王偉丞，梁海英，曾智勇，湯德元，劉　釗，代振江（.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽550025；2.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州貴陽550008）

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豬圓環(huán)病毒2型感染性克隆疫苗的研究前景

王偉丞1，2，梁海英1，曾智勇1，湯德元1，劉釗1，代振江1
（1.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽550025；2.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州貴陽550008）

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原，此外還與豬皮炎與腎病綜合征、仔豬先天性震顫、流產(chǎn)和滲出性皮炎等有關，這些疾病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒病。該病廣泛流行于世界各地，在我國豬群中流行較為嚴重，臨床上常與豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟和豬細小病毒等混合感染，繼發(fā)感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前，疫苗接種是防控PCV-2的有效手段，國內(nèi)外學者對其進行了大量研究，其中滅活疫苗和亞單位疫苗是目前的商品化疫苗，這些疫苗的應用為PCV-2感染的控制發(fā)揮了重要的作用，但免疫效果仍有待進一步提高[1-3]。其中滅活疫苗對機體的刺激時間比較短，需要多次接種，效果欠佳，而且PCV-2在細胞上增殖滴度低，其疫苗制備費用較高；亞單位疫苗由于體積較小，免疫原性不如全病毒的效果，且研究和開發(fā)的費用較為昂貴，在我國的研究相對較為薄弱。因此開發(fā)新型疫苗成為目前的主要研究熱點。

1　新型疫苗研究現(xiàn)狀

由于滅活疫苗和亞單位疫苗的成本高，注射次數(shù)多，易造成機體應激，因此，弱毒疫苗，活載體疫苗和核酸疫苗等新型疫苗成為研究熱點。但是弱毒疫苗是將病原體通過自然篩選或人工致弱等方式減弱制備而成。盡管這類疫苗的毒力已經(jīng)致弱，但仍然保持著原有的免疫原性，并能在動物體內(nèi)繁殖，刺激動物機體免疫系統(tǒng)，從而誘導機體產(chǎn)生免疫力和保護力。但目前還沒有商品化的弱毒疫苗，主要原因可能是與病毒毒力易返強、致弱毒株毒力評價困難等原因相關[4]。將病原微生物的免疫原性基因插入細菌或病毒等活載體中，可產(chǎn)生一種常規(guī)活疫苗和滅活苗主要優(yōu)點的基因工程活載體疫苗，特別是病毒載體還可以誘導常規(guī)滅活疫苗不能誘發(fā)的CD8＋T細胞應答，因而該類基因工程疫苗具有很大的發(fā)展前景。但是活載體疫苗也存在一些不足，如腺病毒載體不能形成外源基因的穩(wěn)定表達；靶向性差；腺病毒顆?？杀桓闻K的Kupffer細胞非特異性吸收，表現(xiàn)出很強的首過效應等。以豬繁殖與呼吸綜合征病毒構(gòu)建的活載體疫苗存在體外是否穩(wěn)定、目的基因經(jīng)傳代是否會丟失等問題仍有待進一步的試驗數(shù)據(jù)加以證實[4]。

核酸疫苗作為一種新型的基因工程疫苗，因免疫效果好，免疫應答持久，制備簡便，穩(wěn)定性強，安全性好，成本低廉，適于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點，現(xiàn)已成為免疫學領域研究的熱點。其原理是將攜帶有免疫原編碼基因的真核表達質(zhì)粒直接導入動物體內(nèi)，通過宿主細胞的表達系統(tǒng)合成免疫原蛋白，進而誘導免疫應答。含PCV-2 ORF2基因的質(zhì)粒載體能夠誘導仔豬產(chǎn)生抗PCV-2感染的保護性免疫應答[5]。Aravindaram等[6]分別構(gòu)建了含PCV-2-ORF1、-ORF2、-ORF3的重組質(zhì)粒，將其單獨或聯(lián)合免疫小鼠2周后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF-2/-3與ORF-1/-2/-3這2種組合免疫誘導產(chǎn)生的IFN-γ、TNF-a、GM-CSF以及PCV-2抗體水平均較其他免疫組高，攻毒后這2種組合免疫組PCV-2病毒載量顯著減少，小鼠的肺部病變也明顯減輕。Fan等[7]通過構(gòu)建4種不同Cap蛋白定位的DNA疫苗載體探討了DNA疫苗免疫及Cap蛋白的定位對誘導免疫應答的影響，結(jié)果表明，4種DNA疫苗免疫均能誘導PCV-2特異性的體液免疫，但分泌型Cap蛋白誘導更高的中和抗體，且降低了IFN-γ水平，而膜定位Cap蛋白則使IFN-γ升高，由于IFN-γ能促進PCV-2的復制，當PCV-2感染時，DNA疫苗免疫誘導的高水平IFN-γ存在潛在的危險，因此，表達分泌型Cap蛋白的DNA疫苗是較好的選擇。盡管核酸疫苗具有諸多優(yōu)點，但外源基因在體內(nèi)的表達調(diào)控及其在體細胞中的轉(zhuǎn)移可能會產(chǎn)生意外的免疫病理反應等問題，使得目前絕大部分核酸疫苗的研究還僅局限于實驗室。

