孫玉祝，陳江楠，夏兆飛（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193）

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寵物食品中沙門菌的檢測方法概述

孫玉祝，陳江楠，夏兆飛
（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193）

沙門菌是一種人畜共患病病原菌，如果污染寵物食品，將嚴(yán)重威脅到人類和伴侶動物的健康安全。寵物食品營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，有利于沙門菌等有害微生物的生長繁殖。選擇適當(dāng)?shù)臋z測方法，加強(qiáng)對寵物食品監(jiān)督力度，可以一定程度上有效地降低沙門菌污染的風(fēng)險，保障人類和伴侶動物的健康。

適用于檢測寵物食品中沙門菌方法很多，可以概括分為傳統(tǒng)微生物學(xué)、分子生物學(xué)以及免疫學(xué)等方法。但是，為了滿足寵物食品快速檢測的需要，逐漸引入試紙條、試劑盒以及自動化檢測儀等快速檢測方法。文章將主要就上述檢測技術(shù)的原理和應(yīng)用進(jìn)行介紹，比較它們在寵物食品檢測中的實用性以及優(yōu)缺點(diǎn)，希望為寵物食品中沙門菌檢測提供參考。

1　沙門菌污染及危害

沙門菌污染已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)寵物食品安全問題關(guān)注的重點(diǎn)。由美國食品和藥品管理局（FDA）官方網(wǎng)站發(fā)布的信息獲知，美國2014年的10起犬貓食品召回事件中，就有6起是因為懷疑污染或確認(rèn)污染了沙門菌。新西蘭學(xué)者T L Wong等[1]對新西蘭本土生產(chǎn)及分別從澳大利亞、中國和泰國進(jìn)口的寵物咬膠進(jìn)行了檢測，不同產(chǎn)地的產(chǎn)品中都檢測出了沙門菌，檢出率分別為6.7%、14%、4.1%和3.7%。國內(nèi)目前暫時缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)，但卻有在魚粉等飼料原料中檢測出沙門菌的報道[2]。

沙門菌可以通過寵物食品感染伴侶動物和人，嚴(yán)重威脅人類的健康。動物和人感染沙門菌后，通常會表現(xiàn)出嘔吐、腹瀉或血痢以及發(fā)燒等嚴(yán)重癥狀，甚至?xí)霈F(xiàn)反復(fù)感染。2006年至2008年間，美國曾暴發(fā)人類感染沙門菌的事件，后經(jīng)調(diào)查證實是由沙門菌污染了寵物食品而引起[3]。

2　沙門菌的檢測方法

2.1傳統(tǒng)微生物學(xué)方法傳統(tǒng)微生物學(xué)方法是通過給予細(xì)菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)，適宜的溫度和足夠長的培養(yǎng)時間，使細(xì)菌分裂增殖到可檢測數(shù)量，并利用細(xì)菌形態(tài)、菌落、生化以及血清學(xué)等特點(diǎn)進(jìn)行鑒別的方法。寵物食品樣品中可能含有大量腸桿菌科的細(xì)菌而沙門菌含量較少，或樣本中沙門菌受損，直接選擇性增菌容易產(chǎn)生假陰性，所以該方法檢測沙門菌需要預(yù)增菌。該方法是沙門菌檢測的一種標(biāo)準(zhǔn)方法，也適合用于其他檢測方法檢測效果的評價。但是從開始接種到最終鑒定操作復(fù)雜，費(fèi)時費(fèi)力，并不能很好地滿足寵物食品樣本批量快速檢測的需要。

增菌和鑒定兩個過程是該方法的主要限時步驟。對這兩個步驟進(jìn)行改進(jìn)，可以明顯縮短檢測時間，增強(qiáng)傳統(tǒng)方法的實用性。免疫磁珠或疏水網(wǎng)膜進(jìn)行細(xì)菌富集可以有效縮短增菌所耗時間，但是如果樣本中沙門菌數(shù)量非常少，則易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。顯色培養(yǎng)基、噬菌體以及電化學(xué)阻抗法等則是對鑒定步驟進(jìn)行改進(jìn)的方法。例如沙門菌在科瑪嘉沙門菌顯色培養(yǎng)基上會形成典型的紫色菌落。

