出強(qiáng)大的打破HBV免疫耐受的能力。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝實質(zhì)細(xì)胞MHC-I分子表達(dá)下調(diào)，這進(jìn)一步降低CTL和NK細(xì)胞對其識別殺傷作用，進(jìn)而造成免疫耐受[69]。最新研究表明HBV感染的肝實質(zhì)細(xì)胞表達(dá)凋亡蛋白抑制劑，從而抑制其自身凋亡而增強(qiáng)HBV耐受[70]，而利用拮抗劑阻斷這一過程可以顯著地清除HBV[71]。

HBV還可誘導(dǎo)獲得性免疫耐受，近年來隨著一種高壓注射PAAV/HBV1.2質(zhì)粒介導(dǎo)的慢性HBV攜帶小鼠模型的出現(xiàn)，該領(lǐng)域取得了迅速的發(fā)展[30]。我們研究組首先對其免疫系統(tǒng)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該HBV攜帶小鼠表現(xiàn)出與成年人類一致的感染和預(yù)免疫現(xiàn)象，即預(yù)先接受HBsAg疫苗免疫的小鼠可以抵抗HBV的慢性感染，但是如果先被HBV慢性感染，小鼠則對外周疫苗免疫無應(yīng)答并形成HBV的長期攜帶，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)這種體液免疫耐受與Kupffer細(xì)胞以及IL-10有關(guān)，Kupffer細(xì)胞或IL-10缺陷會打破該耐受[72]。有趣的是，Kupffer細(xì)胞TLR2受體可以直接接識別HBcAg，并被誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-10[73]。之后Kupffer細(xì)胞會進(jìn)一步誘導(dǎo)肝臟Ⅰ型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Type 1 regulatory T cell，Tr1 cell)產(chǎn)生IL-10，后者會遷移到引流淋巴結(jié)抑制Tfh和生發(fā)中心(Germinal center，GC)B細(xì)胞反應(yīng)，最終導(dǎo)致生發(fā)中心不能形成而阻斷體液免疫應(yīng)答[74]。這種IL-10依賴的負(fù)調(diào)作用是非常廣泛的，借助于該模型發(fā)現(xiàn)IL-10還可以直接促進(jìn)NK細(xì)胞上調(diào)表達(dá)抑制性受體NKG2A，從而使NK細(xì)胞抗病毒功能下調(diào)，促進(jìn)HBV免疫耐受[75]。Kupffer細(xì)胞誘導(dǎo)HBV免疫耐受的機(jī)制是多樣的，最新的研究表明F4/80+CD206+CD80low/+的獨特巨噬細(xì)胞亞群可以通過分泌雙調(diào)蛋白促進(jìn)肝臟Treg的抑制功能[76]。γδT細(xì)胞在HBV耐受過程中也發(fā)揮著重要作用，研究表明γδT細(xì)胞會通過分泌IL-17招募骨髓來源的抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSC)進(jìn)入肝臟，后者會抑制CTL細(xì)胞的功能，進(jìn)而增強(qiáng)HBV免疫耐受[77]。有趣的是HBsAg在體外也可以直接促進(jìn)外周血中單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為MDSC，這一過程主要通過ERK/IL-6/STAT3信號途徑實現(xiàn)[78]。針對HBV感染導(dǎo)致的CTL功能耗竭以及免疫負(fù)調(diào)，我們設(shè)計了一種同時包含免疫激活序列和干擾HBx序列的載體，其展示出高效的打破免疫耐受的功能[79]。

總之，HBV借助于自身的病毒組分以及肝臟免疫負(fù)調(diào)微環(huán)境在抗病毒免疫的各個環(huán)節(jié)阻擊免疫反應(yīng)，促進(jìn)免疫耐受。

3.3免疫反應(yīng)介導(dǎo)的肝臟疾病肝炎：HBV轉(zhuǎn)基因小鼠雖然表達(dá)HBV各組分，但是并沒有發(fā)生肝細(xì)胞損傷，這暗示HBV病毒本身并不會導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡，其相關(guān)的病理損傷可能是由免疫系統(tǒng)導(dǎo)致[80]。的確如此，給HBV轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)輸HBV特異性的CTL會導(dǎo)致其發(fā)生急性肝炎和肝細(xì)胞損傷[23]。CTL一方面通過細(xì)胞因子依賴的非細(xì)胞毒性的方式排斥HBV感染[60, 63]，另一方面，CTL還會招募其他非HBV特異性的炎性細(xì)胞誘導(dǎo)肝損傷[81]。

