廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院放射科(廣西 南寧 530021)

劉樹英 古冬連 賴少侶 黃 秒 康 巍 金觀橋 蘇丹柯

靶向ELAM-1的磁共振分子探針的構(gòu)建與表征＊

廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院放射科(廣西 南寧 530021)

劉樹英 古冬連 賴少侶 黃 秒 康 巍 金觀橋 蘇丹柯

目的探討用超順磁性氧化鐵(USPIO)螯合唾液酸化酶X(sLeX)形成靶向內(nèi)皮細胞粘附分子-1(ELAM-1)的特異性磁共振成像的分子探針的制備方法，并研究其物理化學特性。方法利用物理沉積方法合成USPIO納米顆粒，通過疏水作用，合成較好水溶性的PEG-USPIO，其表面?COOH充分活化，常溫下與sLeX充分孵育，超濾離心和去離子水洗滌，形成磁共振分子探針USPIO-PEG-sLeX，測定其表征。結(jié)果透射電鏡測定PEG-SPIO平均粒徑為(10±2.6)nm，分散性較好，大小適宜；動態(tài)光散射測定偶聯(lián)前后其平均水動力尺寸分別為(34.06±9.95) nm，(53.35±16.99)nm；偶聯(lián)前后的PEG化磁性納米顆粒的Zeta電位分別為(11.6±3.96)mV，(-12.6±5.33)mV。結(jié)論化學交聯(lián)法可成功制備磁共振分子探針USPIO-PEG-sLeX，該分子探針具有良好表征，有望滿足體內(nèi)、外實驗特異性結(jié)合ELAM-1的要求。

磁共振分子成像；超順磁性氧化鐵；內(nèi)皮細胞粘附分子-1

近年來，隨著納米顆粒制備技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是新一代超順磁性氧化鐵納米顆粒和超小型的氧化鐵顆粒(USPIO)出現(xiàn)，大大地促進磁共振分子影像學的發(fā)展[1-2]。然而，單一的USPIO缺乏靶向性，其成像技術(shù)并不能夠為一些復雜的病情作出明確的診斷，這使得制備出靶向造影劑成為必要[3-4]。內(nèi)皮細胞粘附分子-1(ELAM-1)，也稱E選擇素(E-selectin)，是選擇素家族中的一員[5-6]。當內(nèi)皮細胞受到IL-1，TNF-α,LPS等刺激活化后即在細胞表面表達ELAM-1。ELAM-1的配體為細胞膜上的糖蛋白或糖脂，含有唾液酸化酶X(sLeX)。ELAM-1和其配體sLeX在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移發(fā)揮了重要作用，其異常表達對判斷腫瘤預后以及個體化綜合治療方案的制定具有重要參考價值，可見特異性結(jié)合ELAM-1的靶向磁共振造影劑具有良好的臨床應用前景。本文將油酸包裹的PEG-USPIO納米顆粒偶聯(lián)sLeX合成分子探針USPIO-PEG-sLeX，旨在制備出能夠在體內(nèi)外實驗中能夠與ELAM-1特異性地結(jié)合，并檢測其表達部位及數(shù)量的磁共振分子探針。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器乙酰丙酮鐵、油酸、油胺、EDC固體粉末、NHS固體粉末、二芐基醚、MES粉末、硼砂溶液和硼酸溶液購自上海阿拉丁試劑有限公司，乙醇、正己烷和氯仿購自國藥集團化學試劑有限公司，DSPE-PEG2000固體粉末上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，sLeX購自英國Carbosynth公司。超聲儀(VCX750)，離心機(Centrifuge5430R)，透射電子顯微鏡(日本JEM-200CX)，粒徑分析儀(美國Brookhaven-Zetaplus)。