2.2分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、基因芯片、核酸探針以及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)，其中PCR技術(shù)應(yīng)用最廣。

2.2.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）PCR是一項在體外擴(kuò)增靶基因片段的技術(shù)。選取目的菌基因序列中特異性和保守性較高的靶基因，利用PCR技術(shù)對靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，可以實現(xiàn)對致病菌的檢測。沙門菌的invA基因簇編碼吸附和侵襲腸道上皮細(xì)胞表面侵襲蛋白，具有較高的屬特異性，可以作為檢測沙門菌的靶基因。根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，invA基因編碼的侵襲蛋白是沙門菌的主要毒力因子，以invA基因序列為靶基因設(shè)計引物[4]，并采用PCR技術(shù)檢測寵物食品中的沙門菌，具有非常高的敏感性和特異性。此外，可應(yīng)用于PCR檢測的沙門菌屬特異性基因還有：編碼組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子hut基因、16S rRNA基因、編碼鼠傷寒沙門菌腸毒素stn基因[5]及編碼連四硫酸鹽還原酶ttr基因[6]等。引物的特異性是PCR檢測的特異性和是否成功的關(guān)鍵，引物特異性低常常會導(dǎo)致檢測中的漏檢和誤檢。因此，使用PCR技術(shù)檢測寵物食品中沙門菌前，應(yīng)對設(shè)計或引用的引物進(jìn)行嚴(yán)格的驗證。

傳統(tǒng)PCR技術(shù)操作程序包括目的菌的濃集（增菌）、模板制備、PCR擴(kuò)增以及產(chǎn)物檢測。PCR擴(kuò)增結(jié)果的判讀需要借助凝膠電泳，但是電泳檢測特異性卻并不是很高。此外，傳統(tǒng)PCR還具有步驟繁雜、易污染以及無法準(zhǔn)確定量等問題。正是由于如上一些限制性因素，為了更好地實現(xiàn)PCR檢測技術(shù)的快捷性和特異性，發(fā)展出了很多改進(jìn)的PCR檢測技術(shù)。這些技術(shù)不同程度上對傳統(tǒng)PCR操作程序進(jìn)行了優(yōu)化。這些技術(shù)包括實時熒光定量PCR、Taqman PCR[4]、多重PCR、免疫捕獲PCR以及免疫磁珠分離PCR等。例如，Balachandran，P等[7]利用實時熒光定量PCR技術(shù)實現(xiàn)對寵物食品中沙門菌的檢測，檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法無顯著差異，而且表現(xiàn)出了比標(biāo)準(zhǔn)PCR檢測速度快、可量化以及自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)。

應(yīng)用PCR技術(shù)檢測寵物食品中得沙門菌還需要對樣本進(jìn)行預(yù)處理，排除PCR抑制劑。寵物食品殘渣及與基質(zhì)有關(guān)的抑制劑會干擾PCR檢測靈敏度。國外文獻(xiàn)報道[7]，通過低速離心、濾紙過濾、過濾捕獲（例如，疏水網(wǎng)膜法），以及免疫磁珠捕獲等方式對樣本進(jìn)行預(yù)處理，可以去除樣本中的寵物食品殘渣和基質(zhì)，顯著提高了沙門菌的PCR檢測敏感性。

2.2.2環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）LAMP是采用可以特異性識別目的基因的四條引物，在恒溫條件下通過DNA聚合酶的催化作用對目的基因進(jìn)行快速擴(kuò)增。孫園園等[8]以沙門菌的fim Y蛋白基因序列為目的片段設(shè)計了4條特異性引物，并對各種條件進(jìn)行優(yōu)化，成功建立了針對動物飼料中沙門菌LAMP快速檢測方法。并對24份樣本重復(fù)3次檢測，檢測結(jié)果與飼料國標(biāo)結(jié)果一致。該方法具有特異性強(qiáng)、比PCR檢測敏感性高、檢測速度快和不易受干擾等特點(diǎn)。此外，該方法還可以利用氧化硅為載體，實現(xiàn)對寵物食品中沙門菌等多種有害微生物的多重檢測[9]。

