基金項(xiàng)目:陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014JM4188)。

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血流感染金黃色葡萄球菌克林霉素耐藥與分子流行病學(xué)研究*

*基金項(xiàng)目:陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014JM4188)。

周珊1，張蓓2，徐修禮1△，馮琳涵1，劉家云1，馬越云1，郝曉柯1

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所,陜西西安 710032；

2.西安交通大學(xué)附屬西安市紅十字會(huì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710054)

摘要:目的了解2014年全院血流感染金黃色葡萄球菌紅霉素對(duì)克林霉素誘導(dǎo)耐藥基因情況及分子流行病學(xué)分析。方法收集2014年全年臨床血液標(biāo)本分離的金黃色葡萄球菌。以雙紙片法篩選紅霉素對(duì)克林霉素誘導(dǎo)耐藥的表型。erm基因檢測(cè)采用PCR方法，并用spa及多位點(diǎn)序列分型(MLST)方法了解不同erm型分子流行情況。結(jié)果33株金黃色葡萄球菌中MRSA分離率78.79%。且MRSA均攜帶有ermA基因。在7株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)中，4株分別攜帶ermB或ermC基因。spa及MLST結(jié)果顯示，該院血流感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)以ST239-t030型別為主；而MSSA存在較多型別，如ST59-t437、ST398-t3625等。結(jié)論MRSA有較高分離率，主要以ST239-t030克隆株為主。erm基因主要以ermA檢出為主(86.67%)。菌株對(duì)抗菌藥物耐藥明顯，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)對(duì)克林霉素誘導(dǎo)耐藥的檢測(cè)，以指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物。

關(guān)鍵詞:血流感染；金黃色葡萄球菌；erm基因；流行病學(xué)；耐藥性

金黃色葡萄球菌是引起醫(yī)院和社區(qū)化膿性感染的主要病原菌。特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的感染，已經(jīng)成為引起醫(yī)院內(nèi)感染首要的病原菌[1]，尤其是MRSA引起的血流感染。由于MRSA往往呈現(xiàn)多重耐藥、治療困難、病死率高等特點(diǎn)，更是受到臨床及科研的廣泛關(guān)注。在臨床抗感染治療中，克林霉素由于其較強(qiáng)組織滲透性及低廉價(jià)格等優(yōu)點(diǎn)，使其成為治療金黃色葡萄球菌感染中對(duì)青霉素過(guò)敏患者的首選藥物[2]。因此，了解黃色葡萄球菌對(duì)克林霉素耐藥機(jī)制，正確檢測(cè)及解讀克林霉素體外藥敏試驗(yàn)至關(guān)重要。

本研究對(duì)2014年臨床分離的血流感染患者33株金黃色葡萄球菌進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn),用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法判讀MRSA，以雙紙片法(D實(shí)驗(yàn))篩選紅霉素對(duì)克林霉素誘導(dǎo)耐藥表型，PCR方法檢測(cè)克林霉素誘導(dǎo)耐藥erm基因，并聯(lián)合spa及多位點(diǎn)序列分型(MLST)方法以了解不同erm型分子流行情況。為臨床合理使用抗菌藥物及院內(nèi)控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料收集2014年全年血培養(yǎng)標(biāo)本分離的金黃色葡萄球菌33株；質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.2儀器與試劑培養(yǎng)基及藥敏紙片購(gòu)于英國(guó)OXOID公司，PCR反應(yīng)試劑和溶葡萄球菌酶購(gòu)于上海生工生物公司，DNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，全自動(dòng)細(xì)菌藥敏鑒定分析儀phoenix-100、基因擴(kuò)增儀、電泳儀等購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1藥敏試驗(yàn)方法采用K-B紙片法和phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀，按CLSI2014規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[3]。

1.3.2耐甲氧西林葡萄球菌確定以頭孢西丁紙片法及phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀聯(lián)合檢測(cè)，參照CLSI2014規(guī)定的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[3]。

