畢　磊，張煜涵，劉　暢，黃大鵬，路義鑫

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

牛貝諾孢子蟲(chóng)病研究進(jìn)展

畢磊，張煜涵，劉暢，黃大鵬，路義鑫

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

牛貝諾孢子蟲(chóng)病又稱(chēng)牛球孢子蟲(chóng)病，是由貝氏貝諾孢子蟲(chóng)（Besnoitia besnoiti）引起的一種急性、亞急性和慢性感染的牛原蟲(chóng)性寄生蟲(chóng)病。

貝諾孢子蟲(chóng)最早是由Cadeac（1884）在法國(guó)南部牛群中發(fā)現(xiàn)的，近些年，歐洲的法國(guó)和西班牙地區(qū)都有大規(guī)模的牛貝諾孢子蟲(chóng)病暴發(fā)。德國(guó)、意大利和東歐中部地區(qū)均報(bào)道了此病的流行［1］，給世界各地的養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。歐洲食品安全組織（EFSA）已經(jīng)認(rèn)定貝諾孢子蟲(chóng)病為重現(xiàn)疾病，并且在歐洲地方性流行［2］。國(guó)內(nèi)最早是由劉爾翔于1957年在北京某屠宰場(chǎng)發(fā)病黃牛病變皮膚中發(fā)現(xiàn)并鑒定為貝諾孢子蟲(chóng)。

近年來(lái)，隨著牛貝諾孢子蟲(chóng)病的廣泛流行，國(guó)內(nèi)外對(duì)于本病進(jìn)行了更深入的研究，其進(jìn)展綜述如下。

1　病原體

1.1種屬及其生物特性貝諾孢子蟲(chóng)屬頂復(fù)門(mén)、孢子蟲(chóng)綱、真球蟲(chóng)目、肉孢子蟲(chóng)科、住肉孢子蟲(chóng)亞科、貝諾孢子蟲(chóng)屬。目前的數(shù)據(jù)顯示，貝諾孢子蟲(chóng)屬的貝諾孢子蟲(chóng)還未發(fā)現(xiàn)對(duì)人有感染性?，F(xiàn)今至少有10種貝諾孢子蟲(chóng)在世界范圍內(nèi)被確定，大多數(shù)報(bào)道來(lái)自有袋動(dòng)物和微型哺乳動(dòng)物，包囊分布于體內(nèi)，位置多在腸系膜，并且貓已被確認(rèn)為多個(gè)種的終末宿主。相反，對(duì)皮膚高度趨化的有寄生于馬屬動(dòng)物的B.bennetti，寄生于鹿科的B.tarandii和寄生于牛的B.besnoiti。B.oryctofelisi、B.neotomofelis和B.darling已在美洲大陸的嚙齒動(dòng)物和兔類(lèi)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)確認(rèn)，并表現(xiàn)明顯特征，已經(jīng)確定它們的終末宿主為貓［3］。B. tarandii和B.bennetti僅出現(xiàn)在歐洲和美洲各地，B. besnoiti流行于南非、以色列，以及歐洲和亞洲不同國(guó)家，寄生于山羊的B.caprae發(fā)生于伊朗和肯尼亞。到目前為止，這4個(gè)種各自的傳播方式和終末宿主還未確定，因此無(wú)法確認(rèn)它們的有性生殖是否發(fā)生，如何發(fā)生。有人懷疑貝諾孢子蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)相似，在中間宿主體內(nèi)僅有無(wú)性生殖，于終末宿主內(nèi)出現(xiàn)有性生殖，但難以確認(rèn)。研究者試圖用貝氏貝諾孢子蟲(chóng)包囊感染貓，僅有一個(gè)報(bào)道用疑似感染貝氏貝諾孢子蟲(chóng)的牛組織喂給貓后成功感染貓。但是有人在1976年、1989年分別進(jìn)行過(guò)同樣的實(shí)驗(yàn)均未能得到滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。并且有人用組織包囊喂給貓同樣未能成功感染?，F(xiàn)已確認(rèn)的貝諾孢子蟲(chóng)還有寄生于嚙齒動(dòng)物的B.jellisoni、寄生于倉(cāng)鼠的B.wallacei和在巴西發(fā)現(xiàn)的寄生于鼠的B.akodoni。