2.3免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法是在抗原抗體特異性反應(yīng)的原理基礎(chǔ)上建立起來的一系列檢測方法，常用于沙門菌檢測的方法包括酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）、免疫層析技術(shù)以及乳膠凝集反應(yīng)，其中ELISA方法及其衍生方法應(yīng)用最廣。

ELISA是將抗原抗體特異性反應(yīng)與酶的高效催化活性的特點(diǎn)相結(jié)合而形成的一種固相酶聯(lián)免疫分析技術(shù)。利用ELISA技術(shù)檢測寵物食品中的沙門菌，主要是利用沙門菌抗原高特異性的單克隆或多克隆抗體。利用單克?。ɑ蚨嗫寺。┛贵w結(jié)合樣品中的沙門菌抗原，再加入酶標(biāo)抗體結(jié)合抗原抗體復(fù)合物，最終加入底物與酶發(fā)生反應(yīng)，就可以將沙門菌抗原顯色，實現(xiàn)對樣本中沙門菌的檢測。

早在20世紀(jì)70年代末，ELISA技術(shù)就被用于食品中沙門菌的檢測，隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，發(fā)展出很多傳統(tǒng)ELISA的衍生技術(shù)，顯著提高了對沙門菌等病原微生物的檢測靈敏度和檢測效率。這些衍生方法包括斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫（Dot-ELISA）技術(shù)、熒光酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、PCR-ELISA檢測技術(shù)以及雙夾心法ELISA等。Dot-ELISA技術(shù)[2]是采用硝酸纖維素（NC）膜代替?zhèn)鹘y(tǒng)的聚苯乙烯反應(yīng)板，具有吸附力強(qiáng)、操作方便、檢測快速等特點(diǎn)，可以同時檢測多種抗原。但是正式應(yīng)用前，需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)試驗確定適宜反應(yīng)條件。熒光酶聯(lián)免疫分析技術(shù)是在傳統(tǒng)ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展而來，采用熒光底物代替?zhèn)鹘y(tǒng)生色底物，可借助儀器進(jìn)行結(jié)果判讀，提高了檢測的靈敏度，避免人工判讀誤差[10]。

2.4快速檢測試紙條和試劑盒常見可用于寵物食品中沙門菌的檢測的試紙有β-萘酚辛酸酯試紙和API試紙。β-萘酚辛酸酯試紙[11]是依據(jù)沙門菌屬可以產(chǎn)生特異性較強(qiáng)的辛酯酶解離辛酸酯類化合物的特性而設(shè)計的。采用該方法檢測沙門菌具有快速、簡單、直觀和經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，但是β-萘酚辛酸酯化合物不夠穩(wěn)定容易分解，保質(zhì)期短，適合現(xiàn)制現(xiàn)用。API 20 E試紙是根據(jù)傳統(tǒng)腸道桿菌生化及發(fā)酵反應(yīng)設(shè)計而來，可用于寵物食品和飼料中沙門菌屬的檢測，具有檢測快速及操作簡便（標(biāo)準(zhǔn)化）等特點(diǎn)，是細(xì)菌鑒定的國際金標(biāo)準(zhǔn)?？焖贆z測試劑盒主要是基于單抗酶聯(lián)免疫技術(shù)、熒光PCR以及實時PCR等原理設(shè)計，可以實現(xiàn)短時間內(nèi)批量產(chǎn)品的檢測，極大地降低人力和時間成本投入。

2.5自動化檢測儀器自動化檢測儀器主要是基于微生物的生化代謝、免疫屬性以及核酸特異性等特點(diǎn)而設(shè)計制造的。自動化檢測儀器的出現(xiàn)減少人力和時間的投入，實現(xiàn)短時間內(nèi)批量樣品的檢測，符合現(xiàn)如今寵物食品批量化生產(chǎn)檢測的需要?，F(xiàn)在常用的自動化檢測儀器主要有全自動微生物分析儀和生物傳感器。自動化微生物分析儀還表現(xiàn)出省時、方便操作、可標(biāo)準(zhǔn)化、可追蹤性以及準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。

