魏　英，余麗梅，王鈺瑩，姚觀平，潘　麗

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細胞工程重點實驗室，貴州 遵義　563003；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院實驗中心，湖北 十堰　442000)

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人參總皂苷促進血管新生改善急性心肌梗死大鼠心功能

魏英1,2，余麗梅1，王鈺瑩1，姚觀平1，潘麗1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細胞工程重點實驗室，貴州 遵義563003；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院實驗中心，湖北 十堰442000)

摘要：目的探討人參總皂苷(total ginsenosides, TG)對大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)模型血管新生及心功能的影響。方法結(jié)扎♂ SD大鼠冠狀動脈前降支，制備AMI模型，隨機分為模型組、TG低劑量和高劑量組(腹腔注射給予TG 20、40 mg·kg-1·d-1)，假手術(shù)組與模型組給予等量生理鹽水；彩色多普勒超聲檢測大鼠心功能；HE染色、Masson染色和免疫組化染色后觀察心肌病理組織學(xué)變化和微血管密度；real-time PCR檢測心肌組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) mRNA水平。結(jié)果TG治療35 d后，與模型組比較，TG高和低劑量組均能明顯縮小左心室舒張末期內(nèi)徑、左心室收縮末期內(nèi)徑、舒張末期左室容積和收縮末期左室容積(P<0.05)，明顯增加左室射血分數(shù)、左室短軸縮短率(P<0.01)。TG組心肌梗死面積和纖維化改變明顯減小，心室壁較厚；梗死區(qū)及其周邊心肌組織CD31陽性細胞組成的微血管密度較模型組增高(P<0.05)；缺血區(qū)心肌組織中VEGF和bFGF mRNA表達明顯高于模型組(P<0.01)。結(jié)論TG可明顯促進急性心肌梗死大鼠心臟功能恢復(fù)和改善心室重構(gòu)及梗死區(qū)心肌血液供應(yīng)，作用機制與上調(diào)心肌組織VEGF和bFGF基因表達、促進血管新生而增加血液供應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：人參總皂苷；急性心肌梗死；心功能；血管內(nèi)皮生長因子；堿性成纖維細胞生長因子；血管新生；心室重構(gòu)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)仍然是全球范圍內(nèi)致死、致殘的主要疾病之一[1]。AMI的治療手段有藥物、介入、手術(shù)、對癥治療及新興的間充質(zhì)干細胞移植治療等，其目的是為了改善心肌的缺血缺氧，抑制心律失常，維持較好的心臟灌注[2]。盡管治療方案較多，但所采用的前4種常規(guī)治療都存在不能很好地修復(fù)梗死的心肌等突出問題。AMI觸發(fā)的自發(fā)性血管新生反應(yīng)是一個緩慢保護性反應(yīng)的過程，只能部分地達到補償阻塞冠脈以下的心肌，不能完全修復(fù)[3]。治療性血管新生能進一步促進毛細血管的生長和側(cè)支循環(huán)的建立，誘導(dǎo)血管新生的治療被認為是恢復(fù)缺血區(qū)心肌氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)，改善心功能和心室重構(gòu)的有效方法。

人參等中藥材常被用于預(yù)防和治療心腦血管疾病、免疫失調(diào)、肝肺纖維化、糖尿病等[4]。人參含多種皂苷、多糖和黃酮，其中皂苷是其主要活性成分。人參總皂苷(total ginsenosides, TG) 是從人參中分離的皂苷總和，包括人參皂苷Rb1、Rg1、Re等40多種皂苷單體。其中人參皂苷Rb1、Re等能夠抑制心肌細胞凋亡，促進內(nèi)皮細胞釋放一氧化氮[5]；人參皂苷Rg1能夠上調(diào)大鼠心肌梗死區(qū)域及周邊組織中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體Flk-1的表達，增加微血管密度(microvessel density, MVD)，改善心功能[6]。也有報道，TG具有抗心肌肥厚，抑制血管平滑肌細胞增殖的作用[7]，但TG對心肌梗死后血管新生心室重構(gòu)及心功能的影響及其分子機制尚不清楚，本文對此進行了探討。

1材料與方法

1.1動物和試劑♂ (Sprague-Dawley，SD) 大鼠，清潔級，月齡2～3月，體質(zhì)量200～250 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供(許可證：SCXK20080003)；TG：北京天然藥物研究院提供，為人參莖和葉提取所得(比色法測定，純度97%；用JTY-300 型反相制備色譜固定相分離，純度>93%)；其中含人參皂苷Rb15.26%、Rg15.20%、Re 21.60%、Rd13.65%及其它人參皂類化合物。用無菌生理鹽水配制成2 g·L-1和4 g·L-1的儲存液，4 ℃保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、VEGF和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)基因擴增引物均購自大連寶生物公司；CD31單克隆抗體購自Santa Cruz公司；SYBR?GREEN PCR Master Mix購自美國ABI公司。

