黃玉薩， 謝家駿， 胡風麗（上海中醫(yī)藥大學藥物安全評價研究中心，上海201203）

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類胰蛋白酶在過敏性疾病診斷中的研究進展

黃玉薩， 謝家駿*， 胡風麗
（上海中醫(yī)藥大學藥物安全評價研究中心，上海201203）

類胰蛋白酶屬于肥大細胞和嗜堿性粒細胞的特異性活性物質(zhì)，當激活時以肥大細胞脫顆粒形式與其它介質(zhì)一起釋放，具有促進氣道的修復(fù)、調(diào)節(jié)氣道平滑肌細胞的張力和反應(yīng)性、刺激肥大細胞的活化等作用，與支氣管哮喘、慢性蕁麻疹、過敏性休克、全身過敏反應(yīng)等病情相關(guān)，在中藥注射劑過敏性疾病的鑒別診斷中起重要作用。本文主要從類胰蛋白酶的分子生物學基礎(chǔ)、功能、生物穩(wěn)定性、檢測方法及其對過敏性疾病的診斷等方面進行了綜述，以期為類胰蛋白酶作為生物標志物在診斷過敏性疾病中的應(yīng)用提供參考。

類胰蛋白酶；肥大細胞；過敏；中藥注射劑

類胰蛋白酶是一種中性蛋白酶，主要存在肥大細胞和嗜堿性粒細胞分泌顆粒中，當肥大細胞脫顆粒時，類胰蛋白酶隨其他介質(zhì)一起釋放，參與過敏性炎癥過程。目前，對類胰蛋白酶分子生物學基礎(chǔ)及功能的研究已比較充分，類胰蛋白酶具有促進氣道的修復(fù)、調(diào)節(jié)氣道平滑肌細胞的張力和反應(yīng)性、刺激肥大細胞的活化等［1］作用。鑒于類胰蛋白酶的上述生理特性以及在體液中半衰期較長的特點，近年來，其在肥大細胞相關(guān)疾病診斷中的應(yīng)用已受到越來越多的關(guān)注。本文主要從類胰蛋白酶的分子生物學基礎(chǔ)、生物穩(wěn)定性以及過敏性疾病診斷等方面對相關(guān)文獻進行綜述，以期為類胰蛋白酶作為生物標志物在過敏性疾病診斷中的應(yīng)用提供參考。

1　類胰蛋白酶的分子生物學基礎(chǔ)

類胰蛋白酶是一種30～35 kDa的中性絲氨酸糖蛋白，主要存在肥大細胞中，嗜堿性粒細胞中雖也少量含有，但僅為肥大細胞含有量的0.2%［2］。另外，類胰蛋白酶是肥大細胞中最主要的酶，含有量高達20%［3］。肥大細胞類胰蛋白酶主要有兩類基因編碼：α類胰蛋白酶和β類胰蛋白酶基因［4］。肥大細胞有兩種分型：黏膜肥大細胞 （MCT）和結(jié)締組織肥大細胞（MCTC），α和β類胰蛋白酶mRNA在MCT和MCTC都有表達。由于體內(nèi)沒有α前體蛋白的處理機制，α前體蛋白沒有酶活性。體外成熟α類胰蛋白酶重組體的情況表明，即使在體內(nèi)形成了成熟的α類胰蛋白酶，它對小分子合成底物仍沒有酶活性及蛋白水解活性［5-6］。

成熟的β類胰蛋白酶以具有酶活性的蛋白多糖、肝素結(jié)合四聚體形式存在于分泌顆粒中［7］。所有酶活性位點位于二維四聚體的中心，該結(jié)構(gòu)限制了抑制劑或底物的接近，解釋了其對生物抑制劑抵抗的現(xiàn)象［8］。肥大細胞靜止時只能自發(fā)分泌前體類胰蛋白酶，受到激發(fā)時才會釋放成熟的類胰蛋白酶［5］。

