許瑩萍 邱學(xué)敏 桂玉燕 張 娜 王 凌

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200011)

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CD4+T細(xì)胞在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用①

許瑩萍 邱學(xué)敏 桂玉燕 張 娜 王 凌

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200011)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis,PMO)是絕經(jīng)后女性的常見病，是導(dǎo)致絕經(jīng)后女性骨折的主要原因，研究表明[1]骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率很高，僅在美國每年就有150萬例發(fā)生，同時(shí)骨折使各種并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，如帕金森病、多發(fā)性硬化癥、肺和心臟等疾病[2]。雌激素減少是絕經(jīng)后女性發(fā)生骨質(zhì)疏松最主要的原因[3]，雌激素是維持骨量的關(guān)鍵激素[4]，所以PMO是雌激素減少介導(dǎo)的骨丟失，以往雌激素補(bǔ)充療法一直是治療本病的主要治療方法，它可以縮短破骨細(xì)胞(Osteoclast，OC)壽命，減少絕經(jīng)后婦女體內(nèi)OC生成，增加OC凋亡，抑制骨重吸收。近來發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞在PMO發(fā)病中發(fā)揮重要作用，研究表明，CD4+T細(xì)胞缺陷的小鼠模型，卵巢切除術(shù)(Ovariectomy ,OVX)不能誘導(dǎo)骨丟失，但在自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cell，NK細(xì)胞)代償性分泌促破骨生成因子，如IL-17分泌增加，或重新移植CD4+T細(xì)胞后，OVX又誘導(dǎo)了骨丟失，說明CD4+T細(xì)胞在雌激素下降介導(dǎo)骨丟失中扮演至關(guān)重要的角色，本綜述旨在闡述CD4+T細(xì)胞在雌激素缺乏介導(dǎo)骨丟失中的作用，為PMO治療提供新的靶點(diǎn)。