現(xiàn)今對(duì)貝諾孢子蟲(chóng)屬所有的系統(tǒng)分析都基于對(duì)ITS1基因序列的利用。雖然未能破解全序列信息，但已經(jīng)可以利用ITS1證明貝諾孢子蟲(chóng)的種屬特異性。對(duì)ITS1的研究結(jié)果已經(jīng)被用于種的區(qū)分。并且ITS1轉(zhuǎn)錄區(qū)間在很多種類(lèi)表現(xiàn)出高度保守性，各種間的ITS1轉(zhuǎn)錄區(qū)可能與各自的地域起源關(guān)系不大，而是與各自中間宿主的性質(zhì)相關(guān)。

據(jù)Nobel報(bào)道，貝氏貝諾孢子蟲(chóng)對(duì)牛的生殖器官有一定的趨向性，這可能是引起公牛不育、母牛不孕的原因。有人嘗試接種兔，發(fā)現(xiàn)貝諾孢子蟲(chóng)對(duì)兔有高度致死性，但經(jīng)多次傳代后可減弱毒性。Pols曾使得貝諾孢子蟲(chóng)在兔體內(nèi)成功傳了19代。證明在兔體內(nèi)傳代是可以實(shí)現(xiàn)的，兔可以作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。還有學(xué)者將貝諾孢子蟲(chóng)感染金黃地鼠、海豬、小白鼠和美利奴綿羊，同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)觀察，最終在其體內(nèi)發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體，并表現(xiàn)出比感染牛、羊等大型動(dòng)物嚴(yán)重的急性癥狀，這可能與接種動(dòng)物個(gè)體較小，蟲(chóng)體密度大及小型動(dòng)物耐受性低等因素有關(guān)。

1.2寄生部位及形態(tài)特征牛體內(nèi)寄生的為貝氏貝諾孢子蟲(chóng)，寄生于中間宿主體內(nèi)的形式為包囊和速殖子，這點(diǎn)與弓形蟲(chóng)相同。其包囊可寄生于病畜的皮膚及皮下疏松結(jié)締組織、鞏膜、筋膜、鼻腔黏膜、舌、咽、陰道及內(nèi)臟等許多部位。發(fā)熱期速殖子出現(xiàn)在血液中，并且可在肺、睪丸、淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)。

包囊為球形，色灰白，呈細(xì)砂粒樣，一般呈散在分布，肉眼則能識(shí)別。包囊直徑約為200～600 μm不等，其大小隨寄生部位的不同差異很大。包囊囊壁由宿主組織所形成，具有很厚的富有彈性的透明化均質(zhì)膠原纖維層外膜，目前認(rèn)為外膜完全由宿主細(xì)胞的生理反應(yīng)形成的［4］；內(nèi)層膜較薄。由于這種雙層的囊壁，使貝諾孢子蟲(chóng)明顯區(qū)別于頂復(fù)門(mén)其他寄生蟲(chóng)。且包囊內(nèi)含有胞漿，胞漿內(nèi)含有大量緩殖子，通常一端稍尖，一端鈍圓，其大小為2～5×6～12 μm，呈香蕉形，新月形或梨形。在急性病牛的血涂片中有時(shí)可見(jiàn)速殖子，其形態(tài)與緩殖子相似，大小為6～7.5×2.5～3.9 μm。在光學(xué)顯微鏡下，貝諾孢子蟲(chóng)的速殖子與新孢子蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)的速殖子無(wú)法區(qū)分。有研究者用貝諾孢子蟲(chóng)速殖子感染Vero細(xì)胞［5］，最終確定其復(fù)制的方式為孢內(nèi)生殖，且復(fù)制的速率取決于細(xì)胞系，目前報(bào)道的最好的復(fù)制速率來(lái)源于BHK21細(xì)胞（幼年敘利亞地鼠腎細(xì)胞）的每小時(shí)感染6～20個(gè)速殖子。

