石亞玲，趙　蓉，陳偉烈

(廣州市第八人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.研究所，廣東廣州 510060)

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流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)登革熱患者T淋巴細(xì)胞研究

石亞玲1，趙蓉1，陳偉烈2

(廣州市第八人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.研究所，廣東廣州 510060)

摘要:目的探討登革熱患者的免疫狀況。方法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)登革熱患者的T淋巴細(xì)胞，從而分析患者的免疫狀況。結(jié)果與健康者的參考范圍進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)登革熱患者的T淋巴細(xì)胞比例相對(duì)于健康者顯著降低。CD3+CD4+、CD3+CD8+的淋巴細(xì)胞百分比分別為(36.54±9.78)%、(17.7±10.01)%，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD3+CD4+的淋巴細(xì)胞數(shù)為(49.98±240.2)cells/μL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)、CD3+CD8+細(xì)胞數(shù)為(380.9±364.6)cells/μL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CD3+細(xì)胞數(shù)(874.8±541.2)cells/μL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論登革熱患者免疫狀況異常，T淋巴細(xì)胞比例相對(duì)于健康者顯著降低。

關(guān)鍵詞:流式細(xì)胞術(shù)；登革熱；免疫狀況

登革熱是由登革病毒引起，經(jīng)伊蚊傳播的一種急性傳染病，潛伏期通常約5～7 d，具有傳播迅猛、發(fā)病率高等特點(diǎn)。登革熱患者有可能出現(xiàn)極度疲倦及抑郁癥狀，少數(shù)患者會(huì)惡化至登革出血熱，并進(jìn)一步發(fā)生出血、休克，乃至死亡，登革熱引起的并發(fā)癥往往是患者致死的主因。一般來(lái)說(shuō)登革熱主要分布在熱帶及亞熱帶地區(qū)。每年世界上有1億人受到登革病毒感染，近年來(lái)，隨著旅游業(yè)的發(fā)展和全球溫暖化，登革熱疫情日益嚴(yán)重，已經(jīng)成為一個(gè)世界性的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題[1]。郭汝寧等[2]報(bào)道2005～2010年廣東每年都有發(fā)生登革熱病例現(xiàn)象。

登革熱發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚，相關(guān)假說(shuō)有:病毒親嗜性、病毒毒力學(xué)說(shuō)、宿主的易感因素、抗體依賴性增強(qiáng)感染作用(ADE)、交叉反應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)及細(xì)胞因子風(fēng)暴等假說(shuō)。登革病毒通過(guò)伊蚊叮咬進(jìn)入人體，在單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和淋巴組織中復(fù)制至一定數(shù)量后，即進(jìn)入血循環(huán)(第1次病毒血癥)，然后再定位于單核吞噬系統(tǒng)和淋巴組織之中[3]。

交叉反應(yīng)性T細(xì)胞的激活假說(shuō)是促進(jìn)登革病毒感染臨床進(jìn)程的關(guān)鍵，與DHF/DSS發(fā)生有關(guān)。CD8+T細(xì)胞可以在DENV感染早期控制病毒感染，但是，在清除感染細(xì)胞的同時(shí)CD8+T也參與了DENV感染的病理過(guò)程。病毒可以誘導(dǎo)出不同的交叉反應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)，這些低親和力非中和性的細(xì)胞無(wú)法有效地清除病毒。在初次感染登革病毒的小鼠中，只產(chǎn)生少量的登革特異性CD4+T細(xì)胞；然而，4個(gè)血清型的登革病毒二次感染后將導(dǎo)致CD4+T 細(xì)胞的反應(yīng)明顯增加，不但提高了CD4+T細(xì)胞的INF-γ分泌水平，也增加了CD8+T 細(xì)胞的活化[3-4]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)登革熱患者的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，分析患者是否出現(xiàn)T細(xì)胞免疫異常。

1資料與方法

1.1一般資料收集本院確診登革熱患者1 112例，平均年齡(48.5±10.88)歲，無(wú)相關(guān)自身免疫性疾病、腫瘤或近期感染史，50例健康者作為對(duì)照組。登革熱患者的主要臨床癥狀：發(fā)熱、食欲下降、惡心、嘔吐；皮疹持續(xù)3～4 d，一般與發(fā)熱同時(shí)消退；不同部位、不同程度的出血，如消化道出血，血尿及陰道出血等；淋巴結(jié)腫大。

1.2儀器與試劑儀器為BD CantoII，試劑為CD3、FITC/CD8、PE/CD45、PERCP/CD4、APC、溶血素、絕對(duì)計(jì)數(shù)管，均購(gòu)自BD公司。

1.3方法抗體與外周血加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中孵育15 min，加入500 μL 1×溶血素，避光孵育10 min，震蕩混勻，上機(jī)檢測(cè)。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，若方差不齊，則組間比較采用秩和檢驗(yàn)。使用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行作圖分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出各細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)值，與健康者進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)登革熱患者的T淋巴細(xì)胞比例相對(duì)于健康者顯著降低。CD3+CD4+、CD3+CD8+的淋巴細(xì)胞百分比分別為(36.54±9.78)%、(17.7±10.01)%，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD3+CD4+的淋巴細(xì)胞數(shù)為(49.98±240.2)cells/nL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P<0.05)、CD3+CD8+細(xì)胞數(shù)為(380.9±364.6)cells/nL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CD3+細(xì)胞數(shù)(874.8±541.2)cells/nL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