1.2 USPIO-PEG-sLeX的制備

1.2.1 油酸包裹的PEG-USPIO納米顆粒的制備：先取2mmol乙酰丙酮鐵、10mmol 1,2-十六醇、20ml二芐基醚、6mmol油酸和6mmol油胺進行加熱反應，停止加熱并冷卻到室溫后，向反應液中加入40ml乙醇，將混合物離心處理(6000r/min)，得到黑色的沉淀物。重復乙醇沉淀/非極性溶劑分散的過程2～3次，得到平均尺寸為6nm四氧化三鐵納米顆粒。將上述方法合成的84mg四氧化三鐵納米晶體分散在 4ml正己烷溶液中，再加入2mmol乙酰丙酮鐵、10mmol 1,2-十六醇、20ml二芐基醚、6mmol油酸和6mmol油胺重復進行如上反應，最終得到平均粒徑為10nm的四氧化三鐵納米顆粒。稱取50mg DSPE-PEG2000固體粉末溶解于5ml三氯甲烷中，移取5ml的上述油酸包覆的四氧化三鐵納米晶體(濃度為1mg Fe/ml，分散在氯仿中)，將兩者混合裝于50ml的圓底燒瓶，在70℃(與脂質(zhì)體的相變溫度相當)下用超聲儀充分超聲10分鐘后加入5ml去離子水。兩者混合后將圓底燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，水浴70℃，抽至真空后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。通過疏水作用，在顆粒表面修飾的油酸烷基鏈上包覆了單層具有較好水溶性的DSPE-PEG2000磷脂分子。樣品經(jīng)220nm濾膜過濾后再超濾離心，去除底部沉淀物，取上層黑色透明的水相納米結(jié)構(gòu)的溶液。

1.2.2 PEG-USPIO偶聯(lián)sLeX分子的制備：首先，需配制反應體系中需要的緩沖溶液。稱取213mg的MES粉末，溶解后用去離子水定容到50mL容量瓶中，調(diào)pH 至5.5，備用。分別移取3ml硼砂溶液(0.05mol/L)和7ml硼酸溶液(0.2mol/L)，兩者混合后用去離子水定容到100ml，調(diào)pH 至8.3，備用。接著，移取5ml已制備的Fe3O4-PEG樣品(其中DSPE-PEG2000-COOH的原始投料量約為50mg)分散于20ml濃度為0.02mol/L的MES緩沖溶液中，依次向其中加入180mg EDC固體粉末和200mgNHS固體粉末，充分溶解后于搖床上振蕩25分鐘(150r/ min)，以確保磁性納米晶表面的-COOH充分活化?；罨Y(jié)束后，超濾離心，用去離子水洗滌3次，以去除多余的EDC和NHS。將上述樣品分散于20ml 0.02mol/L 的BB緩沖溶液中，加入2mg sLeX分子(先分散于0.02mol/L的BB緩沖液中)，于搖床上常溫孵育2小時(150r/min)。最后超濾離心，用去離子水洗滌3次，得到黑色透明狀的sLeX偶聯(lián)的磁性納米晶(UPSIO-PEG-sLeX)的溶液，經(jīng)220nm濾膜過濾后保存于4℃冰箱。

1.3 USPIO-PEG-sLeX表征的測定

1.3.1 透射電子顯微鏡(TEM)：分析USPIO-PEG-sLeX的形態(tài)和粒徑：再經(jīng)過進一步的處理后將用超純水(PH6.0)稀釋為1mg/ ml 的USPIO-PEG-sLeX溶液，用一次性吸液管分別取一小滴于的蠟板中，先用2%磷鎢酸(PTA)對乳酸作負染處理，用移液槍吸取樣品滴在銅網(wǎng)上，蓋好培養(yǎng)皿，待銅網(wǎng)自然干燥后，用放入80kv透射電子顯微鏡下，觀察USPIO-PEG-sLeX微粒的形態(tài)和粒徑，隨機選取50個納米微粒，測量其平均粒徑，重復三次，取其平均值。

1.3.2 動態(tài)光散射(DLS)分析偶聯(lián)前后USPIO-PEG-sLeX的平均水動力尺寸：在室溫下，偶聯(lián)前后的USPIO-PEG-sLeX乳液用超純水稀釋后放入2ml Eppendorf管中，放置于超聲波清洗器中，均勻振蕩反應5min；開啟粒徑分析儀，待機器預熱30min后，用移液槍吸取1.5ml的偶聯(lián)前后的USPIO-PEG-sLeX溶液于透明的塑料杯中，放入Zeta粒徑分析儀，采用動態(tài)光散射分別測量偶聯(lián)前的PEG化磁性納米顆粒及偶聯(lián)后的sLeX偶聯(lián)磁性納米顆粒復合物的水動力尺寸，重復三次，取其平均值。

1.3.3 粒徑分析儀檢測偶聯(lián)前后USPIO-PEG-sLeX的Zeta電位：在室溫下，將USPIO-PEG-sLeX乳液用超純水(PH6.0)稀釋后，裝于1.5ml的Eppendorf管中，開啟Zeta粒徑分析儀，待機器預熱30min后進行測量,用移液槍吸取1ml的納米微粒溶液于透明的塑料杯中，放入Zeta粒徑分析儀測定偶聯(lián)前、后納米顆粒的Zeta電位，重復三次，取其平均值。

