周翔 中南大學(xué)腎臟病研究所(腎臟疾病與血液凈化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室) (湖南 長沙 410011)
Luminex Flexmap 3D液相芯片系統(tǒng)的應(yīng)用及使用維護(hù)技巧
周翔 中南大學(xué)腎臟病研究所(腎臟疾病與血液凈化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室) (湖南 長沙 410011)
Luminex Flexmap 3D液相芯片系統(tǒng)是美國luminex公司于近年推出的新一代超高通量檢測系統(tǒng),該系統(tǒng)是基于Flexmap 3D技術(shù)(又稱流式熒光技術(shù)、液態(tài)芯片),以抗體為基礎(chǔ),熒光編碼微球?yàn)楹诵?,整合激光檢測、應(yīng)用流體學(xué)、高速數(shù)字信號和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則等多項(xiàng)技術(shù),從而實(shí)現(xiàn)多因子的高通量檢測。被譽(yù)為以功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)為核心的后基因組技術(shù),可廣泛應(yīng)用于臨床診斷、生物醫(yī)學(xué)研究、生物制藥等領(lǐng)域,是醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)和疾病機(jī)制研究等的重要發(fā)展方向。
Flexmap 3D技術(shù)是xMAP技術(shù)的升級。xMAP技術(shù)是基于兩種不同熒光素配比標(biāo)記的聚苯乙烯微球或磁力微球編碼并共價(jià)交聯(lián)特定檢測物的探針、抗體或抗原,不同的微球混合后結(jié)合特異性待測物的蛋白(抗原或抗體)或核酸(DNA或RNA)。再以生物素為標(biāo)記并用熒光染料染色,當(dāng)單個(gè)微球通過兩色激光的檢測通道,紅色分類熒光可將微球分類,將不同分析反應(yīng)區(qū)分開來;綠色報(bào)告熒光是確定微球上結(jié)合的報(bào)告熒光分子量。通過亮色激光來實(shí)現(xiàn)定性和定量分析。根據(jù)紅色分類熒光的不同比例可將微球分為100種,F(xiàn)lexmap 3D技術(shù)將兩種熒光素提升為三種,熒光素的比例不同而可將微球分為500種。檢測能力是前代機(jī)型Luminex100/200的5倍,微球通過激光激發(fā),收集3種不同的熒光,而實(shí)現(xiàn)三維立體檢測。[1~2]
Luminex Flexmap 3D液相芯片系統(tǒng)主要優(yōu)勢是:①高通量,10~50ul樣本量理論一次可同時(shí)檢測500個(gè)指標(biāo);②高速度,進(jìn)樣速度2ul/s,1h內(nèi)最多獲得48,000個(gè)數(shù)據(jù),96孔板和384孔板均適用;③既能檢測蛋白也能檢測核酸,樣本類型豐富,血清、血漿、尿液、培養(yǎng)液等都能作為檢測樣本;④靈敏度高,檢測低限為10pg/ml,檢測范圍為4.5logs。
Luminex Flexmap 3D液相芯片技術(shù)相比固相芯片技術(shù)優(yōu)勢明顯,Luminex Flexmap 3D液相芯片技術(shù)靈活性好,微球可以單獨(dú)制備,使用時(shí)混勻,可根據(jù)需要隨時(shí)調(diào)整檢測體系。由于微球直徑小,容易混懸,能克服固相芯片的大分子檢測時(shí)受的表面張力等的干擾,能較好的保存蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象及活性,大大提高檢測穩(wěn)定性。
