金　亮　張　茜　李柏青　沙　泉

(安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室及過(guò)敏與免疫研究中心，合肥230032)

評(píng)估人T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)結(jié)核桿菌脂質(zhì)抗原的免疫反應(yīng)①

金亮張茜李柏青沙泉

(安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室及過(guò)敏與免疫研究中心，合肥230032)

[摘要]目的：觀察結(jié)核桿菌脂質(zhì)的一些脂類抗原對(duì)人外周血中淋巴細(xì)胞活化和增殖的作用，進(jìn)而探討脂類抗原在結(jié)核感染中是否存在特異性的免疫作用。方法：取健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，分離誘導(dǎo)出非成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(imDC)后分別加入結(jié)核桿菌脂質(zhì)全脂質(zhì)(TLIP)、丙酮可溶性脂質(zhì)(ASLIP)、純硫脂(PSLIP)、脂阿拉伯糖(LAM)、脂甘露聚糖(LM)、同時(shí)設(shè)置非脂類抗原全菌裂解物(WCL)、培養(yǎng)分泌蛋白(CFP)、耐熱抗原(Mtb-HAg)、脂多糖(LPS)和空白對(duì)照組。用CFSE標(biāo)記自體淋巴細(xì)胞后，與被脂質(zhì)抗原刺激后的DC共培養(yǎng)。之后，用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+、NKT和 γδT)的增殖和分泌細(xì)胞因子( IFN-γ、TNF-α和 IL-4)的情況。結(jié)果：相較于空白組，所有脂質(zhì)都能促進(jìn)NKT細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖(P<0.05)。相較于空白組ASLIP，LAM和LM可以促進(jìn)非增殖的CD4+T細(xì)胞分泌IL-4，或者促進(jìn)增殖的CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ(P<0.05)。相較于空白對(duì)照組，所有脂質(zhì)抗原(除了LM)都能促進(jìn)增殖的γδT和 CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α，而LM能抑制增殖的CD8+T細(xì)胞分泌TNF-α。結(jié)論：結(jié)核桿菌脂質(zhì)抗原能激活PBMC的特異性免疫反應(yīng)，特別是CD1限制性T細(xì)胞的應(yīng)答。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核桿菌脂質(zhì)抗原；細(xì)胞因子；T淋巴細(xì)胞亞群；增殖反應(yīng)

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類生命健康的傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2014年報(bào)告，全世界估算每年新增850萬(wàn)結(jié)核患者，有約140萬(wàn)人死于結(jié)核病，中國(guó)占新增病例數(shù)的12%，僅次于印度(26%)居世界第二位[1]。目前研究表明，T細(xì)胞和其表面分子主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ和Ⅱ參與了保護(hù)性免疫在宿主對(duì)M.tb的蛋白抗原反應(yīng)中[2]。因此，很多候選的疫苗都是通過(guò)M.tb的蛋白抗原作用于免疫細(xì)胞后，誘導(dǎo)出潛在的Th1反應(yīng)[3]。雖然M.tb擁有一層獨(dú)特的，包含豐富脂類成分的細(xì)胞壁，但是，是否脂類成分能夠潛在地成為一種預(yù)防M.tb的疫苗，目前還很少有人知道。最近研究發(fā)現(xiàn)，CD1限制性T細(xì)胞識(shí)別來(lái)源于M.tb細(xì)胞壁的脂類抗原，在宿主細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)中具有極其重要的作用。CD1限制性T細(xì)胞具有與MHC限制性T細(xì)胞極其相似的功能，同時(shí)在天然免疫應(yīng)答中具有獨(dú)特的作用[4]。人類的CD1分子是一群抗原呈遞分子包含CD1a、b、c、d和e，這些分子結(jié)合脂質(zhì)，然后呈遞他們給特異性的T細(xì)胞。CD1a、b和c 主要表達(dá)在CD4+、CD8+雙陽(yáng)性的胸腺細(xì)胞內(nèi)以及外周血內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞(APC)，例如DCs、單核細(xì)胞。此外在一些B細(xì)胞亞群內(nèi)也有表達(dá)[5]。此外，來(lái)源于PBMC的非成熟DC(imDCs)通過(guò)與白介素4(IL-4)和粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)培養(yǎng)誘導(dǎo)后，能夠持續(xù)的表達(dá)這些分子[6]。目前用M.tb脂質(zhì)制作的疫苗在guinea豬內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，其在抗M.tb方面有強(qiáng)烈的保護(hù)性免疫作用[7]。同時(shí)也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD1限制性T細(xì)胞能夠通過(guò)分泌大量細(xì)胞因子(例如腫瘤壞死因子、γ干擾素等)發(fā)揮保護(hù)性免疫[8]。所以我們的研究目的是為了進(jìn)一步探究健康人群對(duì)M.tb脂類片段的免疫反應(yīng)時(shí)，T細(xì)胞亞群(γδ T 細(xì)胞、NKT 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞)發(fā)揮的功能和特性，以此來(lái)評(píng)價(jià)脂類抗原作為新型預(yù)防結(jié)核疫苗組分或者結(jié)核治療靶點(diǎn)的可能性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 M.tb抗原制備由M.tbH37Rv株制備的全菌裂解物(WCL，NR-14822)、全脂質(zhì)(TLIP，NR-14837)、丙酮可溶性抗原(ASLIP，NR-14842)、純硫脂(PSLIP，NR-14845)、脂阿拉伯糖(LAM，NR-14848)、脂甘露聚糖(LM，NR-14850)和培養(yǎng)分泌蛋白(CFP，NR-14825)均由BEI Resources，美國(guó)國(guó)家過(guò)敏和傳染病研究所(NIAID)，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院(NIH)提供。根據(jù)BEI提供的方法，我們?nèi)芙膺@些抗原按照恰當(dāng)?shù)臐舛龋瑑龃嬗?80℃?zhèn)溆?。脂多?LPS)從Sigma購(gòu)買(mǎi)，在-20℃凍存。結(jié)核桿菌耐熱抗原(M.tb-HAg)由蚌埠醫(yī)學(xué)院感染與免疫實(shí)驗(yàn)室提供，根據(jù)先前的制備方案進(jìn)行制備[9]。