2 結(jié) 果

USPIO-PEG-sLeX溶液顏色呈淡黃色，澄清，沒有明顯的沉淀，分散性較好。TEM顯示USPIOPEG-sLeX靶向磁性納米顆粒呈細顆粒狀外觀，大小均勻，散在分布，磷鎢酸染色后的PEG化磁性納米顆粒的磁核尺寸約為(10±2.6) nm(圖1)。

DLS測得偶聯(lián)前的PEG化磁性納米顆粒其平均水動力尺寸為(34.06±9.95)nm(圖2)，偶聯(lián)后的sLeX偶聯(lián)磁性納米顆粒復合物的平均水動力尺寸為(53.35±16.99)nm（圖3）。從圖中可看出納米顆粒及復合物的尺寸分布范圍較窄，粒徑分布較均一。

偶聯(lián)前的PEG化磁性納米顆粒的氨基末端顯正電，Zeta激光粒度儀測得偶聯(lián)前的PEG化磁性納米顆粒的Zeta電位分別為(11.6±3.96)mV(圖4)。偶聯(lián)后的PEG化磁性納米顆粒的sLeX通過羧基與納米顆粒表面氨基結(jié)合，磷脂PEG的磷酸根基團顯負電，測得Zeta電位(-12.6±5.33)mV(圖5)。

圖1 USPIO-PEG-sLeXTEM電鏡圖（2%的磷鎢酸負染）。圖2-3 DLS測得偶聯(lián)前（圖2）后(圖3)PEG化磁性納米顆粒其平均水動力尺寸。圖4-5 Zeta 電位測得偶聯(lián)前（圖4）后(圖5)PEG化磁性納米顆粒其電位。

3 討 論

ELAM-1分子量為115ku，由589個氨基酸殘基構(gòu)成，也主要集中于毛細血管后微靜脈，內(nèi)皮細胞受刺激后，可維持24h然后從胞膜上脫落進入血液，成為可溶性ELAM-1[7]。ELAM-1在正常組織血管內(nèi)皮細胞表面的表達，發(fā)現(xiàn)ELAM-1僅在甲狀腺、淋巴結(jié)、扁桃體血管中表達,大多數(shù)人體組織未見表達。ELAM-1的配體為細胞膜上的糖蛋白或糖脂，含有sialyl-Lewisx及其同分異構(gòu)體sialyl-Lewisa。ELAM-1及其配體參與了腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞的粘附，應用生物治療方法有選擇性地阻斷ELAM-1等粘附分子與腫瘤細胞之間相互作用，達到阻止或預防腫瘤轉(zhuǎn)移[8-9]。本文合成分子探針USPIO-PEG-sLeX，將可能成功地用于監(jiān)測和評價針對腫瘤轉(zhuǎn)移的靶向治療的可能。

本實驗采用PEG表面修飾的Fe3O4作為磁共振造影劑，并利用其表面羧基與具有靶向識別腫瘤表面分子表達的sLeX進行耦聯(lián)，制備出具有腫瘤靶向性的磁共振分子探針。USPIO-PEG-sLeX納米顆粒的表征結(jié)果表明，經(jīng)PEG修飾的Fe3O4粒子呈球形，大小均勻，分散性較好，平均粒徑10nm左右。相比于配體交換的表面修飾方法對于顆粒形貌及性質(zhì)具有破壞和削弱作用[10]，本文通過疏水相互作用在油相納米顆粒表面進行PEG化修飾的方法更具優(yōu)勢。以兩親性DSPE-PEG2000為表面活性劑，制備得到Fe3O4-PEG納米顆粒，透射電鏡表征結(jié)果顯示PEG化修飾后的納米顆粒保持了原有的形貌和尺寸,而且PEG化后的氧化鐵納米顆粒具有較低的類酶活性，能夠體內(nèi)實驗時有效躲避小鼠巨噬細胞的吞噬。同時，PEG包裹在Fe3O4的表面產(chǎn)生配位作用，它可降低磁性納米粒子的表面自由能和疏水作用力，且形成一定的空間位阻，從而減少了Fe3O4納米粒子的團聚，實現(xiàn)體內(nèi)長循環(huán)的優(yōu)勢。