1 112例登革熱患者中，總體趨勢(shì)相對(duì)健康者是降低，但是也有患者在正常范圍之內(nèi)，也有患者是呈升高趨勢(shì):其中CD3+低于正常值的人數(shù)占64%，高于正常值的占2%；CD3+CD4+低于正常值的人數(shù)占60%，高于正常值的占1%；CD3+CD8+低于正常值的人數(shù)占50%，高于正常值的占7%,Th/Ts低于正常值的人數(shù)占6%，高于正常值的占16%。

表1　　登革熱患者與健康者T細(xì)胞統(tǒng)計(jì)

*：P<0.05，與對(duì)照組比較。

圖1　　登革熱患者與健康者T細(xì)胞比較

3討論

對(duì)于登革病毒，目前并沒有特異的疫苗與病原治療藥物，主要采取對(duì)癥治療措施，醫(yī)生盡可能做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療[5-6]。登革出血熱，有休克、出血等嚴(yán)重癥狀，需積極處理。休克者應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充血容量，可選用右旋糖酐40(低分子右旋糖酐)、平衡鹽液、葡萄糖鹽水等。目前很多種具有應(yīng)用前景的登革熱疫苗和抗病毒藥物正在開發(fā),進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但是仍存在許多亟待解決的問題[7]。

登革熱發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明，其癥狀的嚴(yán)重程度受多種因素的影響。初次感染登革病毒,臨床上表現(xiàn)為典型登革熱,不發(fā)生出血和休克。再次感染異型登革病毒時(shí),病毒在血液中與原有的抗體結(jié)合,形成免疫復(fù)合物,激活補(bǔ)體,引起組織免疫病理?yè)p傷,臨床上呈現(xiàn)出血和休克。涉及參與的免疫反應(yīng)包括體液免疫、細(xì)胞免疫、Fc受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等多個(gè)機(jī)制,彼此相互交錯(cuò)、促進(jìn)和制約,推動(dòng)疾病的進(jìn)程[8]。

宿主的易感性影響到宿主對(duì)登革病毒感染的免疫應(yīng)答，而免疫應(yīng)答產(chǎn)生的細(xì)胞因子和交叉反應(yīng)性T細(xì)胞在清除病毒的同時(shí)又可以引起組織和細(xì)胞損傷，加之病毒血清型毒力不同，產(chǎn)生的二次感染誘導(dǎo)ADE，使病理過(guò)程更加嚴(yán)重。最近有研究同樣表明，登革病毒感染后首要靶細(xì)胞是單核細(xì)胞，而不是T 細(xì)胞或B 細(xì)胞[3,9-10]。

本研究中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出各細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)值，與健康者進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)登革熱患者的T淋巴細(xì)胞比例相對(duì)于健康者顯著降低。CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+與健康者相比顯著降低。在1 112例登革熱患者中，總體趨勢(shì)相對(duì)健康者是降低，但是也有患者在正常范圍之內(nèi)，也有患者是呈升高趨勢(shì):其中CD3+低于正常值的人數(shù)占64%，高于正常值的占2%；CD3+CD4+低于正常值的人數(shù)占60%，高于正常值的占1%；CD3+CD8+低于正常值的人數(shù)占50%，高于正常值的占7%,Th/Ts低于正常值的人數(shù)占6%，高于正常值的占16%。大多數(shù)研究機(jī)制都說(shuō)明T細(xì)胞會(huì)降低[11]，本研究中發(fā)現(xiàn)有一部分登革熱患者T細(xì)胞升高，不管是升高還是降低，說(shuō)明其免疫機(jī)制是紊亂的，具體的免疫機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

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·論著·

Study on flow cytometry for detecting T lymphocytes in patients with dengue fever*

ShiYaling1,ZhaoRong1,ChenWeilie2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.ResearchInstitute,GuangzhouMunicipalEighth

People′sHospital,Guangzhou,Guangdong510060,China)

Abstract:ObjectiveTo investigarte the immune status in the patients with dengue fever.MethodsThe flow cytometry was used to detect the T lymphocytes in the patients with dengue fever for analyzing their immune status.ResultsCompared with the reference range in the healthy individuals,it was found that the T lymphocyte proportion in the patients with dengue fever was significantly reduced compared with the healthy individuals.The percentages of CD3+CD4+and CD3+CD8+lymphocytes were (36.54±9.78)% and (17.7±10.01)% respectively,which had statistical difference compared with the control group(P<0.05),CD3+CD4+lymphocyte count was (49.98±240.2)cells/μL,the difference was statistically significant (P<0.05),CD3+CD8+lymphocytes count was (380.9±364.6)cells/μL,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe immune status in the patients with dengue fever is abnormal,T lymphocyte percentage is significantly reduced compared with the healthy individuals.

Key words:flow cytometry；dengue fever；immune status

作者簡(jiǎn)介：潘秋榮，男，副主任檢驗(yàn)師，主要從事臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)研究。

收稿日期：(2015-05-12)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.013A

文章編號(hào)：1673-4130(2015)24-3541-02