1 CD4+T細(xì)胞調(diào)控破骨細(xì)胞-成骨細(xì)胞平衡

活化的CD4+T細(xì)胞在骨和免疫系統(tǒng)間的相互作用中扮演關(guān)鍵的角色，在維持破骨細(xì)胞-成骨細(xì)胞平衡中發(fā)揮重要作用，CD4+T細(xì)胞被認(rèn)為是在不同疾病中調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB)、OC形成及活性的關(guān)鍵細(xì)胞，如：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牙周炎、先天性腎上腺皮質(zhì)增生、骨質(zhì)疏松癥等[5]。有一類CD4+T細(xì)胞可以產(chǎn)生IL-17和TNF-α，我們稱之為TNF-α陽性的Th17細(xì)胞。在慢性炎癥如炎癥性腸病或克羅恩病時(shí)TNF-α陽性的TH17細(xì)胞遷移至骨髓，一方面可補(bǔ)充骨髓破骨細(xì)胞祖細(xì)胞[6]，另一方面也可通過表達(dá)TNF-α、IL-6、GM-CSF，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成，介導(dǎo)骨丟失[7]。體外研究表明，Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，IL-17通過誘導(dǎo)OB表達(dá)核因子κB受體激動劑配體(Ligand of receptor activator of NF-κB，RANKL)刺激OC生成，但Th1和Th2型細(xì)胞分別通過產(chǎn)生IFN-γ和IL-4抑制OC形成[8]。炎癥時(shí)，活化的CD4+T細(xì)胞可直接分泌可溶性RANKL和TNF-α，也可通過分泌IL-1、IL-6、IL-17等促骨吸收因子刺激OB和成纖維細(xì)胞，在細(xì)胞膜表面表達(dá)或分泌可溶性RANKL，促進(jìn)OC形成[7]。Won等[9]人以TallyHo/JngJ 鼠(TH鼠，2型糖尿病的多基因模型)為模型研究證實(shí)，TH鼠與野生型小鼠相比，其胸腺及淋巴結(jié)CD4+T細(xì)胞數(shù)量增多，從而顯著提高RANKL表達(dá)，增加IL-17生成，使用瘦素治療TH鼠，增強(qiáng)TH鼠CD4+T細(xì)胞IL-17基因轉(zhuǎn)錄，分泌IL-17，誘導(dǎo)RANKL表達(dá)，增加OC生成，使骨量顯著減少。體內(nèi)OC生成受OB調(diào)節(jié)，OB通過產(chǎn)生RANKL調(diào)節(jié)破骨生成?；罨腃D4+T細(xì)胞分泌的破骨細(xì)胞生成因子(Secreted osteoclastogenic factor of activated T cells，SOFAT)并不通過該途徑，SOFAT不影響OB生長及其免疫活性，不影響機(jī)體RANKL mRNA和蛋白質(zhì)水平，SOFAT在骨代謝方面的作用機(jī)制為非RANKL依賴性，SOFAT通過刺激MC3T3細(xì)胞(成骨細(xì)胞前體細(xì)胞株)分泌IL-6、IL-10和GM-CSF，激活Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3信號通路(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway，JAK/STAT3信號通路)，上調(diào)BCL2、IL-1B、IL-10、IL-22、IL2RA、IL-4、IL-6、TNFSF10和PIAS3的基因表達(dá)，抑制IL-2、IL-21、CD4、CSF3R基因表達(dá)，促進(jìn)OC形成和骨吸收，介導(dǎo)骨丟失[10]。與CD4+T細(xì)胞直接分泌促骨吸收因子相比，幼稚型和活化的CD4+T細(xì)胞也能通過分泌GM-CSF、IL-3、IFN-γ、IFN-β、IL-4、IL-10、IL-13、骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)、破骨細(xì)胞植物血凝素、分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secreted Frizzled-related proteins，sFRPs)等白介素和細(xì)胞因子,干擾RANKL-RANK信號通路，從而抑制OC形成及其功能[7,9]。例如，IL-18可通過作用于CD4+T細(xì)胞顯著增加GM-CSF的產(chǎn)量，IL-12促進(jìn)CD4+T細(xì)胞生成IFN-γ，抑制OC形成[7]。

2 雌激素對成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控

體內(nèi)骨量和骨強(qiáng)度穩(wěn)定狀態(tài)的維持依賴OB和OC的共同協(xié)調(diào)。骨質(zhì)疏松癥是一組以低骨量、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)退化、骨脆性和骨折敏感性增加為特征的系統(tǒng)性骨骼疾病[5]。女性絕經(jīng)后，體內(nèi)雌激素水平下降或缺乏，免疫系統(tǒng)紊亂，OC形成增加、活性增強(qiáng)、壽命延長，機(jī)體骨重吸收增加，使體內(nèi)骨重吸收大于骨形成，導(dǎo)致PMO發(fā)病。雌激素主要通過雌激素受體-alpha(estrogen receptor α，ERα)、雌激素受體-beta(estrogen receptor β，ERβ)及膜結(jié)合型雌激素受體發(fā)揮生物學(xué)作用。體內(nèi)雌激素水平的變化會影響OB和OC的生物學(xué)行為。

2.1 雌激素對OB生物學(xué)行為的調(diào)控 雌激素可通過多種途徑作用于OB。雌二醇(Estradiol，E2)誘導(dǎo)OB堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein 2，Bmp2)轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)OB分化[11]；有研究表明雌馬酚(一種主要的大豆異黃酮，是一種植物雌激素)，能通過ER增加OB的骨鈣素水平和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性[12]，通過激活雌激素受體-蛋白激酶C-α(estrogen receptor-protein kinase C alpha，ER-PKCα)相關(guān)信號通路促進(jìn)鼠OB增殖和分化，促進(jìn)骨形成；雌激素水平降低會擴(kuò)張骨髓基質(zhì)細(xì)胞池，促進(jìn)多能間充質(zhì)干細(xì)胞向OB前體細(xì)胞分化，提高早期OB前體細(xì)胞的增殖，刺激成骨發(fā)生，但同時(shí)又使OB活力和壽命減少，增加OB凋亡。