1.2主要儀器ALC-V8S小動物呼吸機，上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司；Ken2 Cardico302心電圖機，北京明成森木醫(yī)療器械有限公司；Sequoia 512彩色多譜勒超聲診斷儀，德國SIEMENS ACUSON；2400PCR擴增儀和實時熒光定量PCR儀為美國ABI和BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.3心臟彩色超聲多普勒檢查與動物篩選水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠仰臥位固定，左胸前區(qū)以1.25 mol·L-1的硫化鈉退毛。專人、雙盲法，采用探頭頻率15 MHz的彩色多譜勒超聲診斷儀監(jiān)測超聲心動圖，取左室乳頭肌短軸切面及左室長軸切面，將圖像放大，M型取樣左室前壁和左室后壁。選擇清晰圖像錄像及磁盤存貯，分析測量：左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic dimension, LVDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension, LVDs)、舒展末期左室容積(left ventricular end-diastolic volume, LVEDV)、收縮末期左室容積(left ventricular end-systolic volume,LVESV)及左室射血分數(shù)(ejection fraction, EF)、左室短軸縮短率(fractional shortening, FS)。選取心功能各項指標良好者進行實驗，各組給予TG等治療35 d，重復(fù)上述指標檢測。

1.4AMI模型制備和實驗分組按照文獻報道建立AMI模型[8]。氣管插管連接小動物呼吸機，左心耳下緣與肺動脈圓錐距主動脈根部約2～3 mm處，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，心肌顏色變?yōu)榘导t色和心電圖示ST段抬高判斷為制模成功(Fig 1)；假手術(shù)組(sham組，8只)大鼠只開胸不結(jié)扎。模型成功大鼠隨機分為3組，模型組(model組，12只)，TG低劑量組(TG-L組，10只，腹腔注射TG 20 mg·kg-1·d-1)，TG高劑量組(TG-H組，10只，腹腔注射TG 40 mg·kg-1·d-1)，sham組和model組均腹腔注射生理鹽水，術(shù)后d 1開始用藥，連續(xù)給藥35 d。

1.5心臟組織病理學(xué)檢查處死大鼠，開胸、取心臟，沿冠狀溝剪去心房，在結(jié)扎點以下，將左心室延冠狀面橫切為兩部分，肉眼觀察心室腔徑和心室壁的變化，留取心尖組織經(jīng)多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片HE染色，顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化；Masson染色，觀察藍染的膠原纖維分布及數(shù)量改變，評價心肌纖維化程度。

1.6免疫組化檢測心肌組織MVD梗死區(qū)心肌組織切片常規(guī)脫蠟、水化及封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，按照羊超敏二步法免疫組化檢測試劑說明書，按1 ∶50稀釋，滴加CD31單克隆一抗，孵育過夜，依次滴加試劑1(聚合物輔助劑)、試劑2(辣根酶標記抗山羊IgG多聚體)，DAB顯色，CD31陽性細胞表達呈棕色或褐色顆粒，陰性對照以PBS代替一抗。顯微鏡下觀察左心室心肌梗死區(qū)域及其邊緣CD31陽性細胞表達情況，計數(shù)單位面積內(nèi)CD31陽性微血管數(shù)目(200倍視野)，隨機選取10個視野，計算平均值，即MVD。CD31陽性微血管計數(shù)標準：單個內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮細胞簇、微小血管均予計數(shù)，帶有較厚肌層區(qū)域的血管均不計數(shù)。

1.7Real-time PCR檢測基因表達按試劑盒說明書，用TRIzol 提取心肌組織總RNA，紫外分光光度計測定A260與A280比值在1.8～2.0范圍。逆轉(zhuǎn)錄，在稀釋至7 mg·L-1的cDNA中加入SYBR?GREEN PCR Master Mix和相應(yīng)基因擴增引物(序列見Tab1)，進行定量PCR檢測，反應(yīng)條件：95 ℃，5 min；60 ℃，20 s；72 ℃，1 min，4 ℃，40個循環(huán)。以目的基因域循環(huán)數(shù)(threshold cycle，Ct)值對同一樣本的β-actin Ct值進行目的基因表達的相對定量分析。

2結(jié)果

2.1TG對AMI大鼠心功能的影響與sham相比，model組大鼠LVDd、LVDs、LVEDV、LVESV均明顯增加(P<0.01)，EF和FS明顯減小(P<0.01)，表現(xiàn)出明顯的左心室收縮和舒張功能障礙。TG干預(yù)35 d后，與model組比較，TG-H組大鼠LVDd、LVDs、LVEDV、LVESV明顯減小(P<0.05)，反應(yīng)左心室收縮功能的EF和FS則明顯高于模型組(P<0.05和P<0.01)；與model組比較，TG-L組大鼠EF和FS則明顯增大(P<0.05，見Tab2)。