2　生活史及傳播方式

目前僅有個(gè)別蟲(chóng)種貝諾孢子蟲(chóng)的生活史較為清楚，但對(duì)如貝氏貝諾孢子蟲(chóng)等流行性較高的蟲(chóng)種，其生活史尚不清楚，有人認(rèn)為其生活史與弓形蟲(chóng)相似，帶有蟲(chóng)體的組織被貓食入后，于腸上皮細(xì)胞固有層內(nèi)進(jìn)行裂殖生殖和配子生殖，產(chǎn)生類(lèi)似等胞球蟲(chóng)的卵囊，隨后排出體外，被宿主吞食。進(jìn)入宿主體內(nèi)破裂釋放速殖子，速殖子侵入血液，引起相應(yīng)癥狀并隨血液到達(dá)身體各處，最終于組織內(nèi)形成包囊并轉(zhuǎn)變?yōu)榫徶匙印?/p>

模仿接種弓形蟲(chóng)的方法，從貓?bào)w內(nèi)分離的包囊通過(guò)口腔感染牛，到目前為止還未獲得成功的報(bào)道。然而現(xiàn)已證明貝諾孢子蟲(chóng)可通過(guò)吸血昆蟲(chóng)進(jìn)行機(jī)械傳播。因此繞過(guò)了有性生殖和無(wú)性生殖，同時(shí)也解釋了為何呈季節(jié)性流行。通過(guò)機(jī)械傳播的方式使貝諾孢子蟲(chóng)可以隨意感染各地的牛，使其流行于世界各地，這也解釋了為何貝諾孢子蟲(chóng)的生活史至今未被確定。有研究者從牛的淚液中發(fā)現(xiàn)速殖子，這表明貝諾孢子蟲(chóng)可以通過(guò)不吸血的蠅類(lèi)或一些吸食眼淚的昆蟲(chóng)傳播［6］。

3　臨床癥狀

貝氏貝諾孢子蟲(chóng)的感染臨床表現(xiàn)為急性期和慢性期，急性期發(fā)生于感染后的11～13 d，持續(xù)6～10 d。慢性期則持續(xù)整個(gè)急性期的恢復(fù)階段，并可以延續(xù)一生。

急性期發(fā)生速殖子的快速擴(kuò)散，速殖子的擴(kuò)散發(fā)生于血管內(nèi)的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和纖維母細(xì)胞，導(dǎo)致血管的相應(yīng)病癥，如血管阻塞及炎癥，常發(fā)生于毛細(xì)血管和小靜脈、皮下組織、筋膜、睪丸和上呼吸道黏膜。急性期臨床表現(xiàn)為高熱、呼吸障礙、心率加快、食欲不振、產(chǎn)奶量下降，常伴隨淺表淋巴結(jié)慢性細(xì)胞性淋巴結(jié)炎、皮膚水腫、公牛急性睪丸炎等，并且由于呼吸困難易導(dǎo)致上呼吸道黏膜炎。急性期不一定會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡，但這個(gè)過(guò)程會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物身體狀況嚴(yán)重下降。

急性期持續(xù)1～2周后，水腫減弱，進(jìn)入慢性期。慢性期包囊略有增大，同時(shí)緩殖子數(shù)量增多，有的緩殖子可以在包囊內(nèi)存活數(shù)年，并隨包囊一起寄生于皮膚、皮下組織、肌間筋膜。慢性期會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物間歇發(fā)熱，厭食，同時(shí)伴有皮膚病變，如不同程度的脫毛，皮膚顯著增厚、硬化、龜裂、出現(xiàn)褶皺，流出漿液性血樣液體，嚴(yán)重者呈象皮樣變性。皮膚病變主要發(fā)生于病畜的頸部、肩部。病變皮膚和脫毛將永久性伴隨患畜，表現(xiàn)為不可逆性。皮膚病變偶發(fā)于四肢，導(dǎo)致行動(dòng)困難和疼痛。公牛陰囊腫大，睪丸實(shí)質(zhì)和輸精管被大量包囊阻塞，導(dǎo)致不育。也會(huì)導(dǎo)致懷孕母牛流產(chǎn)，嚴(yán)重感染的母牛可能永久性不孕。除表現(xiàn)顯著特征的皮膚病變外，一些小的包囊肉眼可見(jiàn)于鞏膜和雌性外陰道，這一特征在臨床診斷方面有重要意義。