2　感染性克隆疫苗研究現(xiàn)狀

感染性克隆疫苗是一種新型的核酸疫苗，是將毒力損失或毒力致弱的病毒制成核酸疫苗后免疫動物，獲得與自然毒相同的免疫效果[8]。與以往的核酸疫苗相比，感染性克隆疫苗即具有核酸疫苗的優(yōu)點，又克服了核酸疫苗表達量低的缺點。因感染性克隆疫苗是作為一種毒力減弱的活毒進入機體內(nèi)的，具有正常的生理周期，卻又沒有致病性或致病力很弱，所以在體內(nèi)的表達量要遠遠高于以往的核酸疫苗。隨著豬圓環(huán)病毒2型感染性克隆的成功構(gòu)建，對PCV-2基因組的背景有了清楚的認識，對各基因的功能也更加清楚。在此基礎上，不再局限于僅僅利用免疫原性基因構(gòu)建核酸疫苗，而是通過構(gòu)建PCV-2的感染性克隆，在此基礎上利用基因缺失、突變、嵌合等反向遺傳操作技術將這種感染性病毒致弱，使其對宿主細胞蛋白表達系統(tǒng)的抑制作用接觸，但保留了野毒的免疫原性及其正常的增殖能力。

Fenaux等[9]于2002年開始PCV-2感染性克隆的研究，其將兩個拷貝的PCV-2基因組以首尾相連的方式克隆入pBluescript SK質(zhì)粒，構(gòu)建PCV-2的感染性克隆。該DNA克隆在PK-15細胞內(nèi)能產(chǎn)生具有感染性的PCV-2病毒粒子。進一步將其重組質(zhì)粒直接注射SPF豬體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其與接種PCV-2野毒組的SPF豬具有同類型的臨床癥狀和病理變化，為PCV-2感染性克隆疫苗的研究和應用奠定了基礎。Fenaux等[10]于2004年進一步構(gòu)建了具有PCV-2免疫原性減毒的PCV1-2嵌合病毒，即以PCV-1為骨架，以PCV-2的Cap基因（ORF2）取代PCV-1的ORF2；同時，也構(gòu)建了PCV2-1的嵌合基因組作為對照，即以PCV-1 ORF2取代PCV-2基因組中的ORF2；將這兩種DNA克隆轉(zhuǎn)染PK15細胞均具有感染性，且PCV1-2病毒能夠誘導PCV-2核衣殼蛋白的特異性抗體反應，但其毒力明顯降低，因此PCV1-2感染性克隆質(zhì)?？梢宰鳛橛行Х乐筆CV-2感染和PMWS流行的疫苗。同時Fenaux等[11]還在PCV-2的體外傳代過程中發(fā)現(xiàn)其核衣殼蛋白中存在有與病毒體外復制和體內(nèi)毒性作用有關的兩個氨基酸突變，這兩個氨基酸的突變提高了PCV-2的體外增殖能力但卻降低了其在體內(nèi)的毒性作用，也為PCV-2疫苗的研制提供了思路。金玉蘭等[12]構(gòu)建了ORF2內(nèi)的單核苷酸缺失突變體感染性克隆，發(fā)現(xiàn)1376位點核苷酸的缺失提高了PCV-2的致病性和免疫抑制能力。Karuppannan等[13]構(gòu)建了ORF3突變的重組PCV-2，接種斷奶仔豬后不引起明顯的臨床癥狀，與野毒相比，病毒血癥、淋巴結(jié)病理變化以及抗原載量明顯減輕，且誘導了較強的體液免疫和細胞免疫應答，表明ORF3突變能顯著降低PCV-2的毒力，且突變病毒能誘導更強的免疫應答，是PCV-2疫苗研究的一個新方向。He等[14]通過構(gòu)建缺失ORF4的感染性克隆并體外拯救出缺失ORF4基因的PCV-2病毒，將其感染小鼠后，發(fā)現(xiàn)其與野生型病毒相比較，缺失ORF4 的PCV-2病毒比野生型PCV-2具有更強的致病性，揭示ORF4基因是PCV-2致病的負調(diào)控基因。Henmann等[15]為了驗證嵌合PCV1-2弱毒疫苗和滅活疫苗對母豬的免疫效果，通過動物試驗，發(fā)現(xiàn)弱毒疫苗和滅活疫苗均能夠很好的保護母豬防止PCV-2的感染。