2　類胰蛋白酶的功能

每個肥大細胞里活性類胰蛋白酶的量為10～35 pg。由于類胰蛋白酶四聚體通過絲氨酸蛋白酶的生物抑制劑抑制［8］，它釋放到體內(nèi)后活性調(diào)控機制尚不十分清楚。堿性蛋白如抗凝血酶III能使類胰蛋白酶從肝素中解離，從而使肝素中的類胰蛋白酶活性降低，其過程是緩慢而不完全的。β類胰蛋白酶在pH 6條件下降解纖維蛋白原的速率比pH 7.4條件下快了將近50倍［9］。近似的酸性pH更適于β前體類胰蛋白酶的加工及肺部來源的類胰蛋白酶分解［10］。因此，在酸性環(huán)境下 （哮喘患者氣道表面，炎癥位點等）β類胰蛋白酶釋放更適于水解蛋白質(zhì)，在中性環(huán)境下β類胰蛋白酶釋放會導致蛋白水解活性下降。在中性pH環(huán)境下，β類胰蛋白酶從穩(wěn)定的聚陰離子如肝素解離后，從有活性的四聚體轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的單體。將無活性的類胰蛋白酶單體置于酸性環(huán)境下會使這些單體重組成具有催化活性的四聚體［11］?；钚运木垠w重構(gòu)的機制在于無活性的單體和有活性單體之間的相互轉(zhuǎn)化［12］。

蛋白酶激活受體（protease activate receptors，PARs）是絲氨酸蛋白酶受體，包括PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4，其中，PAR-2廣泛分布于人體器官中，如：胃腸道、胰、腎、肝、氣道、前列腺、卵巢和眼睛等，同時，也發(fā)現(xiàn)它存在于內(nèi)皮細胞、上皮細胞、平滑肌細胞、T淋巴細胞系、中性粒細胞和其他人類細胞中。在過敏反應(yīng)性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，PAR-2與過敏反應(yīng)密切相關(guān)。有些疾病動物模型試驗結(jié)果表明PAR-2激活能引起呼吸道的過敏性炎癥反應(yīng)，但另一些則表明其在過敏性疾病中有保護作用［13］。PARs在皮膚過敏中也有一定的作用，在PAR-2缺陷小鼠免疫細胞如中性粒細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞和嗜酸性粒細胞的浸潤被顯著抑制［14］。為了明確免疫細胞表達的PAR-2和分泌的蛋白酶的在特應(yīng)性皮炎發(fā)生發(fā)展中的作用，有必要在臨床研究中應(yīng)用蛋白酶抑制劑和PAR-2拮抗劑。

3　類胰蛋白酶的生物穩(wěn)定性

速發(fā)型過敏刺激時，類胰蛋白酶在血液中的質(zhì)量濃度一般在致敏后1～2 h達高峰，遲緩型過敏刺激時如食物過敏在血液中的達峰時間為30～60 min。類胰蛋白酶由于其在血液循環(huán)系統(tǒng)清除的半衰期約為2 h，按照升高的峰值可能在血液循環(huán)系統(tǒng)維持數(shù)小時。若高峰值在100 ng/mL的類胰蛋白酶，6 h后血液水平約為10 ng/mL，而高峰值在800 ng/mL，血液水平回到10 ng/mL則需12 h。800 ng/mL是目前觀察到的系統(tǒng)性過敏患者的血清最高水平。當類胰蛋白酶體外保存在-20℃或者更低溫度時它的免疫反應(yīng)性至少能保持一年［15］。

類胰蛋白酶的降解途徑至今還不十分清楚。Michae1等研究顯示，在系統(tǒng)性肥大細胞增多癥或特發(fā)性過敏反應(yīng)患者中，類胰蛋白酶的消除并不是經(jīng)血入尿［16］。另外，Kitoh也表明，在腎病晚期患者中，類胰蛋白酶也未經(jīng)過尿液途徑消除。在腎機能不全和干細胞因子減少的病理狀態(tài)下，由于腎臟濾過功能的障礙，機體可能通過其他機制影響類胰蛋白酶在血漿中的水平［17］。類胰蛋白酶水平在循環(huán)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機制尚需要研究。