1.1.2細(xì)胞的準(zhǔn)備抽取健康志愿者外周血樣品，用Ficoll液(天津生物)根據(jù)密度離心分離出PBMC，并用RPMI1640(Gibco)洗滌三次。PBMC用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力，并且計(jì)數(shù)后，用完全RPMI1640(包含10%胎牛血清，50 U/ml青霉素，均是Gibco)重懸。在培養(yǎng)箱內(nèi)，將細(xì)胞放置在塑料制的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)3 h。將非黏附PBMC分離出后，用凍存液(15%DMSO和85%完全1640)重懸后，凍存于液氮罐內(nèi)。而黏附PBMC繼續(xù)用完全1640培養(yǎng)并且加入200 U/ml 白細(xì)胞介素4(IL-4，Perprotech)和400 U/ml人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF，Perprotech)。培養(yǎng)至第3天，半量換液，補(bǔ)加同劑量細(xì)胞因子。至第6天，這些imDC用EDTA消化細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌后，計(jì)數(shù)。在培養(yǎng)前和培養(yǎng)后，我們用FCM(Verse，BD)分別檢測(cè)抗原表位CD14、CD1a和CD11c的變化。

1.2方法

1.2.1樹(shù)突狀細(xì)胞成熟度檢測(cè)被誘導(dǎo)成功的imDC用完全1640培養(yǎng)液重懸后，被分布在24孔板內(nèi)，50 000/孔。每孔分別加入10 μg/ml (WCL、TLIP、ASLIP、LAM、LM或PSLIP)，5 μg/ml (CFP 或M.tb-HAg )和 1 μg/ml LPS以及空白對(duì)照組。在培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)2 d后，取樣，用FCM檢測(cè)細(xì)胞的抗原表位標(biāo)志CD83。

