周衛(wèi)民方明筍 陳方明 齊月寒 蔣 超

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,比較醫(yī)學(xué)研究中心,浙江杭州 310053)

不同多囊腎大小鼠模型的研究進(jìn)展

周衛(wèi)民*方明筍 陳方明 齊月寒 蔣 超

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,比較醫(yī)學(xué)研究中心,浙江杭州 310053)

為多囊腎病發(fā)病機(jī)理、研發(fā)多囊腎病新藥選擇合適的動(dòng)物模型提供選擇基礎(chǔ)，本文總結(jié)國(guó)內(nèi)外近年來(lái)使用最多的幾種多囊腎鼠模型的建立方法，從各模型鼠的來(lái)歷，造模方法，使用頻率和及模型的優(yōu)缺點(diǎn)等方面進(jìn)行綜述。

多囊腎 鼠模型 研究進(jìn)展

隨著醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因大小鼠已成為生命科學(xué)研究中不可缺少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。常染色體顯性遺傳多囊腎?。╝utosomal dominant polycystic kidney disease，PKD）是最常見(jiàn)的遺傳性腎病，在人群中發(fā)病率高達(dá)1/400-1000，我國(guó)約有150萬(wàn)患者，占我國(guó)最終期腎衰竭病因的第4位。已發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因與PKD發(fā)病有關(guān)，其中PKD1（polycystic kidney disease 1）基因定位于染色體16p13-3，其突變約占PKD的85%；PKD2基因定位于4q21-23，其突變約占15%[1]。多囊腎病的發(fā)病機(jī)制研究近年來(lái)有了較大的進(jìn)展，但在仍存在許多爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為PKD1或PKD2基因突變會(huì)激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的信號(hào)通路，促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖和腎囊腫擴(kuò)張[2]。約有10%和80%的患者發(fā)展為胰腺囊腫和肝臟囊性病變[3]。

PKD可發(fā)生于任何年齡，主要表現(xiàn)為雙側(cè)腎臟出現(xiàn)大小不一的囊腫，囊腫進(jìn)行性增大，破壞腎臟結(jié)構(gòu)和功能，60歲之前50%患者不可逆轉(zhuǎn)地進(jìn)展至終末期腎衰竭。PKD也是一種系統(tǒng)性疾病，除累及腎臟外，還伴有肝囊腫、胰腺囊腫、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、心臟瓣膜異常等。目前除應(yīng)用腎移植和透析治療終末期腎衰，尚無(wú)特效療法阻止囊泡的發(fā)生和生長(zhǎng)。針對(duì)PKD發(fā)病機(jī)制延緩甚至逆轉(zhuǎn)PKD的病程是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。PKD1基因突變占到PKD的85%，使PKD1基因突變成為研究的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外為此專門(mén)制作了研究此類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

然而，如果直接將小鼠中直系同源pkd1基因完整地敲除，會(huì)發(fā)生復(fù)雜的胚胎致死表型，包括表現(xiàn)出形成缺陷的腎臟、胰腺、中軸骨骼、毛細(xì)血管、心臟等各種各樣的表型[4-7]，雖然有個(gè)別的小鼠能夠在胚胎發(fā)育期存活，但是在出生后不久也將死于肺發(fā)育不良等綜合性的病變[4]。由于胚胎致死，對(duì)一些需要觀察一定時(shí)程的研究（比如發(fā)病機(jī)制研究、藥物療效觀察等）來(lái)說(shuō)就是很大的障礙。因此，迫切需要建立條件敲除PKD1小鼠模型，運(yùn)用條件基因打靶和等位基因低表現(xiàn)量等策略來(lái)解決和限制基因敲除而引起的模型胚胎致死情況的發(fā)生。