為了研究天然免疫細(xì)胞在HBV相關(guān)的肝損傷中的作用，多種免疫刺激劑被應(yīng)用到HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)以激活相應(yīng)免疫細(xì)胞。我們研究組[82]發(fā)現(xiàn)，TLR3(Toll like receptor 3)激動劑Poly I:C能夠促使HBV轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的肝損傷，表現(xiàn)為增高的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase， ALT)水平以及更加嚴(yán)重的肝臟炎癥病理。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對Poly I:C的易感性依賴于肝臟NK細(xì)胞分泌的IFN-γ，同時也發(fā)現(xiàn)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝實質(zhì)細(xì)胞在poly I:C刺激后會上調(diào)表達(dá)更多的IFN-γ受體。低劑量ConA注射也會誘導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生爆發(fā)性肝炎，ConA刺激會導(dǎo)致NKG2D配體Rae-1和Mult-1在HBV小鼠肝實質(zhì)細(xì)胞中大量表達(dá)，兩者進(jìn)而通過NKG2D活化NK細(xì)胞，導(dǎo)致NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎發(fā)生[16]，相應(yīng)的，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠具有特有的免疫負(fù)反饋機(jī)制，其肝臟Treg細(xì)胞通過表達(dá)模型的TGF-β和OX40來抑制NK細(xì)胞的過度活化[83]。肝再生是一個免疫系統(tǒng)參與的過程，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠小鼠表現(xiàn)出明顯低下的肝再生能力。肝切除手術(shù)之后，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟會大量聚集活化的NKT細(xì)胞抑制肝再生，當(dāng)阻斷CD1d-NKT的交互作用后，其肝再生能力得到恢復(fù)[84]。

免疫系統(tǒng)攻擊導(dǎo)致肝炎在人源化小鼠中也得到了驗證。對uPA/SCID人源化小鼠構(gòu)建人肝實質(zhì)細(xì)胞后，對其轉(zhuǎn)輸半相合的PBMC細(xì)胞，隨之則發(fā)現(xiàn)了明顯的人免疫細(xì)胞的侵潤和NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝細(xì)胞再生受損，而當(dāng)對其注射anti-Fas抗體或者清除DC細(xì)胞后可以顯著抑制人肝實質(zhì)細(xì)胞的死亡[85]。肝臟人源化小鼠感染HBV后會大量表達(dá)NK細(xì)胞依賴的Ifng基因，并導(dǎo)致肝實質(zhì)細(xì)胞甲基化基因大量增多，而這些甲基化基因和肝細(xì)胞壞死及肝癌相關(guān)[86]。

3.4肝纖維化HBV轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)產(chǎn)生肝纖維化，CCL4會加速此進(jìn)程的發(fā)生，機(jī)制研究表明HBV轉(zhuǎn)基因小鼠NKT細(xì)胞過度活化并釋放細(xì)胞因子IL-4和IL-13，后者會活化肝臟星形細(xì)胞(Hepatic stellate cell，HSC)，并最終導(dǎo)致膠原沉積和肝纖維化[87]。最新研究則表明TGF-β-CD147正反饋途徑在此過程中也發(fā)揮著重要的作用，TGF-β通過Smad2、Smad3和Smad4上調(diào)CD147表達(dá)，而CD147則可以通過ERK1/2和Sp1上調(diào)HSC表達(dá)α-SMA、膠原酶-I以及TGF-β[88]。IL-22也參與該過程，在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中，阻斷IL-22信號可以顯著降低CXCL10和CCL20的表達(dá)，進(jìn)而降低Th17細(xì)胞的招募，降低肝臟炎癥和纖維化的發(fā)生[89]。

HBV誘導(dǎo)肝纖維化的進(jìn)程和機(jī)制在人源化小鼠中也得到了進(jìn)一步的驗證和解析。對免疫缺陷的A2/NSG小鼠同時重建人造血干細(xì)胞和肝細(xì)胞，即A2/NSG-hu HSC/Hep小鼠，HBV感染該小鼠成功模擬出了人類的免疫反應(yīng)、慢性肝炎以及肝纖維化[90]。該人源化小鼠肝纖維化中觀察到了大量的人類M2型巨噬細(xì)胞，而基因分析發(fā)現(xiàn)后者與人類HBV患者肝纖維化和肝壞死相關(guān)[90]。

3.5肝癌免疫反應(yīng)會誘導(dǎo)HBV相關(guān)的肝癌。最典型的證據(jù)是Chisari研究組1998年基于HBV轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行的免疫系統(tǒng)重建的模型。對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(lineage 107-5)進(jìn)行胸腺摘除和輻照處理以破壞其對HBV耐受的免疫系統(tǒng)，然后再對該小鼠進(jìn)行正常小鼠來源的骨髓重建，同時轉(zhuǎn)輸HBsAg疫苗免疫過的正常小鼠的脾臟細(xì)胞，該細(xì)胞進(jìn)入HBV轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)后會持續(xù)攻擊HBV表達(dá)的肝實質(zhì)細(xì)胞，形成持續(xù)的肝炎和肝纖維化，并最終在17個月后全部發(fā)展成肝癌[91]。在HBV特異性CTL細(xì)胞招募到肝臟的過程中，血小板發(fā)揮著重要的作用，利用阿司匹林和氯吡格雷抑制血小板，可以顯著地降低肝臟中HBV特異性CTL細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而降低肝炎、肝纖維化和肝癌的發(fā)生[92]。事實上，非特異性的免疫攻擊也可以導(dǎo)致HBV相關(guān)的癌癥，CD137是CTL細(xì)胞表面重要的共刺激受體，CD137激活抗體可以顯著活化HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中非特異性的CTL細(xì)胞分泌IFN-γ，進(jìn)而激活Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α,IL-6和MCP-1促進(jìn)肝硬化和肝癌的發(fā)生[93]。雖然炎癌變過程中肝細(xì)胞內(nèi)的信號途徑還不是很清楚，但是有證據(jù)表明炎性信號可能誘導(dǎo)了肝細(xì)胞上調(diào)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子c-JUN/AP-1進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞成瘤[94]。

