基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81271920、81301498)。

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熒光定量PCR檢測(cè)宮頸癌患者血清中miR-203表達(dá)水平及意義*

*基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81271920、81301498)。

楊春蘭，申嫻娟，鞠少卿，蘇建友△

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南通 226001)

摘要:目的建立SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清中miR-203的表達(dá)水平，并檢測(cè)宮頸癌患者、良性宮頸疾病及健康對(duì)照者血清miR-203的表達(dá)水平。方法設(shè)計(jì)miR-203、U6莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行熒光定量PCR，以U6為內(nèi)參相對(duì)定量比較不同宮頸疾病患者血清中miR-203的表達(dá)水平。結(jié)果該研究建立的方法能特異性檢測(cè)到血清中miR-203的擴(kuò)增信號(hào)，熔解曲線單一，PCR產(chǎn)物特異。宮頸癌患者血清中miR-203表達(dá)水平明顯高于子宮肌瘤、宮頸炎等其他良性宮頸疾病，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異度好的檢測(cè)方法，可能在宮頸癌輔助診斷中有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞:SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR；miR-203；宮頸癌

microRNA(miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度約為21～25個(gè)核苷酸，可與特定的目標(biāo)mRNA結(jié)合，通過(guò)促進(jìn)靶mRNA的降解和(或)抑制翻譯過(guò)程而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用，miRNA對(duì)疾病的影響、致病機(jī)制正成為研究的熱點(diǎn)[1]。miR-203是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的第一種皮膚特異性miRNA，不但參與調(diào)控胚胎期表皮分化、構(gòu)建皮膚保護(hù)層，并與銀屑病和牛皮癬等皮膚性疾病有關(guān)，而且作為抑癌或致癌因子與靶基因共同作用參與腫瘤細(xì)胞的增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移和凋亡等[2]。新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-203的異常表達(dá)與食管癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、慢性粒細(xì)胞白血病等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，在世界女性癌癥發(fā)病率中排第2位,病死率排第5位。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸是一個(gè)極其復(fù)雜的多階段、多基因調(diào)控異常的過(guò)程。研究表明對(duì)于在宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá)或沉默表達(dá)的抑癌性miRNA，可通過(guò)miRNA表達(dá)載體系統(tǒng)或miRNA類似物導(dǎo)入外源miRNA，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，以治療和預(yù)防宮頸癌。研究發(fā)現(xiàn)miR-199a、miR-143、miR- 214等miRNA分子的異常表達(dá)與宮頸癌發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

因此，是否能將miR-203作為一個(gè)新標(biāo)志物，通過(guò)檢測(cè)血清中miR-203的表達(dá)量來(lái)進(jìn)行宮頸癌的早期診斷和預(yù)后判斷成為此次研究的主要目的。

1資料與方法

1.1一般資料宮頸癌患者7例、子宮肌瘤患者5例、宮頸炎患者5例及健康對(duì)照組7例，年齡41～65歲，平均48歲，來(lái)自南通大學(xué)附屬醫(yī)院。