4　類胰蛋白酶的臨床檢測

類胰蛋白酶主要存在肥大細胞中，血液中含有量很低，不易檢測。但是當過敏引起肥大細胞脫顆粒時，類胰蛋白酶大量被釋放，血液類胰蛋白酶含有量急劇增多。近年來，繼傳統(tǒng)比色法后，很多新的檢測方法相繼出現(xiàn)，測定體液中的類胰蛋白酶含有量的方法具體介紹如下。

4.1酶聯(lián)免疫分析（ELISA） 采用不同種屬的單克隆抗體和類胰蛋白酶抗原抗體反應(yīng)對類胰蛋白酶進行免疫分析。抗類胰蛋白酶抗體B12（mAbB12）作為一抗，用生物素化的G5單克隆抗體 （mAbG5）可檢測成熟的類胰蛋白酶，對于成熟的自然和重組形式的α及β類胰蛋白酶，只有mAbG5能識別其中的線性抗原決定簇；總類胰蛋白酶 （包括前體及成熟的α、β類胰蛋白酶）則可以用G4單克隆抗體 （mAbG4）進行檢測。成熟類胰蛋白酶的檢測（mAbB12，mAbG5）通常采用ELISA進行測定［18］。

4.2熒光酶聯(lián)免疫分析 （FEIA） 此法用來檢測樣本總的類胰蛋白酶含有量，可采用ImmunoCAP全自動過敏源檢測儀進行檢測，目前已經(jīng)商業(yè)化?？诡愐鹊鞍酌缚贵w預(yù)先結(jié)合在ImmunoCAP固相載體中，37℃孵育，與血液樣本中的類胰蛋白反應(yīng)，形成類胰蛋白酶ImmunoCAP抗類胰蛋白酶復(fù)合物，洗脫；加入酶標二抗，形成酶標二抗、抗類胰蛋白酶抗體與待測類胰蛋白酶的復(fù)合物，再次洗脫；加入底物，產(chǎn)生酶催化熒光產(chǎn)物；終止液終止反應(yīng)，測定熒光值。根據(jù)標準曲線計算血清類胰蛋白酶含有量 （μg/L）［19］。

4.3類胰蛋白酶活力測定 類胰蛋白酶具有與胰蛋白酶類似的特點，能催化水解賴氨酸和精氨酸羧基所形成的肽鍵，常見于體外檢測；采用專一性底物［20］Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽（BAPNA）。以20 mg BAPNA溶于1 mL二甲基亞砜中，取20μL加入0.65 mL反應(yīng)緩沖液為Tris·HC1（鹽酸三羥甲基氨基甲烷，0.1 mo1/L，pH 7.4）中震蕩混勻，加入待測液 （血清等）100μL震蕩混勻，30℃反應(yīng)30 min后，加入0.25 mL 30%乙酸終止反應(yīng)。酶標儀405 nm測光吸收值。配制胰蛋白酶標準溶液，描記標準曲線，計算類胰蛋白酶的含有量。

4.4免疫組織化學分析 對于組織石蠟切片，可通過免疫組化法檢測肥大細胞顆粒內(nèi)及細胞周圍的類胰蛋白酶，通過圖像分析系統(tǒng)，觀測類胰蛋白酶的分布及半定量，同時還可間接地判斷肥大細胞的激活情況，有助于判斷發(fā)生的過敏反應(yīng)的類型［19，21］。

4.5免疫印跡（Western b1ot） Western b1ot分析肥大細胞特征性蛋白酶類胰蛋白酶在各個臟器組織中的表達水平?？蛇xGADPH（人磷酸苷油酸脫氫酶）為內(nèi)參照，在34 kDa左右表達類胰蛋白酶［22］。