2.2TG對AMI大鼠左心室組織病理學(xué)的影響HE染色后，顯微鏡下觀察，可見sham組大鼠心肌纖維排列整齊，無心肌纖維的破壞，胞質(zhì)豐富均勻，細胞間隙正常；而model組大鼠心肌組織缺血梗死區(qū)心室壁變薄，心肌纖維消失，呈現(xiàn)大量局灶性梗死機化和瘢痕形成；TG-L組和TG-H組較model組心室壁明顯增厚，心肌纖維保存較多，可見許多島狀存活的心肌組織，梗死機化和瘢痕形成面積較小(Fig 2)。Masson染色可見TG-L組和TG-H組藍染的膠原纖維數(shù)量明顯低于模型組(Fig 3A)。

2.3TG對心肌梗死區(qū)域及其邊緣MVD的影響CD31為血管內(nèi)皮細胞的標志，免疫組化結(jié)果顯示,與sham組相比，model組和TG-L、TG-H組大鼠心肌組織CD31陽性微血管明顯增多(P<0.01)，4組心肌組織MVD分別為：1.75±0.96、7.40±0.89、11.40±1.11和13.46±1.82；而與model組相比，TG-L組和TG-H組心肌組織CD31陽性微血管增多更加明顯(P<0.05，F(xiàn)ig 3B)。

2.4TG對左心室心肌組織VEGF和bFGF mRNA表達的影響左心室心肌組織real-time PCR結(jié)果顯示，以sham組基因表達水平的相對定量值為100，各組相同基因表達的相對定量值除以sham組基因表達水平的相對定量值×100表示。與sham組相比，model組左心室心肌組織VEGF和bFGF mRNA的表達水平無顯著差異；與sham組和model組相比，TG-L組和TG-H組均可明顯提高VEGF和bFGF mRNA的表達水平(P<0.01，見Tab3)。

3討論

冠狀動脈結(jié)扎導(dǎo)致心肌細胞缺血壞死，因心肌細胞再生能力有限，致壞死區(qū)域被纖維組織替代，發(fā)生心室重構(gòu)，嚴重影響心臟功能。因此，增加血管新生和組織血液供應(yīng)是AMI治療的關(guān)鍵[9]。實驗發(fā)現(xiàn)，TG治療35 d，對大鼠AMI具有明顯的保護作用，明顯改善心功能和心室重構(gòu)，AMI后大鼠EF和FS明顯提高，尤其高劑量組，LVDd、LVDs、LVEDV、LVESV也明顯減小，表明TG治療后，AMI大鼠心臟舒縮功能較模型組明顯提高。組織病理學(xué)也進一步證實，TG組心肌梗死面積明顯縮小，梗死區(qū)心肌纖維化較輕，有大量心肌細胞存在，心室壁較厚，說明TG明顯抑制了AMI大鼠的心室重構(gòu)，這也是TG改善心功能的重要組織學(xué)基礎(chǔ)。

#P<0.05,##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

A:Sham(×50);B:Model(×50);C:TG-L(×50);D:TG-H(×50);E:Sham(×200);F:Model(×200);G:TG-L(×200);H:TG-H(×200)

**P<0.01vsmodel group

微血管密度是反映側(cè)支循環(huán)的最可靠指標，梗死范圍的大小也間接反映側(cè)支循環(huán)情況，梗死面積越小，側(cè)支循環(huán)可能就越豐富。免疫組化染色結(jié)果顯示，TG處理組大鼠梗死區(qū)域及其周邊CD31陽性MVD明顯增加，表明TG刺激AMI大鼠血管新生，促進側(cè)支循環(huán)的建立。HE染色和Masson染色結(jié)果也證實，TG治療后，心肌梗死區(qū)域減小，膠原纖維減少，存活心肌組織較多，說明TG促進AMI后梗死區(qū)及其周邊血管新生，在較大程度上增加了缺血區(qū)血液供應(yīng)，明顯改善了AMI后的心室重構(gòu)。

VEGF和bFGF是促進內(nèi)皮細胞生長和分化的關(guān)鍵因素，在血管新生的過程中起著重要的作用[10]。缺血損傷上調(diào)VEGF和bFGF表達，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞有絲分裂因子活化，促進內(nèi)皮細胞生長，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的分化和成熟，而bFGF則能上調(diào)整合素的表達，提高內(nèi)皮細胞的黏附和遷移能力，最終形成新的血管[11-12]。業(yè)已證明，VEGF和bFGF表達上調(diào)能夠增加局部組織灌注和代謝，減輕缺血損傷，改善心功能[13]。實驗中發(fā)現(xiàn)，TG處理組大鼠梗死區(qū)心肌組織VEGF和bFGF mRNA的表達明顯增加，尤其是高劑量組增加更為明顯，提示TG可劑量依賴性地上調(diào)AMI大鼠心肌組織中VEGF和bFGF mRNA的表達，而誘導(dǎo)血管新生，從而改善缺血區(qū)血液供應(yīng)。

