基金項(xiàng)目:廣東省人口和計(jì)劃生育委員會(huì)科研項(xiàng)目(2012338)。

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反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣對(duì)懷孕女性TORCH感染的檢測(cè)*

*基金項(xiàng)目:廣東省人口和計(jì)劃生育委員會(huì)科研項(xiàng)目(2012338)。

何文軍1，唐芳2，李濤1，吳子安1，吳新忠1，江帆2，左連東2，余婷玉1，譚志容1，徐寧1△

(1.廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510120；2.廣州市人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所，廣東廣州 510410)

摘要:目的評(píng)價(jià)反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣方法是否能用于懷孕女性TORCH感染的檢測(cè)。方法建立檢測(cè)TORCH感染的反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣方法，比較反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)2 000份懷孕女性的新鮮血清TORCH感染的陽(yáng)性符合率，評(píng)價(jià)反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣檢測(cè)TORCH的可行性。結(jié)果建立的反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣方法與ELISA方法對(duì)TORCH感染檢測(cè)的陽(yáng)性符合率分別為100.0%、91.1%、97.2%、91.3%和93.0%，通過(guò)蛋白芯片法與ELISA法各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果均具有較好的一致性 (P>0.05)，但反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣對(duì)風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒和皰疹病毒的檢測(cè)率高于相對(duì)應(yīng)的ELISA方法。結(jié)論反向蛋白微點(diǎn)陣法檢測(cè)TORCH感染，具有簡(jiǎn)便、快速，敏感性較高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是臨床優(yōu)生優(yōu)育輔助診斷的有效方法，未來(lái)值得推廣使用。

關(guān)鍵詞:反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣；TORCH感染；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

優(yōu)生優(yōu)育是提高人口素質(zhì)的重要手段，世界各國(guó)非常重視產(chǎn)前診斷。孕期致畸病原體感染是重要的致畸因素之一，可導(dǎo)致大量畸形兒的出生，給家庭與社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。這些病原體主要包括弓形體、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒Ⅰ、Ⅱ型及其他感染(包括微小病毒屬、人免疫缺陷病毒、肝炎病毒、梅毒螺旋體等)。這些病原體均能通過(guò)胎盤垂直傳播給胎兒，還可通過(guò)孕婦下生殖道逆行擴(kuò)散，引起胎兒感染以及胎兒分娩時(shí)的圍產(chǎn)期感染，導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎或胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩(IUGR)、智力發(fā)育不全、小頭畸形、腦水腫、聽(tīng)力障礙等先天畸形，以及新生兒感染、青春期發(fā)育障礙，臨床上稱為TORCH 綜合征。但這類感染對(duì)孕婦本身影響較小，常缺乏明顯臨床癥狀。孕婦感染并不代表胎兒感染，對(duì)這些孕婦的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷、確診宮內(nèi)感染非常重要。(鑒于對(duì) TORCH感染潛伏性、危害性的認(rèn)識(shí)，和目前早期診斷與有效治療手段的欠缺，重視對(duì)孕婦的產(chǎn)前 TORCH 感染的篩查診斷，以及對(duì)感染孕婦的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，以確診是否存在宮內(nèi)感染)。目前，在美國(guó)孕婦常規(guī)檢查風(fēng)疹病毒、乙型肝炎病毒、梅毒螺旋體、B 組鏈球菌和人免疫缺陷病毒[1]，在中國(guó)北京地區(qū)也已將圍產(chǎn)期檢測(cè) TORCH 感染列為常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。

TORCH 感染的診斷主要依靠病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)診斷。這些方法存在各種各樣的缺陷，如病原學(xué)診斷包括顯微鏡檢查、動(dòng)物接種、組織細(xì)胞培養(yǎng)病理檢查等，但其陽(yáng)性率較低，往往受到條件限制，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且需要活體微生物方可檢測(cè)，因此不適用于臨床篩查[2]。應(yīng)用普通的免疫學(xué)技術(shù)進(jìn)行孕婦的血清學(xué)檢測(cè)作為圍產(chǎn)期感染的主要診斷方法已有許多年。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用酶免疫技術(shù)中的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的方法檢測(cè)病原體特異性 IgG 和 IgM 來(lái)診斷孕婦的感染[3-4]，但此類方法每次所檢測(cè)的病原體種類有限，需對(duì)各病原體逐一檢測(cè)，費(fèi)用較高，患者難以承受。分子生物學(xué)技術(shù)普遍存在著擴(kuò)增產(chǎn)物易污染而導(dǎo)致假陽(yáng)性、操作繁瑣、檢測(cè)費(fèi)用較高等缺點(diǎn)，不適合高通量檢測(cè)。