國內(nèi)韓凌霞等[16]將PCV-2單拷貝基因組插入到pMD18-T中，將獲得的pMD-PCV-2感染性克隆質(zhì)粒免疫40日齡仔豬，發(fā)現(xiàn)其能夠在體內(nèi)產(chǎn)生與PCV-2自然感染的大體病變和病理組織學變化，并能夠激發(fā)機體較強的體液免疫應答。楊順利等[17]以pcDNA3.1（＋）真核表達質(zhì)粒為載體也構(gòu)建了PCV-2的單拷貝和雙拷貝感染性克隆，并將其免疫小鼠后，對免疫后不同天數(shù)小鼠的血清用ELISA檢測，結(jié)果免疫后35 d病毒幾乎都能檢測到衣殼蛋白特異性抗體，小鼠致死后在其體內(nèi)也能檢測到病毒DNA，表明無論是PCV-2單拷貝還是雙拷貝感染性克隆質(zhì)粒均具有感染性。同時我們也采用pcDNA3.1（＋）真核表達載體為骨架也構(gòu)建了PCV-2的感染性克隆，并人為引入了一個分子標記，將其免疫小鼠后，免疫6周后致死在其體內(nèi)仍能檢測到引入的分子標記，與國內(nèi)劉長明[18]和Huang[19]等研究結(jié)果相一致，表明分子靶標能夠穩(wěn)定遺傳，為構(gòu)建攜帶遺傳標記的PCV-2感染性克隆疫苗奠定前期基礎。

3　展望

隨著PCV-2全病毒滅活疫苗、PCV1-2嵌合病毒疫苗以及PCV-2亞單位疫苗注冊上市，這些疫苗在一定程度上可以有效防控PCV-2感染，能顯著降低PCV-2感染豬群的臨床癥狀，提高豬的生長性能，然而這些疫苗免疫并不能完全阻斷PCV-2傳播，亦不能完全清除體內(nèi)已感染的病毒，此外這些疫苗誘導的免疫應答主要為體液免疫，忽視了細胞免疫在PCV-2保護免疫中的作用[6]。因此，尋找成本低、能充分誘導體液免疫和細胞免疫的弱毒疫苗和活載體疫苗成為研究熱點，核酸疫苗也被廣泛的關注。

PCV-2感染性克隆疫苗作為一種新型基因工程疫苗，雖然已有了許多研究，但要想在此領域有重大突破，還有大量的工作要做。同時雖然感染性克隆疫苗具有許多優(yōu)點，但也要注意到，PCV-2感染性克隆疫苗在其體內(nèi)拯救的病毒有可能發(fā)生毒力返強，即原來缺失的基因，在病毒的連續(xù)增殖后，有可能重新獲得；采用定點突變技術得到的弱毒疫苗也不排除具有回復突變的可能性；感染性克隆疫苗毒株在自然選擇壓力下有可能與流行毒株發(fā)生基因組交換或重組。這些問題如果能夠得以解決，PCV-2感染性克隆疫苗的問世也就為期不遠，豬圓環(huán)病毒病也將得以更好的控制。此外，感染性克隆疫苗已在黃熱病毒和馬腦炎病毒有類似的研究報道[20-21]，且均取得了較好的免疫效果，因此，有理由相信感染性克隆疫苗在PCV-2的免疫預防方面，也將具有廣闊的應用和開發(fā)前景。

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通訊作者：曾智勇，E-mail：as.zyzeng@gzu.edu.cn

作者簡介：王偉丞（1990-），男，碩士，研究方向為動物傳染病病原分子生物學，E-mail：weichengwangvet@126.com

基金項目：貴州省農(nóng)業(yè)科學攻關項目[黔科合LH字（2014）7670]；國家自然科學基金項目（31560688）

收稿日期：2014-10-28

中圖分類號：S852.65+1

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0084- 03