1.2.2T細(xì)胞亞群的增殖和分泌細(xì)胞因子的檢測(cè)非黏附的PBMC被復(fù)蘇后用CFSE標(biāo)記(終濃度為 1 μmol/L)，用含10%人AB型血清(Gibco)的完全1640[10]重懸后，按照20∶1比例分別放入被抗原刺激過(guò)的DC培養(yǎng)孔內(nèi)(終濃度為1 000 000/孔)。在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)9 d，每3 d半量換液，并加入25 U/ml 白細(xì)胞介素2(IL-2，Sigma)。至第9天，培養(yǎng)孔內(nèi)加入10 ng/ml的PMA(Phorbo 12-myristate 13-acetate，Sigma)和500 ng/ml 的IM(Ionomycin，Sigma)，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2.5 h，之后加入莫能霉素(Monesin，Sigma)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后細(xì)胞被收集洗滌后，先用流式抗體(Biolegend,Miltenyi,BD,Invitrogen 和 eBioscience)標(biāo)記CD3、CD4、CD8、γδT和NKT，室溫下避光25 min。細(xì)胞再次被洗滌后，加入透膜液(Cytoperm buffer，BD)在室溫下靜置30 min后，被透膜的細(xì)胞用流式細(xì)胞抗體IFN-γ (Biol-egend)、IL-4 (Biolegend)和TNF-α (Biolegend)胞染后，繼續(xù)在室溫下靜置30 min。處理后的細(xì)胞用PBS洗滌3次后，用含2%PFA(Paraformaldehyde )的PBS調(diào)整細(xì)胞濃度106每管細(xì)胞后，用FCM(Verse，BD)檢測(cè)。數(shù)據(jù)用Flow Jo軟件分析。單核細(xì)胞首先被圈出，接著圈出CD3+CD4+T、CD3+CD8+T和CD3+γδT 亞群細(xì)胞，之后圈出各亞群細(xì)胞在CFSE-的增殖細(xì)胞比例。同時(shí)為了確定增殖細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的比例(圖1)，我們用十字線確定CFSE-IL-4、CFSE-TNF-α或者CFSE-IFN-γ。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或者方差檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟度和分化檢測(cè)黏附細(xì)胞在IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)下，培養(yǎng)至第6天后，其表達(dá)CD14的細(xì)胞比例相較于培養(yǎng)前明顯下降，而表達(dá)CD1a的細(xì)胞比例相較于培養(yǎng)前有明顯上升。imDCs被各種抗原刺激后，用FCM檢測(cè)CD83+細(xì)胞的表達(dá)比例，相較于空白對(duì)照組(17.8±6.8)%，WCL(35.9±5.04)%、TLIP(41.8±11.8)%、SLIP(38.2±11.7)%、ASLIP(50.3±11.5)%、LAM(43.47±14.9)%、LM(40.47±2.4)%、M.tb-HAg(30.8±5)%、LPS(41.6±14.3)%均升高(圖2A、B)。

2.2T細(xì)胞亞群增殖檢測(cè)在培養(yǎng)9 d后，運(yùn)用FCM檢測(cè)被CFSE標(biāo)記過(guò)的T細(xì)胞亞群的增殖比例。我們首先發(fā)現(xiàn)CFSE-CD4+T細(xì)胞的比例在各組內(nèi)相較于空白對(duì)照組無(wú)明顯差異(P> 0.05)。其次CFSE-CD8+T 細(xì)胞的比例，相較于空白對(duì)照組(65.71±10.4)%，WCL (83.4±3.3)%、TLIP (81.95±2.3)%、AS LIP (83.9±2.52)%、PSLIP(83.57±7.1)%、LAM (78.92±4.8)%、LM(83±4.95)%、CFP (84.4±6.2)%、M.tb-HAg(83.65±5.2)%和 LPS(84.15±7.5)%均升高(P<0.05)。最后CFSE-NKT+細(xì)胞比例，相較于空白對(duì)照組(1.7±0.74)%，在WCL (3.91±0.94)%，TLIP

(3.31±0.92)%，ASLIP (2.78±1.21)%，PSLIP (3.41±0.93)%，LAM(3.66±2.1)%，LM(3.12±0.48)%，CFP(3.03±1.58)%，M.tb-HAg (3.34±1.6)%和LPS(3.6±1.8)%的比例均要高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

2.3T細(xì)胞亞群分泌IFN-γ、IL-4、TNF-α的檢測(cè)淋巴細(xì)胞經(jīng)不同的抗原刺激培養(yǎng)至9 d后，用FCM檢測(cè)分泌IFN-γ、IL-4和TNF-α的增殖部分的細(xì)胞比率。