5　類胰蛋白酶對過敏性疾病的診斷

5.1支氣管哮喘 支氣管哮喘簡稱哮喘，一直被認為與I型變態(tài)反應(yīng)密切相關(guān)，而肥大細胞是介導I型變態(tài)反應(yīng)的重要成分之一。肥大細胞經(jīng)FceRI受體依賴性途徑激活后釋放大量炎癥性介質(zhì)，其中類胰蛋白酶可引起嗜酸性粒細胞趨化和增殖，參與哮喘等疾病的慢性炎癥反應(yīng)［23］。謝華等［24］分別對30例健康人、哮喘急性期中度和重度患者進行類胰蛋白酶測定，結(jié)果顯示急性期哮喘組血漿類胰蛋白酶值（2.8μg/L）與對照組（1.2μg/L）比較顯著升高（P＜0.05）。朱麗君等［25］對23例哮喘青春期緩解患者、15例哮喘青春期患者和29例正常人進行吸入性過敏原的類胰蛋白酶檢測，3組類胰蛋白酶測定結(jié)果比較，有顯著差異 （P＜0.01），哮喘青春期緩解組血漿類胰蛋白酶增高率明顯低于哮喘組，但又明顯高于正常對照組。陳麗萍［26］分別對45例健康兒童、哮喘急性期中度和重度患兒進行類胰蛋白酶測定，結(jié)果顯示，急性期哮喘患兒血漿類胰蛋白酶值（2.65μg/L）與對照組（1.24μg/L）比較明顯升高（P＜0.05），緩解期哮喘患兒血漿類胰蛋白酶值（1.75μg/L）與急性期（2.65μg/L）比較明顯降低（P＜0.05）。許以平等［27］檢測了36例哮喘患者及29例健康人血漿中激活肥大細胞的特征性標志物類胰蛋白酶值，發(fā)現(xiàn)哮喘組血漿類胰蛋白酶的增高率為36.11% （13/36），明顯高于健康組的10.34% （3/29）。

隨著類胰蛋白酶與哮喘疾病關(guān)系認識的提高，近年來有學者嘗試采用類胰蛋白酶抑制劑對過敏性哮喘進行治療。類胰蛋白酶抑制劑種類很多，APC366是一種競爭性抑制劑，特應(yīng)性哮喘患者吸入APC366后，哮喘反應(yīng)明顯減弱［28］。類胰蛋白酶抑制劑可降低哮喘患者對吸入性過敏原的哮喘樣反應(yīng)［29］。肝素以離子鍵與肥大細胞β類胰蛋白酶相結(jié)合，能使類胰蛋白酶具有酶活性的四聚體狀態(tài)更加穩(wěn)固，因此，很多研究者也在積極尋找針對肝素的類胰蛋白酶抑制劑。聚凝胺（po1ybrene）和魚精蛋白（protamine）臨床上被用于手術(shù)后中和肝素，恢復(fù)血液正常功能，對人肺類胰蛋白酶和重組小鼠類胰蛋白酶有強效抑制作用，可用于肥大細胞介導的哮喘的治療［30］。

5.2過敏性休克 過敏性休克，尤其是藥物過敏性休克，發(fā)病突然，難以預(yù)見，嚴重者危及生命。1989年，Schwartz［15］等發(fā)現(xiàn)在過敏性休克后1～2 h，類胰蛋白酶水平顯著升高，4 d后，仍能在血清 （血漿）中檢出類胰蛋白酶，提示類胰蛋白酶可作為過敏性休克的指標，為臨床診斷與治療提供依據(jù)。林屹［31］應(yīng)用類胰蛋白酶免疫組化染色方法觀察了30例過敏性休克致死和8例非過敏性休克致死病例的臟器，發(fā)現(xiàn)在非過敏原因致死的病例中，肺、腸等組織未見類胰蛋白酶染色陽性細胞；過敏性休克致死病例中，肺組織內(nèi)見大量類胰蛋白酶染色陽性細胞，在支氣管黏膜上皮細胞也可見類胰蛋白酶染色陽性顆粒。郭薇等［32］建立豚鼠異種血清過敏性休克模型，采用專屬性底物BAPNA對模型鼠的血清、肺、氣管類胰蛋白酶活力進行測定，結(jié)果顯示，過敏性休克豚鼠在血清、氣管、肺中類胰蛋白酶活力明顯高于對照組。沈憶文等［33］對3例過敏性休克死亡者進行類胰蛋白酶檢測，其中2例血清類胰蛋白酶的含有量分別為52 ng/mL和血清（血漿）121 ng/mL，高于正常值10倍以上。米麗等［34］對大鼠過敏性休克死亡動物模型進行類胰蛋白酶測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)類胰蛋白酶水平明顯高于對照組。血清類胰蛋白酶在室溫條件下可隨保存時間的延長（72 h內(nèi)）呈升高趨勢 （P＜0.05），而在冷藏條件下，類胰蛋白酶隨時間無明顯變化 （P＞0.05），提示冷藏保存更利于類胰蛋白酶的穩(wěn)定。