1.2儀器與試劑主要儀器有高速冷凍離心機(jī)(日本HiTachi公司)，紫外分光光度計(jì)(德國(guó)Iimplen公司)，7500 Real Time PCR System(美國(guó)ABI公司)，-80 ℃低溫冰箱(日本Sanyo公司)，熒光定量PCR八連管(美國(guó)Axygen公司)。試劑主要有總RNA提取試劑Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)，miR-203和U6 RT Primer、Bulge-LoopTM miRNA Primer (廣州銳博生物科技有限公司)，Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑，MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2×)(立陶宛Fermentas公司)，DNA 引物(大連TakaRa生物工程公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集采用分離膠的真空采集管收集血液標(biāo)本，1 000 r/min離心10 min后，將上層血清分裝于Rnase-free的EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2血清RNA提取用QIAGEN miRNeasy Mini kit試劑盒內(nèi)的QIAzol、RWT、RPE試劑以及吸附柱提取血清RNA，最終溶于40 μL nuclease-free H2O中。用紫外分光光度計(jì)測(cè)得RNA濃度及純度，取適量模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.3.3cDNA的合成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA 500 ng，62.5 nmoL莖環(huán)狀逆轉(zhuǎn)錄引物1.6 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，dNTP(10 mmol)2 μL，RNase inhibitor(20 u/μL)，Reverse Transcriptase(200 u/μL)1 μL，nuclease-free H2O補(bǔ)足至20 μL，混勻，瞬時(shí)離心。反應(yīng)條件為42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置-20 ℃保存。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為SYBR GreenⅠmix(Rox)9 μL，cDNA 5 μL，上、下游引物各2 μL，miR-203正向引物序列：5′-GUG AAA UGU UUA GGA CCA CUA G-3′，反向引物序列：5′-CCA GUG GUU CUU AAC AGU UCA AC-3′；U6正向引物序列：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，反向引物序列：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。RNase-free H2O補(bǔ)足至20 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 min，40個(gè)循環(huán)，60~95 ℃收集熒光繪制熔解曲線。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本次實(shí)驗(yàn)采用比較Ct值法，首先將兩項(xiàng)平行反應(yīng)取平均Ct值，△Ct=Ct (miR-203)―Ct (U6snRNA)，基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△Ct方法計(jì)算。所有資料用Graphpad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

樣品總 RNA 的OD260/OD280值在1.8左右，見(jiàn)圖1，提取純度較好，可進(jìn)行下一步的熒光定量的反應(yīng)。根據(jù)測(cè)得的濃度加入5 μL cDNA模板擴(kuò)增。

圖1　　1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量

從熔解曲線圖上可以看出，miR-203、U6的熔解曲線峰值單一，略有差異，見(jiàn)圖2(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)，miR-203熔解溫度為79.55 ℃左右，U6熔解溫度為83.06 ℃左右。表明 PCR 參數(shù)選擇適當(dāng)，miR-203、U6逆轉(zhuǎn)錄引物和擴(kuò)增引物能夠擴(kuò)增出miR-203、U6片段，產(chǎn)物特異度較好，非特異產(chǎn)物對(duì)結(jié)果影響較小。

miR-203的real-time PCR擴(kuò)增曲線宮頸原位癌患者血清中miR-203與U6 snRNA反應(yīng)曲線呈標(biāo)準(zhǔn)S型，見(jiàn)圖3(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。在本試驗(yàn)中，U6在所有標(biāo)本中都有穩(wěn)定表達(dá)，且Ct值比較集中，在22±2之間，可作為該實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參照。

血清miR-203 PCR反應(yīng)曲線呈標(biāo)準(zhǔn)S型，通過(guò)計(jì)算得出24份樣本的血清中miR-203檢測(cè)結(jié)果：7位宮頸原位癌患者Ct值結(jié)果為16.21、15.38、14.98、17.21、16.68、13.98、15.49；5位子宮肌瘤患者結(jié)果為22.11、23.58、25.87、27.58、26.24；5位宮頸炎患者結(jié)果為21.80、24.86、22.84、23.16、22.69；7位健康對(duì)照組結(jié)果為24.30、25.64、23.24、26.14、23.54、22.57、25.47。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血清中miR-203表達(dá)水平明顯高于子宮肌瘤和宮頸炎患者(P<0.05)。子宮肌瘤和宮頸炎患者血清中miR-203表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

早期宮頸癌大多數(shù)患者通過(guò)手術(shù)或放射治療可以控制病情，有一個(gè)相對(duì)有利的預(yù)后。但是，仍有淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的患者漏診率很高。目前，用于檢測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的各種方法，如CT、MR和PET-CT，均具有較低的敏感度和特異度。最近研究表明，血清中含有大量來(lái)自不同組織的穩(wěn)定miRNA。