2.3.1TNF-α分泌情況①產(chǎn)生TNF-α的CFSE-CD8+T細(xì)胞比例，相較于空白對(duì)照組(26.5±5.5)%，WCL(45.9±6.9)%、TLIP(36.5±4.4)%、ASLIP(45.9±8.2)%、PSLIP(32.7±4.8)%、LAM(34.4±7.9)%、M.tb-HAg (37.9±2.7)% 均高于空白對(duì)照組(26.5±5.5)%，但是LM組(20.3±6.7)%卻要低于空白組對(duì)照組(P<0.05)。②TNF-α的CFSE-γδT+細(xì)胞比例TLIP(24.9±5.1)%、ASLIP(30±9.3)%、PSLIP(24.3±5.6)%、LAM(24.4±11.8)%、CFP(21.98±3.6)%、LPS(21.7± 9.6)%均高于空白對(duì)照組(13.3±2.2)%(P<0.05)。CFSE-CD4+T細(xì)胞沒(méi)有任何差異(P> 0.05)(圖4)。

2.3.2IFN-γ分泌情況①產(chǎn)生IFN-γ 的CFSE- CD8+T細(xì)胞比例，相較于空白對(duì)照組(5.6±2.4)%，WCL(14.4±5.9)%、TLIP(12.3±6.5)%、ASLIP(15.3±7.3)%、PSLIP(12.2±6.6)%、LAM(16.6±6.9)%、LM(15.4±5.1)%、CFP(16.5±7.4)%、M.tb-HAg(18.9±6.1)%和LPS(13.1±5.6)%均升高(P<0.05)。②產(chǎn)生IFN-γ 的CFSE-γδT+細(xì)胞比例，相較于空白對(duì)照組(2.9±2.3)%，下列各組WCL

(12.2±7.2)%、ASLIP(12.7±7.8)%、PSLIP(13±7.7)%、M.tb-HAg (19.2±11.5)%、LM(9.6±4.8)%和LPS(12.4±5.8)% 均升高(P<0.05)。③產(chǎn)生IFN-γ的CFSE-CD4+細(xì)胞比例，相較于空白對(duì)照組(3.9±2.4)%，WCL(9.4±5.2)%、TLIP(11.2± 5.9)%、ASLIP(11.9±6.2)%、PSLIP(10±4.7)%、LAM (11.5±5.2)%、LM (10.9±7.3)%、CFP(12.3±7.5)%、M.tb-HAg(15.7±7.5)%和LPS(11.2±8.1)%均要升高(P<0.05)。所以，LM能夠促進(jìn)CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ 同時(shí)卻能抑制TNF-α的分泌(圖5)。

2.3.3IL-4分泌情況我們發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生IL-4的CFSE-CD4+T細(xì)胞比例在各組與空白對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異(P> 0.05)。但是，相較于空白對(duì)照組(10.3±2.1)%，產(chǎn)生IL-4的CFSE-CD4+T細(xì)胞比例在WCL(12.9±2)%，ASLIP(13.6±0.8)%，LAM(12.2± 1.8)%，LM(11.7±1.2)%，CFP(14.±0.7)%，M.tb-HAg(15.2±2.7)%和LPS(15.7±1.6)% 均升高(P<0.05)(圖6)。所以ASLIP、LAM和LM能夠促進(jìn)未增殖的CD4+T細(xì)胞分泌IL-4，同時(shí)促進(jìn)增殖的CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ。