4展望

HBV特異性細(xì)胞受體NTCP的發(fā)現(xiàn)為HBV小鼠模型的建立提供了新的契機(jī)。李文輝課題組[95]發(fā)現(xiàn)HBV preS1肽段可以特異性地與NTCP結(jié)合，后者在人類原代肝實質(zhì)細(xì)胞中大量表達(dá)。借助于這一理論突破，轉(zhuǎn)染了NTCP的人肝癌細(xì)胞系能夠成功地被HBV感染，NTCP轉(zhuǎn)染的小鼠肝實質(zhì)細(xì)胞仍然不能夠被HBV感染[96,97]。研究表明這種限制可能發(fā)生在病毒進(jìn)入細(xì)胞以后和病毒轉(zhuǎn)錄之前的階段，而這可能和一些特定的僅存在于人類肝實質(zhì)細(xì)胞而不存在于鼠類肝實質(zhì)細(xì)胞中的因子有關(guān)[98]。表達(dá)人NTPC的小鼠細(xì)胞系不能被HBV感染，但是和人肝癌細(xì)胞系HepG2融合后的小鼠細(xì)胞系均可被HBV感染，另一方面對小鼠細(xì)胞系導(dǎo)入cccDNA模擬分子也可以使后者成功表達(dá)HBV相關(guān)基因，這些實驗充分說明小鼠細(xì)胞系缺少人類肝細(xì)胞獨有的位于cccDNA上游的某個分子[99]。雖然該領(lǐng)域的研究目前進(jìn)入了瓶頸狀態(tài)，但是毫無疑問，該領(lǐng)域的突破會解釋更多的HBV感染和致病機(jī)制，也會為新的模型的構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)。

雖然人源化小鼠可以成功構(gòu)建人的肝實質(zhì)細(xì)胞，但是其他的非實質(zhì)細(xì)胞，包括LSEC、Kupffer細(xì)胞和HSC細(xì)胞很難被人源化取代。而HBV相關(guān)的病理性過程，包括肝炎、肝纖維化以及肝癌都需要肝實質(zhì)細(xì)胞和其他肝臟駐留細(xì)胞的交互作用實現(xiàn)，因此目前的人源化小鼠還很難重建人類HBV相關(guān)的疾病。目前的人源化小鼠多是基于免疫缺陷小鼠構(gòu)建，他們也不適合獲得性免疫特別是疫苗免疫學(xué)的研究。因此，肝臟免疫系統(tǒng)雙人源化小鼠需要進(jìn)一步優(yōu)化，肝細(xì)胞的取代率、病毒的感染效率以及其他組織細(xì)胞的取代都需要提高；此外，回歸基于小鼠本身免疫系統(tǒng)和組織細(xì)胞的研究，優(yōu)化成年小鼠HBV后天感染方案。

HBV小鼠模型最初多是由病毒學(xué)家構(gòu)建用以解決病毒學(xué)問題，所以，對現(xiàn)有的HBV小鼠模型的新的深入的免疫學(xué)解讀也非常重要。比如，在臨床上已經(jīng)觀察到HBx和HBV相關(guān)的腫瘤發(fā)生有著密切的關(guān)聯(lián)[100]。之后這種現(xiàn)象在HBx轉(zhuǎn)基因鼠中也得到了驗證，HBx小鼠會被DDC飲食處理誘導(dǎo)產(chǎn)生肝癌[101]。有趣的是，在該腫瘤模型誘導(dǎo)過程中同時發(fā)現(xiàn)了一系列的免疫學(xué)變化，包括血清IL-6的上調(diào)和STAT3活化等，但是這些免疫反應(yīng)在HBV相關(guān)腫瘤誘導(dǎo)過程中的具體作用還不清楚。因此，對已有HBV小鼠模型的免疫學(xué)的再分析會推動該領(lǐng)域的發(fā)展。

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[收稿2016-01-08]

(編輯許四平)

Research advances of HBV mouse model and liver immunology

LIFeng-Lei,HAOXiao-Lei,TIANZhi-Gang.InstituteofImmunology,USTC,Hefei230027,China

[Abstract]Hepatitis B virus (HBV) threatens human's health seriously, immune disorder is the main pathogenesis.HBV cannot naturally infect mouse liver, thus the researchers tried to established HBV mouse models to imitate the immunological pathogenesis of HBV infection.This review summarize various methods to establish HBV mouse models, including HBV transgenic technics, HBV in vivo liver-target transfection technics and HBV naturally infected humanized mouse technics etc.Their advantages, disadvantages and contributions to immunological studies were also analyzed, and the development of this area was also prospected.

[Key words]Hepatitis B virus;Mouse model;Transgenic;Humanized mouse;Viral immunology

中圖分類號R392

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0145-09

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.001