5.3慢性蕁麻疹 慢性蕁麻疹 （CU）［35］是一種過敏性炎癥反應(yīng)，癥狀的產(chǎn)生主要由肥大細胞和嗜堿性粒細胞活化后釋放的組胺、蛋白水解酶以及合成和分泌的化學遞質(zhì)、細胞因子所引起。Ferrer等［36］對81例慢性蕁麻疹患者血清檢查中發(fā)現(xiàn)，類胰蛋白酶含有量為 （6.6±4.1）μg/L，與正常對照組 （4.4±2.2）μg/L相比，差異具有統(tǒng)計學意義。2001～2002年，沈志鴻等［37-38］先后對43例慢性蕁麻疹患者和58例正常人進行類胰蛋白酶檢測，發(fā)現(xiàn)慢性蕁麻疹患者類胰蛋白酶水平及陽性率與正常對照組比顯著提高（P＜0.01）。任華麗［39］報道1例肺癌患者靜脈點滴白介素-2（IL-2）后30min出現(xiàn)全身性蕁麻疹，急性期 （發(fā)病3 h）及緩解期（第7天）類胰蛋白酶水平分別為17.0μg/L和5.46μg/L，相差近3倍。國外學者Hidvégi［40］對50例CU患者外周血中類胰蛋白酶含有量進行測定，發(fā)現(xiàn)其平均值為7.1μg/L，其增高的水平與蕁麻疹的病情嚴重程度成正相關(guān)。

5.4全身過敏反應(yīng) 研究發(fā)現(xiàn)，急性全身性過敏反應(yīng)發(fā)生后，血清中類胰蛋白酶的含有量明顯升高［19］。任麗華等［41］對7例嚴重全身過敏反應(yīng)急性發(fā)作期進行類胰蛋白酶檢測，平均類胰蛋白酶水平為 （17.4±7.87）μg/L，與正常人（4.36±1.67）μg/L相比，顯著升高 （P＜0.01）。Lin等［42］對97例急性嚴重過敏癥狀患者進行研究，其中有20例血清類胰蛋白酶質(zhì)量濃度升高 （＞15μg/L）。程芳［43］采用大鼠尾靜脈注射雙黃連注射液，給藥后5 min取血，結(jié)果顯示，雙黃連注射劑高劑量組 （800 mg/kg）的血清類胰蛋白酶水平明顯高于生理鹽水對照組 （P＜0.05）。夏贊韶［44］采用大鼠尾靜脈注射不同劑量的雙黃連注射液（200、400、800mg/kg），給藥后10min各劑量給藥組大鼠血清類胰蛋白酶質(zhì)量濃度均呈明顯升高，且其質(zhì)量濃度變化趨勢與給藥劑量呈正相關(guān)，其中高劑量組類胰蛋白酶質(zhì)量濃度達 （394.4±82.3）ng/mL。李中港等［45］在對不同品系大鼠Ⅰ型超敏反應(yīng)敏感性的比較中發(fā)現(xiàn)，BN大鼠在注射給予卵清蛋白溶液10、20、40μg/kg和Wistar大鼠在注射給予卵清蛋白溶液40μg/kg劑量下，血清類胰蛋白酶質(zhì)量濃度均顯著性升高 （P＜0.01）。楊劍婷等［46］對白果蛋白過敏試驗研究中發(fā)現(xiàn)，給予白果蛋白后，小鼠血清類胰蛋白酶活性顯著升高 （P＜0.01）。因此，類胰蛋白酶可以作為中藥注射劑類過敏反應(yīng)和I型超敏反應(yīng)檢測體系中重要的評價指標。