聚合物的水動力學尺寸指的是聚合物水溶液中包裹著聚合物分子的水化分子層的尺寸，聚合物濃度增加到一定程度，聚合物鏈將發(fā)生明顯的纏結(jié)作用，導致聚合物的分子尺寸會增大[11-12]。本文結(jié)果顯示，DLS測得偶聯(lián)前后PEG化磁性納米顆粒其平均水動力尺寸為(34.06±9.95) nm和(53.35±16.99)nm，而且納米顆粒及復合物的尺寸分布范圍較窄，粒徑分布較均一。USPIOPEG-sLeX乳液中納米粒子以一定尺寸分布的聚集體的形式存在其中，磁性納米粒子的聚集和表面生物分子吸附主要通過對水動力尺寸的改變來影響其特征頻率，磁偶極相互作用和范德瓦爾茲力導致USPIO-PEG-sLeX聚集的原因。本文通過PEG表面修飾，在表面引入更多的電荷和有機分子阻擋層可以改善這種聚集。同時，USPIO-PEG-sLeX窄的粒子尺寸分布能夠降低磁化率譜的寬度，從而可進一步增加磁共振分子成像檢測其靈敏度，因此，USPIO-PEG-sLeX屬于磁敏感探針。

Zeta電位的重要意義反映了偶聯(lián)前后USPIO-PEG-sLeX的穩(wěn)定性。Zeta電位是對顆粒之間相互排斥或吸引力的強度的度量,分子或分散粒子越小，Zeta電位(正或負)越高，體系越穩(wěn)定，即溶解或分散可以抵抗聚集。反之，Zeta電位(正或負)越低，越傾向于凝結(jié)或凝聚，即吸引力超過了排斥力，分散被破壞而發(fā)生凝結(jié)或凝聚[13-14]。本文結(jié)果顯示，電位偶聯(lián)前后的PEG化磁性納米顆粒的Zeta電位分別為(11.6±3.96) mV，(-12.6±5.33)mV，提示了USPIO-PEG-sLeX的穩(wěn)定性一般。

總之，油酸包裹的PEG-Fe3O4納米顆粒與ELAM-1的特異性配體sLeX偶聯(lián)形成復合物(USPIO-PEG-sLeX)，該分子探針具有良好表征，有望滿足體內(nèi)、外實驗特異性結(jié)合ELAM-1的要求，對監(jiān)測ELAM-1在腫瘤的表達以及預測腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的風險等方面應用具有廣闊應用前景。

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(本文編輯: 張嘉瑜)

Construction and Characterization of MR Molecular Probe Targeted Endothelial Cell Adhesion Molecule-1*

LIU Shu-ying, GU Dong-lian, LAI Shao-lv,et al., Department of Radiology,Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi Province,China

ObjectiveTo investigate the methods of preparing a specific molecular probe for magnetic resonance imaging targeting endothelial cell adhesion molecule-1 (ELAM-1) with ultrasmall superparamagnetic particles of iron oxide(USPIO) chelating sialyl-Lewis X (sLeX), and research its physicochemical properties.MethodsUsing physical deposition method to synthesis USPIO nanoparticles. By hydrophobic interactions, preferable water-soluble PEG-SPIO was synthesized and the surface -COOH was sufficiently activated,then incubated with sufficient sLeXat room temperature, purified by centrifugal ultrafiltration and washed with deionized water. The magnetic resonance molecular probe USPIO-PEG-sLeXwas prepared and characterize it.ResultsTEM results revealed that the PEG-SPIO had a size of (10±2.6)nm with good dispersibility and suitable size. DLS study showed that before and after coupling,the hydrodynamic mean diameter were (34.06±9.95)nm and (53.35±16.99) nm, respectively. Zeta potential study showed that before and after coupling the potential of PEG conjugated magnetic nanoparticles potential were (11.6±3.96) mV and (-12.6±5.33) mV,respectively.ConclusionThe method of chemical conjugation can be successfully prepared MRI molecular probe USPIO-PEG-sLeX, which has a well-characterized molecular probe, and it is expected to meet vivo experiments specifically binds to ELAM-1 requirements.

Magnetic Resonance Molecular Imaging; Ultrasmall Superparamagnetic Particles of Iron Oxide; Endothelial Cell Adhesion Molecule-1

R445.2

A

國家自然科學基金資助項目(NO.81260334和81460452)

10.3969/j.issn.1672-5131.2016.08.043

蘇丹柯

2016-06-28