3討論

M.tb富含大量的脂質(zhì)成分，且脂質(zhì)能夠涉及TB的免疫病理路徑。當(dāng)前的研究之一就是調(diào)查CD1限制性脂質(zhì)抗原成為潛在疫苗的可能性。許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，來(lái)源于M.tb細(xì)胞壁的脂質(zhì)抗原能夠被表達(dá)CD1a、b或者c的已經(jīng)受M.tb感染的APCs吞噬，進(jìn)而呈遞給分泌Th1細(xì)胞因子的T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)[4]。我們的實(shí)驗(yàn)也證明了，這些脂質(zhì)能夠促進(jìn)CTL和Th1細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α。不過(guò)我們還發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞是CFSE表達(dá)陰性的，也就是說(shuō)他們不僅受到活化，而且還大量的增殖。比如在我們的實(shí)驗(yàn)中，受脂類抗原刺激過(guò)的 CD8+T 細(xì)胞就能產(chǎn)生大量的IFN-γ和TNF-α并且發(fā)生明顯增殖。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞可以識(shí)別CD1分子，比如，一些表達(dá)Vd1-TCR的T細(xì)胞亞群能夠在缺乏外源性脂類抗原情況下，識(shí)別CD1分子和自我反應(yīng)。NKT細(xì)胞似乎有一個(gè)重要的、潛在的作用在宿主抵抗M.tb免疫反應(yīng)中。重要的是，對(duì)NKT細(xì)胞的研究能夠提供一個(gè)模板去更好的研究其他脂質(zhì)限制性T細(xì)胞在人甚至其他哺乳動(dòng)物中的作用[11,12]。但是NKT細(xì)胞的活化有兩條路徑，一條是通過(guò)外源性的抗原刺激引起的(直接活化)，而另一條則是首先DCs被脂類抗原刺激并且分泌IL-12，然后IL-12增強(qiáng)NKT細(xì)胞表面的TCR受體，從而活化NKT細(xì)胞(非直接活化)。目前，也已經(jīng)有不少證據(jù)闡明，非直接活化路徑涉及到免疫因子，這些免疫因子在許多脂類抗原免疫反應(yīng)中扮演決定性的作用[14]。因此，在我們的研究中，先檢測(cè)了被TB脂類抗原刺激后的DCs的成熟度標(biāo)志CD83，再進(jìn)一步檢測(cè)NKT細(xì)胞的增殖情況?？偠灾?，在脂質(zhì)被DC呈遞給CD1限制性T細(xì)胞后，這些T細(xì)胞能夠溶解受感染的細(xì)胞，從而能夠控制細(xì)菌的增長(zhǎng)[14]。最近的報(bào)道表明M.tb的脂質(zhì)成分在宿主抵抗M.tb的體液免疫反應(yīng)和交叉反應(yīng)中同樣也具有重要的作用[15]。我們也發(fā)現(xiàn)，脂類抗原ASLIP、LAM和LM既能夠誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分泌IL-4，同樣也能促進(jìn)Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。因此，這幾個(gè)脂質(zhì)抗原是非常值得進(jìn)一步研究的。此外，一些調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)M.tb的脂質(zhì)時(shí)，使用與我們相類似的方法中，只有在TB病人的樣本中，T細(xì)胞才能夠被刺激增殖，而健康人的樣本卻并無(wú)這樣的情況[16]。但是，我們認(rèn)為，只要適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，這些健康人的T細(xì)胞同樣能夠得到反應(yīng)。雖然本實(shí)驗(yàn)中，這些脂質(zhì)抗原可以被DC誘導(dǎo)成熟，但是不能確定這些DC具體的功能狀態(tài)，比如是否是分泌IL-12從而誘導(dǎo)Th1細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)？此外非黏附PBMC中非T細(xì)胞(例如B細(xì)胞，NK細(xì)胞等)對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)也不太明確。這些都有待進(jìn)一步的研究?？偠灾覀兊膶?shí)驗(yàn)初步表明了M.tb脂質(zhì)抗原在CD1限制性T細(xì)胞的保護(hù)性免疫反應(yīng)的這條路徑，以及它的特異性免疫反應(yīng)中具有重要的角色。

參考文獻(xiàn)：

[1]WHO.Global Tuberculosisosis Report[R].Who Reporter,2014:13-14.

[2]Scanga CA,Mohan VP,Yu K,etal.Depletion of CD4(+) T cells causes reactivation of murine persistent tuberculosis despite continued expression of interferon gamma and nitric oxide synthase 2[J].J Exp Med,2000,192(3):347-358.

[3]Gupta UD,Katoch VM,Mcmurray DN.Current status of TB vaccines[J].Vaccine,2007,25(19):3742-3751.

[4]Cohen NR，Garg S,Brenner MB.Antigen presentation by CD1 Lipids，T cells，and NKT cells in microbial immunity[J].Adv Immunol，2009，102:1-94.

[5]Gennaro De Libero1,Lucia Mori1.The T-cell response to lipid antigens of Mycobatrerium--tuberculosis[J].Front Immunol,2014，5:219-258.

[6]Sallusto F,Lanzavecchia A.Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha[J].J Exp Med,1994,179(4):1109-1118.

[7]Hiromatsu K,Dascher CC,Leclair KP,etal.Induction of CD1-restricted immune responses in Guinea pigs by immunization with mycobacterial lipid antigens[J].J Immunol,2002,169(1):330-339.

[8]Ulrichs T,Moody DB,Grant E,etal.T-cell responses to CD1-presented lipid antigens in humans with Mycobacterium tuberculosis infection[J].Infect Immun,2003,71(6):3076-3087.

[9]Li B,Bassiri H,Rossman MD,etal.Involvement of the Fas/Fas ligand pathway in activation-induced cell death of mycobacteria-reactive human gamma delta T cells:a mechanism for the loss of gamma delta T cells in patients with pulmonary tuberculosis[J].J Immunol,1998,161(3):1558-1567.