VEGF是內(nèi)源性的促血管生成因子，心肌缺血發(fā)生后d 1即在梗死區(qū)域表達升高，誘導(dǎo)自發(fā)性的血管新生反應(yīng)，但到梗死后d 14就下降到梗死前的水平[14]。實驗中觀察到，心梗后d 35，模型組VEGF水平與sham組相當，但TG處理組VEGF水平明顯升高，提示TG處理，刺激VEGF持續(xù)高表達，可能以此來補充AMI激發(fā)的自發(fā)性血管新生的不足。

已有文獻報道，人參皂苷中的Rg1、Re等具有血管生長因子樣作用，Rg1可上調(diào)大鼠心肌梗死區(qū)的VEGF表達，Rb1則參與改善AMI所致的左室重構(gòu)。由此推測，研究中TG所發(fā)揮的AMI治療作用可能是其所含多種皂苷類物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

可見，通過上調(diào)VEGF和bFGF基因表達，誘導(dǎo)血管新生，改善心肌血液供應(yīng)，減小心肌梗死面積，既是TG改善心肌梗死大鼠心臟功能的重要作用機制，也在AMI后減輕心肌纖維化和抑制心室重塑中發(fā)揮了明顯作用。

[致謝：感謝遵義醫(yī)學(xué)院藥理教研室(貴州省基礎(chǔ)藥理重點實驗室)吳芹和徐尚福老師給予的幫助！]

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diac function of acute myocardial infarction rat. The mechanism may be related to the upregulation of VEGF and bFGF gene expression, the promotion angiogenesis, then the improvement of blood supply in myocardial infarction area.

Total ginsenosides improve cardiac function via promoting angiogenesis in a rat model of acute myocardial infarction

WEI Ying1，2, YU Li-mei1,WANG Yu-ying1, YAO Guan-ping1, PAN Li1

(1.KeyLaboratoryofCellEngineeringofGuizhouProvinceinZunyiMedicalCollegeAffiliatedHospital,ZunyiGuizhou563003,China;2.ExperimentCenterofMedicine,DongfengHospital,HubeiUniversityofMedicine,ShiyanHubei442000,China)

Key words:total ginsenosides; acute myocardial infarction; cardiac function; vascular endothelial growth factor; basic fibroblast growth factor; angiogenesis; myocardial remodeling

Abstract:AimTo investigate the effects of total ginsenosides (TG) on microvascular regeneration and cardiac function in rat after acute myocardial infarction(AMI).MethodsThe acute myocardial infarction model was created with left coronary artery ligated in male Sprague Dawley rats. The model rats were randomly divided into sham, model, TG low and high dose groups. TG groups were injected into abdominal cavity with TG(20 mg·kg-1·d-1, 40 mg·kg-1·d-1). Sham and model groups were injected with equal-volume normal saline. On the 35thday post-operation, heart function was examined by color doppler ultrasoundination. HE, Masson and immunohistochemistrical staining were used to observe the histopathological changes of myocardium and micro vessel density. The level of vascular endothelial growth factor(VEGF) and basic fibroblast growth factor(bFGF) mRNA were detected by real-time PCR.ResultsCompared with the model group, high and low dose TG obviously decreased the left ventricular end diastolic dimension, the left ventricular end-systolic dimension, the left ventricular end-diastolic volume and the left ventricular end-systolic volume(P<0.05 andP<0.01), and significantly increased the ejection fraction and the fractional shortening(P<0.01). The histopathological changes of myocardium on myocardial infarction and fibrosis were dramatically reduced by TG. But ventricular wall was thicker. Two dose TG remarkably increased the expressions of VEGF and bFGF mRNA and micro vessel density of compositive CD31+ cells in ischemic myocardial tissue and around of infarct area(P<0.01,P<0.05).ConclusionsTG could improve the car-

收稿日期:2015-10-15，修回日期：2016-02-05

基金項目：貴州省科技廳攻關(guān)項目黔科合S字[2007]1029；遵義醫(yī)學(xué)院博士后基金遵醫(yī)(2006)034

作者簡介：魏英(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：心血管藥理學(xué),E-mail: 57729968@qq.com; 余麗梅(1967-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：組織再生與藥物調(diào)控，通訊作者，E-mail: ylm720@sina.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.023

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0559-06

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R331.31；R364.3；R542.22

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.046.html