現(xiàn)如今，雖然牛貝諾孢子蟲(chóng)的很多特性已被破解，但是在臨床方面用于確診的臨床特征難以確定，經(jīng)常會(huì)被誤診為牛瘟、疥瘡、真菌感染等。并且很多病畜呈不同程度的隱性感染，鞏膜等處無(wú)明顯包囊，給確診該病帶來(lái)困難。

4　診斷方法

患病動(dòng)物皮膚，眼鞏膜或陰道出現(xiàn)包囊時(shí)，結(jié)合脫毛、皮膚增厚、結(jié)痂等癥狀可作出初步診斷，但易造成誤診，仍需實(shí)驗(yàn)室診斷才能最終確診。

對(duì)于表現(xiàn)出明顯病理變化的患病動(dòng)物可采取組織病理學(xué)方法，在病變皮膚處通過(guò)穿刺的方式取樣或直接采集鞏膜的結(jié)節(jié)做壓片或切片，通過(guò)TEM觀察到包囊及緩殖子均可確診。對(duì)于一些體表病變較輕的患病動(dòng)物，應(yīng)采用PCR方法檢測(cè)貝諾孢子蟲(chóng)DNA。盡管存在檢測(cè)隱性感染可能呈陰性的局限性，PCR在未發(fā)現(xiàn)貝諾孢子蟲(chóng)抗體的情況下仍作為檢測(cè)病牛血液中速殖子的合適方法［7］。

由于多數(shù)患病動(dòng)物呈隱性感染，為更準(zhǔn)確地對(duì)貝諾孢子蟲(chóng)進(jìn)行診斷，血清學(xué)診斷方法取得了很大成果。檢測(cè)患病動(dòng)物血清中是否存在抗體是很好的檢測(cè)方法。王祥生曾用病牛病變皮膚分離的蟲(chóng)體包囊內(nèi)的緩殖子制備抗原，并成功接種于牛，血凝抗體于接種后10 d出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，比臨床癥狀早出現(xiàn)40～50 d，肯定了抗原在貝諾孢子蟲(chóng)診斷中的可靠性。

IHA和CFT是診斷貝諾孢子蟲(chóng)有效的血清學(xué)方法，具有陽(yáng)性符合率較高的特點(diǎn)，并且方法簡(jiǎn)便易行，可現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。尤其IHA，更適用于患畜的早期診斷。國(guó)內(nèi)研究者王祥生、胡力生等多次采用IHA檢測(cè)貝諾孢子蟲(chóng)，均起到很好的檢測(cè)效果。IFAT被認(rèn)為是血清學(xué)檢測(cè)的黃金標(biāo)準(zhǔn)，在對(duì)隱性感染的檢測(cè)時(shí)能取得良好效果，但應(yīng)注意避免交叉反應(yīng)。Western Blot也可以用于其檢測(cè)，目前應(yīng)用Western Blot進(jìn)行檢測(cè)時(shí)常與牛新孢子蟲(chóng)等原蟲(chóng)病發(fā)生交叉反應(yīng)，但Western Blot已被確立為其他方法的驗(yàn)證試驗(yàn)方法［8］。姜言輔曾應(yīng)用ELISA進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率明顯高于鞏膜檢查結(jié)果。據(jù)報(bào)道，現(xiàn)已有用于檢測(cè)貝諾孢子蟲(chóng)的ELISA試劑盒。也有研究稱(chēng)，血清學(xué)檢測(cè)對(duì)于隱性感染的靈敏性不高，這可能與檢測(cè)季節(jié)昆蟲(chóng)的活躍度有關(guān)，昆蟲(chóng)較少或無(wú)昆蟲(chóng)的季節(jié)，各種檢測(cè)方法的結(jié)果均偏低。