[10]金亮,張茜,沙泉.比較人AB型血清與胎牛血清在結(jié)核桿菌裂解物刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的作用[J].安徽醫(yī)藥,2015,2(2):276-279.

[11]Sille′ FC，Martin C，Jayaraman P,etal.Critical role for invariant chain in CD1d-mediated selection and maturation of Valpha14-invariant NKT cells[J].Immunol Lett,2011，139:33-41.

[12]Arora P,Foster EL,Porcelli SA.CD1d and natural killer T cells in immunity to Mycobacterium tuberculosis[J].Adv Exp Med Biol,2013,783:199-223.

[13]Felio K,Nguyen H,Dascher CC,etal.CD1-restricted adaptive immune responses to Mycobacteria in human group 1 CD1 transgenic mice[J].J Exp Med,2009,206:2497-2509.

[14]Rosat JP,Grant EP,Beckman EM,etal.CD1-restricted microbial lipid antigen-specific recognition found in the CD8+alpha beta T cell pool[J].J Immunol,1999,162(1):366-371.

[15]de los Angeles Garcia M,Borrero R,Marrón R,etal.Evaluation of specific humoral immune response and cross reactivity against Mycobacterium tuberculosis antigens induced in mice immunized with liposomes composed of total lipids extracted from Mycobacterium smegmatis[J].BMC Immunol,2013，14(Suppl 1):511-556.

[16]Shahemabadi AS,Hosseini AZ,Shaghsempour S,etal.Evaluation of T cell immune responses in multi-drug-resistant tuberculosis (MDR-TB) patients to Mycobacterium tuberculosis total lipid antigens[J].Clin Exp Immunol,2007,149(2):285-294.

[收稿2015-06-01修回2015-07-05]

(編輯倪鵬)

Evaluation of immune responses of human T lymphocyte subsets to Mycobacterium tuberculosis lipid antigens

JINLiang,ZHANGXi，LIBai-Qing,SHAQuan.DepartmentofMedicalImmunologyandAllergyandImmunologyResearchCenter,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China

[Abstract]Objective:Some antigens of M.tb to culture with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) for assaying their proliferation and activation,so as to signify whether lipid antigens of M.tb have specific immune responses in host against M.tb infection or not.Methods: We treated PBMC with several lipid antigens of M.tb to explore the ability of these antigens to activate immunity in healthy individuals.We measured and analyzed cell proliferation by labeling cells with carboxyfluorescein succinimidyl amino ester (CFSE) and subjecting them to flow cytometry (FCM).The production of IFN-γ,TNF-α and IL-4 by T cell subsets (NKT,CD4+,CD8+,and γδT) from healthy donors was analyzed by FCM after stimulation with autologous immature dendritic cells pre-cultured with M.tb lipid antigens.The tested M.tb lipid antigens were the total lipid (TLIP),Acetone-Soluble Lipids (ASLIP),Purified Sulfolipid (PSLIP),Lipoarabinomannan (LAM) and Lipomannan (LM) levels.Medium free of lipid antigens(WCL,CFP,LPS,Mtb-HAg and blank) was used as a control.Results: We found the proportion of proliferative NKT and CD8+T cells significantly increased in all lipid groups (P<0.05).ASLIP,LAM and LM promoted non-proliferative CD4+T cells to secrete IL-4 and proliferative ones to secrete IFN-γ (P<0.05).All lipid antigens promoted both proliferative γδT cells and CD8+T cells to secrete IFN-γ and TNF-α,but the proportion of TNF-α-secreting cells in these populations decreased in the LM group (P<0.05).Conclusion: Lipid antigens may affect the CD1-restricted T cells of the host to fight M.tb infection.

[Key words]M.tb lipid antigens；Cytokine；T-Lymphocyte subsets；Proliferation responses

通訊作者及指導(dǎo)教師：沙泉(1968年-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事過(guò)敏與氣道免疫方面的研究，E-mail:qsha2@163.com。

作者簡(jiǎn)介：金亮(1988年-)，男，在讀碩士，主要從事免疫學(xué)方面研究，E-mail:740133167@qq.com。

中圖分類號(hào)R329.4
①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81273245)、安徽省國(guó)際科技合作計(jì)劃(No.11030603027)。

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)02-0159-06