通過(guò)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)、自身突變篩選和受精卵癌基因微注射等方法獲得的動(dòng)模型存在各種缺點(diǎn)，尚不能滿足科學(xué)研究需要。通過(guò)胚胎干細(xì)胞基因打靶途獲得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型是最為理想的模型，可人為地改造、修飾動(dòng)物基因，得到相應(yīng)的表現(xiàn)型，從而模擬人類遺傳病。1999年Lu等[9]對(duì)缺失34外顯子的多囊腎動(dòng)物模型Pkd1+/-小鼠進(jìn)行了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)散在進(jìn)行性的腎臟和肝臟囊腫。2011年陳燕等[10]對(duì)pkd1flox/-：Ksp-Cre 小鼠進(jìn)行腎功能的改變的研究，結(jié)果表明在出生后兩周內(nèi)出現(xiàn)腎功能衰竭的相關(guān)癥狀，且只能存活2～3周時(shí)間[11]。pkd1flox/-：Ksp-Cre 小鼠在出生第12d其腎臟系數(shù)是野生型小鼠的15倍之多，其腎臟組織中尿素含量為野生型小鼠的15倍左右，血清中尿素含量在出生第1d到12d都為野生型小鼠的1倍左右，其隨動(dòng)物的增長(zhǎng)變化不是很大。

有研究制作了一個(gè)具有條件目標(biāo)PKD1等位基因[8]，并結(jié)合有選擇性的Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠Pkd1f/f：Cre，當(dāng)重組酶Cre被Tamoxifen誘導(dǎo)之后，Cre表達(dá)，介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)序列的重組，從而把目標(biāo)PKD1等位基因（LoxP-Pkd1-LoxP）敲除。Pkd1f/f：Cre是為Pkd1全身性敲除的，經(jīng)Tamoxifen誘導(dǎo)后形成多囊腎。該模型可通過(guò)在不同的時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)突變，而造成快速進(jìn)展（小鼠存活5周左右）或者慢速進(jìn)展（小鼠存活12個(gè)月左右）多囊腎病模型，且Tamoxifen誘導(dǎo)劑量的不同，其多囊腎病的嚴(yán)重程度也不一樣，可根據(jù)研究需要選用合適的誘導(dǎo)方式進(jìn)行造模，其應(yīng)用前景廣泛。雖然信號(hào)學(xué)說(shuō)存在許多爭(zhēng)議，但是對(duì)于多囊腎病Pkd1f/f：Cre轉(zhuǎn)基因小鼠而言，其基因突變直系同源基因與人類疾病的基因，Pkd1f/f：Cre轉(zhuǎn)基因小鼠在這方面可以作為一種寶貴的資源。

Kaspareit-Rittinghausen等[17]在飼養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了突變大鼠，大鼠具有腎囊腫以及高血壓病癥，將這種大鼠命名為Han：SPRD大鼠，其腎臟上皮細(xì)胞增殖明顯，內(nèi)積聚液體，腎細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)[18.19]。目前研究多囊腎病的良好動(dòng)物模型是Han：SPRD。多囊腎大鼠模型Han：SPRD（Cy/+）的應(yīng)用也越來(lái)越廣，應(yīng)用于多囊腎病藥物及作用機(jī)制的研究，而Han：SPRD（Cy/ Cy）大鼠在出生后只能存活3周左右[20]，其出生后不久，腎臟就開(kāi)始腫大，有研究表明在8周齡時(shí)，多囊腎大鼠模型Han：SPRD（Cy/+）與野生型大鼠Han：SPRD（+/+）比，其腎臟體積要大1陪，腎功能衰竭指標(biāo)也增加1倍多[15-16]。Han：SPRD（Cy/+）模型大鼠和多囊腎患者腎組織中β-TrCP的表達(dá)量與Han：SPRD（+/+）野生型大鼠和瘤旁正常組織比都有明顯的升高[21]，這表明Han：SPRD大鼠與人類腎組織囊腫可能具有相似的β-TrCP調(diào)控制機(jī)。

綜上所述，pkd1flox/-：Ksp-Cre 小鼠模型在出生時(shí)就發(fā)病，且存活時(shí)間較短，可用于研究多囊腎病的發(fā)病機(jī)制的研究，但是在用于治療藥物的研究方面運(yùn)用較難。而很少有對(duì)Pkd1f/f：Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的病程進(jìn)展、全身各器官受累情況、組織損傷程度、包括一些PKD相關(guān)重要信號(hào)通路在發(fā)育過(guò)程中的變化等進(jìn)行基礎(chǔ)研究的資料，限制了該轉(zhuǎn)基因小鼠的在藥物篩選、發(fā)病機(jī)制研究方面的應(yīng)用。在Pkd1轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)之前，國(guó)內(nèi)研究多囊腎病的唯一模型是Han：SPRD大鼠模型，此大鼠主要應(yīng)用于成人的多囊腎病研究。PKD1轉(zhuǎn)基因小鼠的出現(xiàn)，豐富了研究多囊腎病發(fā)病機(jī)理、研發(fā)多囊腎病新藥的動(dòng)物模型。

[1] 高晉生，楊寶.常染色體顯性遺傳多囊腎病的治療研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（2）：141-144.