2.2 雌激素對OC生物學(xué)行為的調(diào)控 OC起源于骨髓造血干細(xì)胞，直接參與骨吸收，OC數(shù)量、活性、壽命的變化會直接影響機(jī)體骨平衡。巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、RANKL在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟的破骨細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用。在合適的骨髓基質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境下，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞能分化為成熟的OC[13]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血液雌激素水平下降，外周血單核細(xì)胞會自發(fā)性形成OC[14]。

在體內(nèi)，雌激素與OC關(guān)系密切，雌激素受體激活可降低OC代謝活性，E2作用于OB表面ERα，通過誘導(dǎo)OB Fas配體的轉(zhuǎn)錄間接作用于OC表面Fas，從而誘導(dǎo)OC凋亡[15]。有研究證實(shí)[16]雌激素可直接或間接影響OC形成和活性，①經(jīng)典途徑：雌激素結(jié)合于OC表面的雌激素受體，使雌激素受體構(gòu)象改變，通過細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，作用于目標(biāo)基因啟動子上的特殊雌激素反應(yīng)原件，使基因轉(zhuǎn)錄[17]，導(dǎo)致相關(guān)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的mRNA水平增加或減少，降低OC活性[18]；②非經(jīng)典轉(zhuǎn)錄途徑：雌激素-雌激素受體復(fù)合物與另外的轉(zhuǎn)錄因子、AP-1、NF-κB、SP-1共同激活，結(jié)合于非雌激素受體-雌激素位點(diǎn)，通過刺激一般轉(zhuǎn)錄機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而影響OC形成和激活[19]；③除了經(jīng)典和非經(jīng)典核通路，在破骨細(xì)胞內(nèi)，非基因組信號的啟動通過膜結(jié)合型雌激素受體和GPR30影響OC活性，它們作為急性反應(yīng)原件，可在數(shù)分鐘內(nèi)被啟動。此外，雌激素減少，通過上調(diào)骨髓細(xì)胞[20]、成骨細(xì)胞和免疫細(xì)胞[21]產(chǎn)生的前破骨細(xì)胞生成因子,使破骨細(xì)胞前體細(xì)胞增加，骨轉(zhuǎn)換增加。雌激素可刺激OPG表達(dá)，抑制RANKL表達(dá)，增加OPG/RANKL比值，通過抑制活化T細(xì)胞核因子1蛋白(Activation of T cell nucleus factor 1 protein，NFATc1)的活性抑制RANKL介導(dǎo)的OC分化[22]。雌激素可通過增加香草素受體亞家族(Transient receptor potential vanilloid，TRPV)5通道的表達(dá)，抑制RANKL介導(dǎo)的OC分化和骨吸收[23]。另外，體內(nèi)雌激素水平降低通過擴(kuò)張OC池，延長OC壽命，抑制OC凋亡，刺激骨吸收；也可通過MKK3、MKK6調(diào)節(jié)骨丟失，MKK3可直接調(diào)節(jié)OC生成，MKK6通過產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子(如：IL-1、TNF-α、IL-6)，增加OB和基質(zhì)細(xì)胞RANKL表達(dá)，促進(jìn)骨吸收或促進(jìn)單核細(xì)胞向OC分化[24]。另外，雌激素減少可直接作用于OB，使OB分泌TNF-α、RANKL、IL-6等細(xì)胞因子促進(jìn)前破骨細(xì)胞分化為OC[11]?？傊?，雌激素減少對機(jī)體的效應(yīng)是骨吸收大于骨生成。