5　治療與預(yù)防

貝諾孢子蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)同屬球蟲(chóng)目?jī)?nèi)雙芽球蟲(chóng)亞目，形態(tài)結(jié)構(gòu)比較相似。然而，在治療方面，對(duì)弓形蟲(chóng)病有效的藥物還沒(méi)有一種能對(duì)貝諾孢子蟲(chóng)起作用。最早有人采用靜脈注射30 mL濃度為1%福爾馬林進(jìn)行治療，但由于伴隨明顯的不良反應(yīng)而被棄用。Pols早在1960年就曾在接種貝諾孢子蟲(chóng)的兔身上嘗試過(guò)噴他脒、金霉素、福爾馬林、等藥物，均未能成功達(dá)到良好的抑制或治療效果。柳春華等曾驗(yàn)證丙硫咪唑和氯苯胍口服對(duì)急性病牛治愈率很高；吡喹酮和甲醛液對(duì)慢性病牛有一定的治療作用，但不能根治。劉學(xué)敏等也曾進(jìn)行過(guò)藥物治療試驗(yàn)，同樣證明吡喹酮能殺死患牛體內(nèi)大部分蟲(chóng)體，但以四肢為代表的遠(yuǎn)端筋膜、跟腱處仍有蟲(chóng)體殘留。韓國(guó)應(yīng)用1%銻制劑對(duì)人工接種牛源貝諾孢子蟲(chóng)的山羊進(jìn)行治療，結(jié)果取得滿意效果。也有學(xué)者表示，氫化可的松和那嘎寧均可對(duì)貝諾孢子蟲(chóng)病起到一定治療或緩解作用，由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較少，其準(zhǔn)確性有待確定。

近年來(lái)，有研究者先后利用Vero細(xì)胞應(yīng)用一些藥物及其衍生物，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)貝諾孢子蟲(chóng)速殖子增殖的抑制作用，有的藥物甚至能引起嚴(yán)重的超微結(jié)構(gòu)改變，并獲得相比于有毒的硝基化合物更安全的效果，但是相應(yīng)的研究尚未在動(dòng)物身上進(jìn)行。

Niagi［9］通過(guò)速殖子免疫的小鼠制備單克隆抗體，能夠在貝諾孢子蟲(chóng)速殖子侵入單層細(xì)胞時(shí)表現(xiàn)明顯的抑制作用，而后續(xù)研究尚未報(bào)道。最新的研究表示能夠在貝諾孢子蟲(chóng)速殖子、緩殖子分別表達(dá)的抗原已被確定，這對(duì)后續(xù)的研究具有重大作用。目前可用于貝諾孢子蟲(chóng)分子水平的研究成果不多，并且缺少好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，所以貝諾孢子蟲(chóng)基因組及轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序是在分子水平上進(jìn)行系統(tǒng)分析研究的必然基礎(chǔ)。

目前，本病的治療尚處于探索階段，因此，預(yù)防工作倍顯重要。在一些貝諾孢子蟲(chóng)呈地方性流行的農(nóng)場(chǎng)，病死的牛經(jīng)焚燒、深埋等方式小心處理，從而消除傳染源?？扇陮?duì)牛群進(jìn)行臨床檢查，以便及早發(fā)現(xiàn)處理病畜。同時(shí)，由于吸血昆蟲(chóng)和貓與本病傳播有關(guān)，應(yīng)采用合理的方法進(jìn)行控制，可采用1%氯仿控制吸血昆蟲(chóng)。

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S852.72+3

A

0529-6005（2016）09-0066-03

2015-07-14

畢磊（1991-）、，男，碩士，從事貝諾孢子蟲(chóng)流行病學(xué)研究，E-mail：821165034@qq.com

路義鑫，E-mail：Luyixin@neau.edu.cn