Chen等[3]首次研究證實(shí)血清miRNA可以作為潛在的腫瘤標(biāo)志物，研究結(jié)果顯示彌漫性大B淋巴細(xì)胞瘤患者血清中miR-155、miR-210、miR-21 表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照組，而且miR-21 的表達(dá)水平與患者存活率密切相關(guān)。隨后有大量研究證實(shí)血清miRNA可作為多種腫瘤輔助診斷、鑒別診斷、預(yù)后判斷、病程監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物[4]。如胰腺癌患者血清中7種miRNA分子(miR-20a，miR-21，miR-24，miR-25，miR-99a，miR-185，miR-191)表達(dá)明顯上調(diào)，且miRNA-21表達(dá)水平與胰腺癌患者的存活率密切相關(guān)；前列腺癌患者血清中miRNA-375，miRNA-141表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平和格里森指數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等高度相關(guān)。目前，通過(guò)對(duì)宮頸癌相關(guān)miRNA進(jìn)行鑒定和功能分析，已發(fā)現(xiàn)宮頸癌中有明確靶基因的miRNA差異表達(dá)譜，如 miR- 21、miR- 34a、miR-143等，可能為宮頸癌診斷和鑒別診斷提供有價(jià)值的參考指標(biāo)。

在多種腫瘤中，miR-203的異常表達(dá)已經(jīng)被多次指出。如肺癌、胰腺癌、膀胱癌患者miR-203的高表達(dá)。Cheung等[5]研究發(fā)現(xiàn)miR-20a和miR-203與宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在本次研究中，筆者建立了SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清miR-203的方法，該方法快速簡(jiǎn)便、敏感度高、特異度好。并運(yùn)用該方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者血清中miR-203表達(dá)水平明顯高于子宮肌瘤和宮頸炎患者，子宮肌瘤和宮頸炎患者血清中miR-203表達(dá)水平?jīng)]有顯著差別，其可能會(huì)對(duì)宮頸癌輔助診斷有一定作用。

由于標(biāo)本量較少，在建立了較成熟的方法后還需增加標(biāo)本量的檢測(cè)，需要進(jìn)一步說(shuō)明試驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性。此外，由于miR-203在多種腫瘤組織中表達(dá)量都有升高，是否可以通過(guò)兩種或多種miRNA聯(lián)合診斷宮頸癌也為日后的研究提供了一個(gè)方向。

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·論著·

Serum miR - 203 expression level detected by fluorescence quantitative PCR in cervical cancer patients and its significance

YangChunlan,ShenXianjuan,JuShaoqin,SuJianyou△

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China)

Abstract:ObjectiveTo establish the method of the SYBR Green Ⅰ real-time fluorescent quantitative PCR for detecting the serum miR-203 expression level,and to detect the serum miR-203 expression levels in the patients with cervical cancer,cervical benign diseases and healthy controls.MethodsThe miR-203,U6 stem loop RT primers and the PCR amplification primers were designed for conducting fluorescence quantitative PCR,with U6 as the internal relative quantification,the serum miR-203 levels were compared among different cervical diseases.ResultsThe established method could specifically detect the amplification signal of serum miR-203,the melting curve was single and PCR products were specific.The serum miR-203 level in the patients with cervical cancer was significantly higher than that in the patients with benign cervical diseases such as hysteromyoma and cervicitis,the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionThe SYBR Green Ⅰ real-time fluorescent quantitative PCR is a quick,simple detection method with high sensitivity and good specificity,which may have a better application prospect in cervical cancer auxiliary diagnosis.

Key words:SYBR Green Ⅰ real-time fluorescent quantitative PCR;miR-203;cervical cancer

收稿日期：(2015-06-22)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.018A

文章編號(hào)：1673-4130(2015)24-3552-02

通訊作者：△E-mail:src85822584@sina.com。

作者簡(jiǎn)介：楊春蘭，女，副主任技師，主要從事臨床生化與免疫學(xué)工作。 韓富秋，女，副主任檢驗(yàn)師，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作?！?，E-mail:dhr06@163.com。