3 雌激素通過調(diào)控CD4+T細(xì)胞調(diào)節(jié)骨代謝

PMO患者體內(nèi)雌激素減少，CD4+T細(xì)胞表達(dá)CD40L增加，一方面，促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)M-CSF、RANKL，另一方面可下調(diào)OPG，增加破骨細(xì)胞生成率。Yokoyama等[16,25]人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗CD40L的免疫球蛋白能抑制OC生成。說明CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的CD40L在OC形成中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，體內(nèi)雌激素減少使胸腺源性CD4+T細(xì)胞輸出增加，外周CD4+T細(xì)胞增加，CD4+T細(xì)胞激活，分泌TNF-α、RANKL誘導(dǎo)OC形成和骨丟失[16]。

3.1 E2通過調(diào)節(jié)Th1型、Th2型細(xì)胞因子調(diào)控骨代謝 Th1細(xì)胞是由Th0細(xì)胞在IL-12等細(xì)胞因子作用下分化而成，主要分泌IL-2、IL-12、IFN-α、IFN-γ、TNF-α等，功能為輔助細(xì)胞毒性T細(xì)胞分化，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，參與遲發(fā)型超敏反應(yīng)等。Th2細(xì)胞主要為對抗細(xì)胞外多細(xì)胞寄生蟲的免疫反應(yīng)，其主要分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子。

CD4+T細(xì)胞是雌激素介導(dǎo)骨吸收的關(guān)鍵步驟，在雌激素減少的條件下，Th1細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，TNF-α是重要的促進(jìn)骨吸收的細(xì)胞因子，可直接增強(qiáng)成熟OC的活性，增加成熟OC對重要的破骨細(xì)胞生成因子受體和RANKL反應(yīng)的敏感性，直接或間接增加OC形成和骨重吸收，或通過激活OB和基質(zhì)細(xì)胞RANKL的活性間接刺激OC生成[26,27]。另外，在雌激素缺乏的條件下，TNF-α通過肌細(xì)胞生長因子2(Myocyte enhancer factors 2 ，MEF2)轉(zhuǎn)錄刺激硬骨素的表達(dá)[28]，有研究表明硬骨素具有誘導(dǎo)OB凋亡的作用，能增加骨重吸收，減少骨形成。

雌激素減少，體內(nèi)TGF-β減少，IL-7增加，使Th1細(xì)胞表達(dá)IFN-γ增加，增加巨噬細(xì)胞反式激活蛋白(CⅡTA)的表達(dá)[29](CⅡTA是MHC Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄共刺激物，可上調(diào)巨噬細(xì)胞MHC Ⅱ的表達(dá))，使巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞抗原表達(dá)增加，激活TNF-α，同時(shí)也可使Th1細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α增加，一方面促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)RANKL激活巨噬細(xì)胞的RANKL的信號通路，增強(qiáng)RANKL在破骨細(xì)胞生成過程中的作用，另一方面使效應(yīng)CD4+T細(xì)胞增殖，促使OC分化。

機(jī)體雌激素減少，體內(nèi)前炎癥細(xì)胞因子水平發(fā)生相應(yīng)變化，如：IL-4等。雌激素促進(jìn)IL-5和IL-13的產(chǎn)生[30]。在IFN-γ或IL-4存在的情況下，RANKL和脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)都能誘導(dǎo)形成破骨樣細(xì)胞，在相同條件下，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞群獲得更多的破骨細(xì)胞樣屬性，說明在炎癥條件下，適應(yīng)性免疫，無論是通過Th1或Th2細(xì)胞因子都能修改破骨細(xì)胞的分化過程[31]。且在鼠模型上證實(shí)[32]IL-4與IL-13對破骨細(xì)胞分化發(fā)揮抑制作用，且IL-4的抑制作用比IL-13強(qiáng)。