1.3.3紅霉素對(duì)克林霉素誘導(dǎo)耐藥表型確定根據(jù)CLSI2014推薦標(biāo)準(zhǔn)，在距離紅霉素紙片(15 μg/片)20 mm處貼含有克林霉素的紙片(2 μg/片)，35 ℃孵育16～18 h,克林霉素抑菌環(huán)在近紅霉素一側(cè)縮小或出現(xiàn)截平現(xiàn)象，即呈“D”形，則說(shuō)明存在誘導(dǎo)性克林霉素耐藥，D試驗(yàn)陽(yáng)性。

1.3.4金黃色葡萄球菌全基因組DNA提取依據(jù)德國(guó)Qiagen公司的基因提取試劑盒進(jìn)行細(xì)菌全基因組提取，最后用100 μL Elution Buffer將DNA洗脫。用eppendorf的Biophotometer plus測(cè)定基因組DNA純度及濃度后放-80 ℃冰箱備用。

1.3.5erm基因檢測(cè)根據(jù)金黃色葡萄球菌erm基因序列分別設(shè)計(jì)ermA、ermB及ermC引物，并由上海生工公司合成。以提取的金黃色葡萄球菌基因組為模板在退火溫度55 ℃下進(jìn)行PCR，產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.6spa分型基于金黃色葡萄球菌A蛋白基因X區(qū)呈現(xiàn)多態(tài)性，建立spa分型方法[4]。在退火溫度為60 ℃的條件下進(jìn)行PCR操作。產(chǎn)物送上海生物工程公司測(cè)序，測(cè)序后結(jié)果在該網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3.7MLST分型依據(jù)金黃色葡萄球菌7個(gè)管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqil)不同，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型。PCR反應(yīng)引物及反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[5]。PCR產(chǎn)物測(cè)序后，進(jìn)行比對(duì)確定ST型別。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理耐藥數(shù)據(jù)采用WHONET5.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果

2.1藥敏及表型確認(rèn)試驗(yàn)33株金黃色葡萄球菌，頭孢西丁耐藥菌株26株，故MRSA為26株，占78.79%。33株細(xì)菌中有3株為紅霉素和克林霉素全敏感菌株，其他30株金黃色葡萄球菌均對(duì)紅霉素和克林霉素同時(shí)耐藥。對(duì)克林霉素耐藥形式存在誘導(dǎo)型耐藥(即D實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性)和結(jié)構(gòu)型耐藥(見(jiàn)圖1)，誘導(dǎo)耐藥為13株，占克林霉素耐藥菌的43.33%，結(jié)構(gòu)耐藥17株，占56.67%。

A:結(jié)構(gòu)型耐藥；B:誘導(dǎo)型耐藥。

圖1金黃色葡萄球菌對(duì)克林霉素耐藥表型

2.2erm基因檢測(cè)結(jié)果33株金黃色葡萄球菌中，30株細(xì)菌均攜帶有erm基因，攜帶率為90.91%(30/33)。攜帶ermA基因的為26株，占檢出erm基因的86.67%(26/30)，僅3株菌攜帶ermB基因，占10%(3/30)，7株菌攜帶ermC基因，占23.33%(7/30)。同時(shí)攜帶ermA和ermC基因有6株細(xì)菌，占20%(6/30)，僅有1株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)只攜帶ermC基因。菌株erm基因分型結(jié)果見(jiàn)圖1。

M:DNA標(biāo)志物；1:ermA (共20株);2:ermB(共3株);3:ermC(共1株);4:ermA+ermC(共6株);5:未檢出erm基因(共3株)。

圖233株菌erm基因分型結(jié)果

2.3菌株spa及MLST分型結(jié)果spa分型結(jié)果顯示，33株金黃色葡萄球菌共存在8個(gè)spa型別，spa分型PCR產(chǎn)物見(jiàn)圖2，相對(duì)分子質(zhì)量在300 bp左右。其中t030為24株占72.73%，為主要型別。其他型別還有t437(2株占6.06%)、t037(2株占6.06%)、t002、t3625、t2092、t091、t1793各1株。對(duì)7個(gè)管家基因(gmk、glpF、aroE、tpi、yqil、arcC、pta)進(jìn)行PCR，產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)后顯示，共存在6個(gè)ST型別：ST239(26株占78.79%)；ST59、ST398均為2株(占6.06%)；ST121、ST7、ST5均為1株。并且所有的MRSA均為MST-ST239型別。