隨著反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣技術(shù)的發(fā)展，反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣也越來(lái)越多用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)以及蛋白質(zhì)相互作用的研究[5]。在本研究中，設(shè)計(jì)反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣檢測(cè)TORCH感染，并與常規(guī)TORCH的檢測(cè)方法對(duì)比，評(píng)價(jià)該反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣檢測(cè)TORCH的靈敏度、特異度等，為該方法的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源新鮮血清標(biāo)本2 000份，均來(lái)自本院和廣州市人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所婦科門診進(jìn)行孕期體檢的孕婦，年齡19～40歲，室間質(zhì)評(píng)標(biāo)本來(lái)自國(guó)家衛(wèi)計(jì)委臨床檢驗(yàn)中心。

1.2反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣的設(shè)計(jì)所有TORCH的蛋白抗原購(gòu)自Sigma公司，委托深圳市賽爾生物科技有限公司加工成 反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣或蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣，即先把TORCH病原體的抗原定量后固定在硝酸纖維包被的玻片上，然后用標(biāo)準(zhǔn)的抗體或被TORCH感染后的血清孵育，用洗滌液洗滌沒(méi)有結(jié)合的血清或抗體標(biāo)本，然后加入生物素標(biāo)記的抗IgM抗體孵育后，洗滌再加入顯色液進(jìn)行顯色，信號(hào)用Dakocytomation-催化系統(tǒng)擴(kuò)增掃描，用商品化的軟件Microvigene獲得信號(hào)強(qiáng)度(圖1)。

圖1　　反向蛋白微點(diǎn)陣檢測(cè)示意

1.3反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣對(duì)TORCH感染標(biāo)本的檢測(cè)血清標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液按1∶20進(jìn)行稀釋后取 200 μL加于芯片槽中，布滿芯片方槽，置于37 ℃溫育30 min，洗滌3次，吸干水滴后,加示蹤物2滴，37 ℃溫育30 min；洗滌3次，吸干水滴，加顯色劑1滴，37 ℃顯色 8～12 min，甩干后于蛋白芯片閱讀儀下進(jìn)行灰度值掃描，通過(guò)與cutoff值的比值 (T/cutoff)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷，比值大于或等于1.00為陽(yáng)性，小于1.00者為陰性。

1.4ELISA檢測(cè)TORCH感染標(biāo)本ELISA試劑盒檢測(cè)新鮮血清樣品，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。血清標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液按1∶80進(jìn)行稀釋后，取100 μL已稀釋標(biāo)本加于微孔板中，室溫反應(yīng)30 min，洗滌3次，加酶標(biāo)抗體100 μL，室溫反應(yīng)30 min，再洗滌3次，加入TMB底物100 μL，室溫避光顯色10 min，用終止液終止反應(yīng)后，用ST-360酶標(biāo)儀在450 nm下進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各組間陽(yáng)性率比較用配對(duì)χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣對(duì)標(biāo)準(zhǔn)TORCH抗原的檢測(cè)采用標(biāo)準(zhǔn)的TORCH抗原先包被，然后用衛(wèi)計(jì)委臨床檢測(cè)中心提供的TORCH陽(yáng)性和陰性樣品對(duì)設(shè)計(jì)的反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果同預(yù)期的完全一致，所有的陽(yáng)性樣品均為陽(yáng)性，所有的陰性樣品為陰性。然后對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行稀釋檢測(cè)，當(dāng)樣品以1∶40稀釋后仍可檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)。上述結(jié)果表明設(shè)計(jì)的反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣能夠檢測(cè)TORCH感染。

2.2反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣對(duì)臨床樣品的檢測(cè)用反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣對(duì)新鮮的孕檢標(biāo)本進(jìn)行TORCH檢測(cè)，同時(shí)用ELISA試劑盒檢測(cè)TORCH感染，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　　比較反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣和ELISA方法檢測(cè)孕婦的TORCH感染[n(n)]

()：用ELISA的檢測(cè)結(jié)果。

3討論

反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣是將待分析樣品固定在經(jīng)過(guò)特殊處理的玻片上，然后用抗體對(duì)那些待分析樣品進(jìn)行分析(圖1)。該技術(shù)是在傳統(tǒng)的正向蛋白微點(diǎn)陣技術(shù)基礎(chǔ)上于2001年創(chuàng)立，最初是從腫瘤組織獲取細(xì)胞群，分析存活前檢查點(diǎn)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)蛋白的狀態(tài)[6]。之后，反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣技術(shù)被許多研究者采用，不僅用于脂膜微囊組織，而且用于各種其他生物樣品，包括異質(zhì)性的組織樣品、細(xì)胞培養(yǎng)物、血清/血漿樣品、卵巢流出物、針吸樣品和多肽[5]。目前反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣不被限于臨床前研究，而且還可以用于癌癥的臨床試驗(yàn)檢測(cè)、細(xì)胞途徑的鑒定、細(xì)菌感染檢測(cè)[7-9]、免疫性疾病和病毒-宿主的相互作用[9-11]。反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣能夠檢測(cè)疾病和非疾病狀態(tài)下治療前、中和后的蛋白動(dòng)力學(xué)[12]，能同時(shí)定量檢測(cè)多個(gè)樣品的蛋白表達(dá)水平[5,13]。

蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣技術(shù)提供了必要的分析靈敏度，甚至能檢測(cè)超低豐度的蛋白，主要由于其靈敏度增加、減少樣品體積/濃度的要求，在一個(gè)芯片上可以分析數(shù)千個(gè)樣品。反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣不是2個(gè)位點(diǎn)的夾心類型抗體點(diǎn)陣，僅需要一個(gè)抗體用于檢測(cè)，待分析的數(shù)目遠(yuǎn)大于正向蛋白質(zhì)點(diǎn)陣。典型的反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣只需要納米級(jí)別的樣品。這些待分析物來(lái)源于培養(yǎng)的細(xì)胞或體內(nèi)的動(dòng)物組織或臨床樣品。每個(gè)分析的樣品點(diǎn)大小從幾十到幾百微米，因此，反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣具有高通量，可以同時(shí)分析數(shù)千個(gè)樣品，其檢測(cè)的原理類似其他免疫實(shí)驗(yàn)。

本研究中的陽(yáng)性對(duì)照也來(lái)自衛(wèi)計(jì)委的臨床檢測(cè)中心，保證了陽(yáng)性標(biāo)本的可靠性。在反向蛋白質(zhì)芯片的點(diǎn)陣設(shè)計(jì)上，每個(gè)TORCH感染均設(shè)置2個(gè)陽(yáng)性復(fù)孔和2個(gè)陰性對(duì)照復(fù)孔。用反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣對(duì)衛(wèi)計(jì)委臨床檢測(cè)中心提供的TORCH質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期的結(jié)果一致，此外與其他抗體沒(méi)有交叉反應(yīng)。用反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣對(duì)臨床收集的TORCH感染樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于弓形蟲(chóng)的檢測(cè)，蛋白芯片檢測(cè)與常規(guī)的ELISA試劑盒的檢測(cè)陽(yáng)性符合率為100%(P>0.05)，證明反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染具有和ELISA方法相類似的靈敏度和特異度。對(duì)于風(fēng)疹病毒的檢測(cè)，反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣的檢測(cè)陽(yáng)性率高于ELISA試劑盒，后來(lái)對(duì)反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣檢測(cè)陽(yáng)性的患者隨訪，再用ELISA方法檢測(cè)證明反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣檢測(cè)結(jié)果是正確的。該結(jié)果證明 反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣對(duì)風(fēng)疹病毒感染的靈敏度高于ELISA方法。對(duì)于巨噬細(xì)胞病毒和單純皰疹病毒的檢測(cè)，反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣的靈敏度也高于ELISA方法。所以，從檢測(cè)的靈敏度來(lái)說(shuō)，反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣對(duì)TORCH感染的檢測(cè)超過(guò)ELISA方法。最重要的是，在一塊芯片上能同時(shí)檢測(cè)所有的TORCH項(xiàng)目，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)標(biāo)本，大大節(jié)約了成本和人力。凌云等[14]研究發(fā)現(xiàn)反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣法檢測(cè)弓形蟲(chóng)的靈敏度高于ELISA法。

盡管反向蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣對(duì)TORCH感染的檢測(cè)具有簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)和靈敏度高等特點(diǎn)，但該方法用于臨床之前，仍需要多中心大樣品進(jìn)行測(cè)試。

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·論著·

Detection of TORCH infection in pregnant women by using reverse phase protein array*

HeWenjun1，TangFang2，LiTao1，WuZian1，WuXinzhong1，JiangFan2,ZuoLiandong2，YuTingyu1,TanZhirong1,XuNing1

(1．DepartmentofClinicalLaboratory,GuangdongProvincialHospitalofChineseMedicine,

Guangzhou,Guangdong510120,China;2.GuangzhouMunicipalScientificResearchInstituteof

PopulationandFamilyPlanning,Guangzhou,Guangdong510410,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate whether the reverse phase protein array (RPPA) method can be used for detecting TORCH infection in pregnant women.MethodsThe RPPA method was established for detecting TORCH infection.The positive coincidence rates of TORCH infection detected by the RPPA method and ELISA method in 2000 fresh serum samples from pregnant women were compared for evaluating the feasibility of RPPA in TORCH detection.ResultsThe positive coincidence rates of established RPPA and ELISA for detecting TORCH infection was 100.0%,91.1%,97.2%,91.3% and 93.0% respectively,indicating that the detection results of various indexes by RPPA and ELISA had better consistency (P>0.05),but the positive detection rates of RPPA for Rubellavirus,CMV and HSV-1,2 were higher than those of correspondent ELISA method.ConclusionRPPA method for detecting TORCH infection has the advantages of simpleness,rapidness,high sensitivity and strong specificity,is an effective method of auxiliary diagnosis for bearing and rearing better children in clinical,and is worthy of being promoted and used in the future.

Key words:reverse phase protein array;TORCH infection;enzyme linked immunosorbent assay

收稿日期：(2015-05-24)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.006A

文章編號(hào)：1673-4130(2015)24-3522-03

通訊作者△，E-mail：xuning21@163．com。

作者簡(jiǎn)介：何文軍，男，副主任技師，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作。