3.2 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在PMO中的調(diào)控作用 Treg細(xì)胞與自身免疫性疾病的發(fā)生關(guān)系密切，其異常表達(dá)可致自身免疫性疾病。有研究報(bào)道Treg細(xì)胞在絕經(jīng)后婦女抗骨質(zhì)疏松中扮演重要角色。Treg細(xì)胞在體內(nèi)能控制骨重吸收，在生理和病理骨重建時(shí)能維持骨量。Treg細(xì)胞能抑制OC功能、分化和形成。Treg細(xì)胞表達(dá)FoxP3，F(xiàn)oxP3轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比有更高的骨量，體內(nèi)OC分化和骨重吸收受損，骨量增加[33]。CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞可通過細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(Cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,CTLA-4)介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞間直接作用抑制M-CSF、RANKL途徑的OC形成，Treg細(xì)胞還可通過刺激IL-10、TGF-β1的分泌抑制OC分化和骨吸收[34]。

3.3 Th17細(xì)胞在PMO發(fā)病機(jī)制中的作用 Th17細(xì)胞是一種能夠分泌IL-17的CD4+T細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病和機(jī)體防御反應(yīng)中具有重要的意義。Th17細(xì)胞分泌IL-17、RANKL、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子參與骨代謝調(diào)節(jié)。Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子是IL-17。IL-17是骨丟失的重要中介物。在炎癥時(shí)IL-17增加OC生成。抗IL-17抗體不僅能減少前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)生成抗炎癥細(xì)胞因子，同時(shí)能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞抑制骨吸收。Tyagi等[35]的實(shí)驗(yàn)表明：成年小鼠用抗RANKL抗體、抗TNF-α抗體、抗IL-17抗體皮下處理，每周兩次，去勢術(shù)后4周進(jìn)行尸體解剖，發(fā)現(xiàn)抗RANKL抗體和抗TNF-α抗體治療的小鼠對去勢術(shù)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增殖沒有影響，抗IL-17抗體卻有效的抑制CD4+T細(xì)胞增殖并且逆轉(zhuǎn)CD28的丟失。說明IL-17在去勢術(shù)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用。體內(nèi)雌激素減少時(shí)Th17細(xì)胞數(shù)量增多，IL-17分泌增加，IL-17通過增加OB來源的TNF-α、IL-6、RANKL等前破骨細(xì)胞因子，支持OC生成，抑制OB分化，從而誘導(dǎo)骨丟失；IL-17既可調(diào)節(jié)OC分化，又可抑制OB礦化結(jié)節(jié)的形成，但是IL-17的這些功能可被E2抑制；同時(shí)雌激素減少，通過作用于雌激素受體上調(diào)STAT3、ROR-γt、ROR-α基因表達(dá)，下調(diào)Foxp3(Foxp3具有抗Th17細(xì)胞分化的作用)，使Th17細(xì)胞分化增加。因此IL-17在OVX誘導(dǎo)骨丟失中扮演關(guān)鍵角色，可能是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點(diǎn)[15]。

4 總結(jié)

PMO作為絕經(jīng)后婦女的常見病，影響到絕經(jīng)后婦女的生活質(zhì)量，目前對PMO的治療方法主要為激素替代療法和二膦酸鹽，但這些治療的副作用使人們追求更加完美的治療方案。對CD4+T細(xì)胞在PMO發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的作用進(jìn)行更深入的研究有望為本病的治療帶來新靶點(diǎn)。

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[收稿2015-04-15 修回2015-07-15]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.030

①本文受上海市醫(yī)學(xué)引導(dǎo)類項(xiàng)目(15401932200)、上海市浦江人才計(jì)劃(11PJ1401900)、國家自然科學(xué)基金(30801502)、日本學(xué)術(shù)振興會海外博士后研究員項(xiàng)目(P08471)、國家自然科學(xué)基金(81401171)、國家自然科學(xué)基金(31571196)、上海市高峰學(xué)科(中西醫(yī)結(jié)合，20150407)建設(shè)項(xiàng)目資助。

許瑩萍(1991-)，女，在讀碩士，主要從事神經(jīng)-生殖內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)方面研究，E-mail：ypxu14@fudan.edu.cn。

及指導(dǎo)教師：王 凌(1977-)，女，醫(yī)學(xué)博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)-生殖內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)方面研究，E-mail：dr.wangling@fudan.edu.cn。

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A

1000-484X(2016)04-0584-04