M:DNA標(biāo)志物；1:spa-t030;2:spa-t2092;3:spa-t1793;4:spa-t037;5:spa-t3625;6:spa-t437;7:spa-t091;8:spa-t002。

圖3不同spa型別PCR反應(yīng)產(chǎn)物

2.4erm基因在不同型別菌株中分布菌株分子型別與erm基因攜帶及耐藥數(shù)據(jù)分析見(jiàn)表1。從數(shù)據(jù)中可以看出，在33株血流感染金黃色葡萄球菌中，MRSA菌株26株，同時(shí)所有MRSA菌株均為ST239型別。依據(jù)spa和MLST聯(lián)合分型來(lái)看，MRSA菌株除2株細(xì)菌為ST239-t037，其他24株菌均為ST239-t030。ermA基因只在MRSA菌株中檢出。且紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥表型共13株，均攜帶ermA基因。結(jié)構(gòu)性耐藥表型攜帶erm基因種類較多。其中有6株結(jié)構(gòu)型耐藥細(xì)菌同時(shí)攜帶ermA和ermC基因。

表1　　erm基因在不同型別菌株中的分布情況

續(xù)表1　　erm基因在不同型別菌株中的分布情況

3討論

金黃色葡萄球菌是引起各種重癥感染的主要病原菌之一[6]，近年來(lái)由于抗菌藥物的不合理使用，使MRSA的檢出率逐年增加并呈現(xiàn)多藥耐藥的趨勢(shì)[7]。并且統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示MRSA耐藥率明顯高于MSSA[7]。MRSA不僅僅對(duì)β-內(nèi)酰胺類、酶抑制劑復(fù)合抗菌藥物及碳青霉烯類耐藥，大部分同時(shí)對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類，林可霉素類，喹諾酮類等均有較高耐藥率[7]。眾所周知，金黃色葡萄球菌引起的血流感染，患者病情兇險(xiǎn)，治療難度大[8]。所以MRSA血流感染的治療相當(dāng)棘手。并且數(shù)據(jù)資料顯示臨床分離自血流感染的金黃色葡萄球菌對(duì)紅霉素和克林霉素的耐藥率均大于50%[8]。因此，了解金黃色葡萄球菌對(duì)紅霉素和克林霉素耐藥產(chǎn)生機(jī)制，對(duì)感染預(yù)防治療極其重要。

金黃色葡萄球菌對(duì)紅霉素和克林霉素的耐藥機(jī)制主要有兩種，一種是能量依賴的主動(dòng)泵出機(jī)制，一種是由erm基因編碼導(dǎo)致23SrRNA甲基化，通過(guò)降低藥物對(duì)核糖體的結(jié)合而產(chǎn)生的耐藥。erm基因介導(dǎo)的耐藥，在表型上分為兩種，即誘導(dǎo)型耐藥和結(jié)構(gòu)型耐藥[9]。

本研究數(shù)據(jù)顯示，本院2014年臨床分離血流感染金黃色葡萄球菌患者共33株，MRSA分離率為78.79%，且所有MRSA菌株均為ST239并檢出ermA基因。說(shuō)明ermA基因主要存在于MRSA中。與文獻(xiàn)報(bào)道不同[8-9]，ermB僅在3株MSSA結(jié)構(gòu)型耐藥菌株中檢出，同時(shí)只有1株MSSA菌株檢出只攜帶ermC基因，單獨(dú)攜帶ermB或者ermC基因檢出率較低。在誘導(dǎo)型耐藥菌株中，只檢出ermA基因。這些現(xiàn)象可能與地域分布存在密切關(guān)系[10]。