[2] 梅長(zhǎng)林.常染色體顯性遺傳性多囊腎病研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（1）：1-4.

[3] Gianfranco Distefano，Manila Boca et al.Polycystin-1 Regulates Extracellular Signal-Regulated Kinase-Dependent Phosphorylation of Tuberin To Control Cell Size through mTOR and Its Downstream Effectors S6K and 4EBP1[J].MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，2009，（5）：2359-2371.

[4] Lu，W.，et al.Perinatal lethality with kidney and pancreas defects in mice with a targetted Pkd1 mutation[J] Nat. Genet.，1998，（17）：179-181.

[6] Boulter，C.et al. Cardiovascular，skeletal，and renal defects in mice with a targeted disruption of the Pkd1 gene[J].Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2001，（98）：12174-12179.

[7] Wu，G. et al. Trans-heterozygous Pkd1 and Pkd2 mutations modify expression of polycystic kidney disease[J].Hum. Mol. Genet.，2002，（11）：1845-1854.

[8] Sekiya Shibazaki et al. Cyst formation and activation of the extracellular regulated kinase pathway after kidney specific inactivation of Pkd1[J]. Human Molecular Genetics，2008，17（11）：1505-1516.

[9] Luw，F(xiàn)anX，et al. Late onset of renal and hepatic cysts in Pkdtargeted heterozygotes[J].NatureGenetics，1999，（21）：160.

[10] 陳燕.多囊腎小鼠腎功能的改變[J].Chin J Lab Diagn，2011，（15）：60-61.

[11] Baoxue Y，ND Sonawane，Dan Z，et al . Small Molecule CFTR Inhibitors Slow Cyst Growth in PKD[J]. Journal of the American Society of Nephro-logy，2008，（1）：1.

[12] Kim I，DingT，F(xiàn)uY，eta.l Conditional mutation ofPkd2 causes cysto-genesis and up regulates beta-catenin [J]. JAm SocNephrol，2009，20（12）：2556-2569.

[13] Muto S，Aiba A，Y Saito，et al Pioglitazone improves the phenotype and molecular defects of a targeted Pkd1 mutant [J]. HumMolGenet， 2002，11（15）：1731-1742.

[14] Sorenson CM. Nuclear localization of beta-catenin and loss of apical brush border actin in cystic tubules of bcl-2 -/- mice[J]. Am J Physiol 1999，276（2 Pt2）：210-217.

[15] Cowley BD Jr，Gudapaty S，Kraybill AL，Barash BD，Harding MA，Calvet JP，Gattone VH and：Autosomal-dominant polycystic kidney disease in the rat[J]. Kidney Int 1993，43（3）：522-534.

[16] Wu XC，Richards NT，Michael J，Johns E：Relative roles of nitric oxide and cyclo-oxygenase and lipoxygenase products of arachidonic acid in the contractile responses of rat renal arcuate arteries[J]. Br J Pharmacol，1994，112（2）：369-376.

[17] Kaspareit-Rittinghausen J，Deerberg F，Rapp K，et al.A new rat model for polycystic kidney disease of humans[J].Transplant Proc，1990，22（11）：2252-2253.

[18] Calvet CP，Grantharn JJ. The genetics and physiology of polycystic kidney disease[J].Semin Nephrol，2001，21（2）：107-111.

[19] Qian Q，Harris PC，Torres VE.Treatment prospects for autosoma-l dominant polycystic kidney disease [J]. Kidney Int，2001，59（8）：2005-2022.

[20] 李林.常染色體顯性多囊腎病Han：SPRD大鼠腎臟病理觀察及其意義[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26（1）：83-86.

[21] 陳美含.常染色體顯性多囊腎病中泛素連接酶β-TrCP的表達(dá)及其作用和調(diào)控機(jī)制[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，56（1）：26-30.

浙江省科技廳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014C37009）

周衛(wèi)民（1979－），男，浙江金華人，研究生學(xué)歷，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 [5] Kim，K.，Drummond，et al. Polycystin 1 is required for the structural integrity of blood vessels[J].Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2000，（97）：1731-1736.