另外，類胰蛋白酶指標在中藥注射劑過敏性評價體外試驗中也有重要的作用。郭永超等［47］用蝦過敏原蛋白和氫氧化鋁佐劑致敏BALB/c小鼠，取其抗體血清后與肥大細胞共孵育，2 h后加入蝦過敏原溶液進行激發(fā)，發(fā)現(xiàn)上清液中類胰蛋白酶的檢出量和陽性血清質(zhì)量濃度呈現(xiàn)劑量依賴性升高，和陰性對照組相比有明顯的統(tǒng)計學差異 （P＜0.05）。

5.5其他 張仲林等［48］觀察過敏性鼻炎動物模型腹腔肥大細胞釋放類胰蛋白酶的影響，結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組類胰蛋白酶表達水平明顯升高，且經(jīng)玉屏風散治療后，過敏性鼻炎脫顆粒釋放類胰蛋白酶表達降低。田道法等［49］研究中藥復(fù)方加味補中益氣湯對過敏性鼻炎的干預(yù)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)藥物干預(yù)后，胰蛋白酶表達量明顯降低，提示加味補中益氣湯對于肥大細胞的活化有較強的直接抑制作用。章高平［50］對20例過敏性紫癜腎炎患兒腎活檢石蠟切片組織進行β-類胰蛋白酶的檢測，結(jié)果顯示腎組織中β-類胰蛋白酶陽性細胞率與對照組比較差異有顯著性 （P＜0.05）。Yunginger等［51］檢測8例食物過敏患者的類胰蛋白酶水平，其中6例測定值均高于正常?；颊叩倪^敏器官灌洗液或組織中也出現(xiàn)高質(zhì)量濃度的類胰蛋白酶，如：過敏性眼炎患者的淚液［13］、接觸性皮炎患者的皮膚水泡液［13］及風濕病患者的關(guān)節(jié)囊液［52］。

至今，類胰蛋白酶的發(fā)現(xiàn)已有四十多年，其分子生物學基礎(chǔ)及功能的研究已比較充分。類胰蛋白酶主要存在于肥大細胞和嗜堿性粒細胞中，穩(wěn)定性好，且檢測方法廣泛而簡單易行。雖然組胺作為脫顆?；钚晕镔|(zhì)在診斷鑒別上具有重要的作用，但由于其在血液中半衰期很短，使其作為診斷標志物的適用性受到限制，故類胰蛋白酶在過敏性相關(guān)疾病診斷和評價中的作用顯得尤為重要。類胰蛋白酶的檢測可以作為反映肥大細胞活性的指標，其在血清中的含有量增高與臨床癥狀的嚴重程度有一定相關(guān)，在支氣管哮喘、慢性蕁麻疹、過敏性休克等疾病診斷中起到重要的作用。如何更好地在過敏性疾病中應(yīng)用類胰蛋白酶這一指標，提高診斷的準確性，有必要作進一步的研究。

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2016-01-27

國家 “十二五”科技重大專項 （2011ZX09301-009）

黃玉薩 （1990—），女，碩士生，從事中藥毒理學研究與安全性評價。Te1：（021）51323053，E-mai1：1026164873@qq.com

謝家駿 （1959—），男，研究員，碩士生導師，從事中藥藥理毒理學研究與中藥新藥開發(fā)。Te1：（021）51322395，E-mai1：xiejj001@163.com