從紅霉素和克林霉素耐藥上來(lái)看，33株金黃色葡萄球菌中30株細(xì)菌存在耐藥，耐藥率高達(dá)90.91%，且誘導(dǎo)型耐藥表型占相當(dāng)比例(43.33%)。證明本院紅霉素和克林霉素耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重。但由于目前微生物自動(dòng)化鑒定及藥敏儀器的逐步普及，大部分三甲醫(yī)院已不再用克林霉素紙片法檢測(cè)藥敏，而是直接通過(guò)自動(dòng)化儀器的微量稀釋法報(bào)告MIC結(jié)果。這使得誘導(dǎo)型克林霉素耐藥菌株出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，可能會(huì)導(dǎo)致臨床治療的失敗。所以，提倡實(shí)驗(yàn)室在自動(dòng)化儀器鑒定藥敏時(shí)，能夠采用D試驗(yàn)檢測(cè)誘導(dǎo)型耐藥表型。該方法簡(jiǎn)單易行，適合臨床實(shí)驗(yàn)室推廣。

從分子表型上來(lái)看，13株誘導(dǎo)型耐藥菌均為ST239-t030型MRSA菌株，并且全部攜帶ermA一種耐藥基因。而17株結(jié)構(gòu)型耐藥菌株攜帶的erm基因型別較多。此數(shù)據(jù)說(shuō)明，在本院紅霉素克林霉素誘導(dǎo)型耐藥主要由ermA基因所致，且該菌株型別為ST239-t030型MRSA。同時(shí)證明該型別菌株存在克隆傳播現(xiàn)象，因此，臨床感染工作人員應(yīng)加強(qiáng)生物安全觀念，提高耐藥菌株檢出率，及時(shí)采取有效的控制措施，有效防止耐藥菌株產(chǎn)生及傳播。

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本刊聲明

《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》2015年36卷第8期刊發(fā)文章《胰島素泵聯(lián)合諾和靈30R治療糖尿病合并肺部感染的療效及檢驗(yàn)指標(biāo)分析》一文，通訊作者為王瑩，電子郵箱：150476755@qq.com。

《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》編輯部

2015-12-30

·論著·

Study on clindamycin resistance and molecular epidemiology of bloodstream infection by Staphylococcus aureus*

ZhouShan1,ZhangBei2,XuXiuli1△,FengLinhan1,LiuJiayun1,MaYueyun1,HaoXiaoke1

(1.PLAResearchInstituteofClinicalLaboratoryMedicine,XijingHospital,FourthMilitaryMedical

University,Xi′an,Shaanxi710032,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,Affiliated

Xi′anRedCrossHospital,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710054,China)

Abstract:ObjectiveTo understand the clindamycin resistance gene and molecular epidemic of Staphylococcus aureus in the patients with bloodstream infection in our hospital during 2014.MethodsThe clinical isolates of Staphylococcus aureus in clinical bloodstream infection were collected during 2014.The phenotype of erythromycin to clindamycin induced resistance was assessed by D test.The erm gene was detected by PCR.The different erm types of the molecular epidemiology of Staphylococcus aureus were studied by spa and MLST typing.ResultsIn 33 strains of Staphylococcus aureus,the isolation rate of MRSA strains were 78.79%,moreover all of MRSA strains carried ermA gene.In 7 strains of methicillin sensitive Staphylococcus aureus(MSSA),4 strains respectively carried ermB or ermC gene.The results of MLST and spa results showed that the main type of MRSA in our hospital was ST239-t030.But MSSA had more types,such as ST59-t437,ST398-t3625 and so on.ConclusionMRSA has higher isolation rate in our hospital,which is dominated by ST239-t030 type.For the detection of gene erm,ermA (86.67%) is the main type.The strains are obviously resistant to antibacterial drugs.The laboratory should strengthen the detection of clindamycin induced resistance for guiding the clinical rational use of antibacterial drugs.

Key words:bloodstream infection;Staphylococcus aureus;erm gene;epidemiology;drug resistance

收稿日期：(2015-08-02)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.004A

文章編號(hào)：1673-4130(2015)24-3517-03

通訊作者△,Email:xxlxxl@fmmu.edu.cn。

作者簡(jiǎn)介：周珊，女，主管檢驗(yàn)技師，主要從事微生物診斷及耐藥機(jī)制研究。