2.5.1全自動微生物分析儀全自動分析儀因設(shè)計原理不同可以分為以下幾類：（1）基于微生物生化反應(yīng)原理設(shè)計，例如VITEK微生物鑒定儀和TEMPO全自動微生物定量分析儀。于曉婕等[11]采用TEMPO分析儀對烘干雞肉（寵物食品）微生物污染情況進(jìn)行檢測，并與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，兩者符合度程度在97%以上；（2）基于酶聯(lián)免疫技術(shù)，例如全自動熒光酶聯(lián)免疫檢測系統(tǒng)（VIDAS），黃嫦嬌等[10]采用VIDAS系統(tǒng)對食品中沙門菌進(jìn)行檢測，并與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，體現(xiàn)出檢測快速、特異性以及敏感性高等特點(diǎn)；（3）以微生物特異的基因組為基礎(chǔ)設(shè)計，例如全自動微生物基因指紋分析儀。與傳統(tǒng)方法相比，利用全自動微生物分析儀檢測寵物食品中沙門菌具有很多如上所述的優(yōu)勢，但是不可避免的一個問題就是高昂的儀器成本，這將會成為阻礙自動化儀器在中小型寵物食品制造企業(yè)普及的主要障礙。

2.5.2生物傳感器生物傳感器通常是由生物受體（bioreceptors）和變頻系統(tǒng)（transducing system）兩部分構(gòu)成。生物受體是生物分子識別原件，可以與待檢物質(zhì)（如沙門菌）發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，變頻系統(tǒng)也可以稱作信號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，可以將生物受體與待檢物質(zhì)的反應(yīng)信號轉(zhuǎn)換成可進(jìn)一步處理的電信號或光學(xué)信號。通?？梢苑譃榭贵w或抗原、酶、核酸（DNA）、細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及噬菌體五大類。實際應(yīng)用的生物傳感器中以酶、抗體和核酸三類生物受體為主。例如，Yang Song等[12]建立以切口酶（一種限制性內(nèi)切酶）為輔助的生物傳感器，E Delibato等[6]建立以沙門菌的單克隆抗體和多克隆抗體作為生物受體的免疫傳感器；Xiaoyuan Ma等[13]建立以適體（與靶分子特異性結(jié)合的寡核苷酸序列）為生物受體的電化學(xué)生物傳感器。這幾種傳感器都實現(xiàn)對寵物食品中沙門菌的檢測，表現(xiàn)出較高的敏感性和特異性，并具有檢測快速和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。此外，也有學(xué)者將電化學(xué)阻抗技術(shù)引入生物傳感器中，檢測結(jié)果也表現(xiàn)出了較高的敏感性。

3　結(jié)語與展望

雖然僅僅依靠檢測手段并不會從根本上降低寵物食品中的沙門菌等微生物含量，但卻能輔助生產(chǎn)者實現(xiàn)對寵物食品原料供應(yīng)、生產(chǎn)、存儲以及運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)的科學(xué)管理和監(jiān)控，從根本上降低寵物食品中沙門菌等有害微生物污染的風(fēng)險。傳統(tǒng)微生物學(xué)方法是檢測沙門菌的標(biāo)準(zhǔn)方法，然而檢測耗時就成為該技術(shù)在實際應(yīng)用中的“瓶頸”。鑒于此，分子生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、快速檢測試劑（盒）以及自動化檢測儀器等檢測技術(shù)手段的引入，豐富寵物食品中沙門菌的檢測方法，滿足寵物食品工業(yè)批量準(zhǔn)確快速檢測的需要。隨著技術(shù)的不斷更新，我們相信會有越來越多的先進(jìn)技術(shù)會被用于寵物食品中沙門菌的檢測，寵物食品中沙門菌的檢測技術(shù)也將更精確、簡便和快捷，提升寵物食品安全，為伴侶動物和人類健康提供保障。

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通訊作者：夏兆飛，E-mail：drxia@126.com

作者簡介：孫玉祝（1988-），男，碩士，主要從事小動物營養(yǎng)學(xué)和內(nèi)科學(xué)研究，E-mail：vetsunyuzhu@126.com

收稿日期：2014-12-17

中圖分類號：S852.61+2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0087- 03