免疫檢測:臨床診斷領(lǐng)域和生命科學(xué)研究領(lǐng)域,同時(shí)檢測多個(gè)免疫指標(biāo)的情況非常多,很多時(shí)候樣本量小且珍貴,而且需要同時(shí)檢測多個(gè)指標(biāo),傳統(tǒng)的檢測方法需要耗費(fèi)大量樣本、人力時(shí)間。Luminex Flexmap 3D液相芯片和ELISA方法相似,在免疫分析領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛,但敏感性、靈敏度明顯高于ELISA方法,且能實(shí)現(xiàn)共高通量檢測,在10~50ul樣本量下,理論上能檢測出500個(gè)指標(biāo),細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)志物、自身免疫抗體檢測等方面都已有非常成熟的試劑盒。如腫瘤標(biāo)志物檢測,由于大部分單個(gè)腫瘤標(biāo)志物敏感性或特異性偏低,不能完全滿足臨床需要,而現(xiàn)在成品試劑盒基本已囊括所有的腫瘤標(biāo)志物,能在3~4h內(nèi)完成檢測。還如細(xì)胞因子的檢測,是分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究,在揭示某些疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及診斷治療過程中有非常重要的價(jià)值,但常規(guī)的方法只能單一檢測一種細(xì)胞因子,操作繁瑣且費(fèi)時(shí)費(fèi)力,利用Luminex Flexmap 3D液相芯片系統(tǒng)就能在段時(shí)間內(nèi)高效完成檢測。[3,6,7]
傳染病檢測:液相芯片系統(tǒng)的檢測原理和ELISA法相似,制備交聯(lián)微球,建立反應(yīng)體系,如人類免疫缺陷病毒(HIV-1、HIVI-p24等)[4]、丙型肝炎病毒(HCV)和HBV等目前已有商品化的試劑盒。
核酸檢測:Luminex Flexmap 3D液相芯片技術(shù)操作簡單、結(jié)果數(shù)字化,高通量檢測是PCR技術(shù)無法比擬的。如多種呼吸道病毒分子的鑒別診斷已被許多實(shí)驗(yàn)室廣泛使用[5]。MicroRNA表達(dá)譜分析不但特異性好、準(zhǔn)確性高,而且可以方便的作為常規(guī)檢測。
Luminex Flexmap 3D液相芯片系統(tǒng)是大型精密儀器,使用需要有專人管理建立儀器檔案,嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程操作及維護(hù),保障儀器的正常運(yùn)行,在具體操作過程中需注意以后事項(xiàng):
(1)開機(jī)預(yù)熱:在使用儀器前,需開機(jī)預(yù)熱?!癟emp”達(dá)到±0.3°C為最佳。如果環(huán)境溫度太低(≤20°C)或太高(≥33°C),可提前開啟空調(diào),將環(huán)境溫度穩(wěn)定在28~30°C為最佳。
(2)為保證儀器穩(wěn)定正常運(yùn)行,每日開機(jī)預(yù)熱后,清洗(washes)、校驗(yàn)(performance verification),每周開機(jī)還需進(jìn)行校準(zhǔn)(calibration)。每個(gè)月應(yīng)開機(jī)并校準(zhǔn)儀器,如果出現(xiàn)液路不暢,首先應(yīng)排除上樣針及鞘液過濾器的問題,可將上樣針和過濾器置于超聲清洗儀中超聲5min。
(3)在試劑加樣時(shí),要充分振蕩混勻。如果使用磁力架洗滌,快速翻轉(zhuǎn)倒出洗滌液后,在輕扣在吸水紙上,將殘余洗滌液吸干,避免用力拍打。
[1]Rausch TK, Schillert A, Ziegler A, et al.Comparison of pre-processing methods for multiplex bead-based immunoassays[J].BMC Genomics. 2016 Aug 11;17(1):601.
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[3]張保強(qiáng),張曉. Luminex液態(tài)芯片在臨床及科研中的應(yīng)用[J]. 當(dāng)代醫(yī)學(xué),2012,04:18-20.
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[5]蕪為. 基于Luminex平臺的病毒性出血熱多重血清學(xué)檢測方法的建立及其評價(jià)[D].中國疾病預(yù)防控制中心,2014.
[6]徐潞君. luminex xMAP技術(shù)在慢性賢臟病腎組織AKT/mTOR信號通路中的應(yīng)用[D].中南大學(xué),2013.
[7]謝沖,王國民. Luminex液相芯片的發(fā)展及應(yīng)用[J]. 復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010,02:241-244.
1006-6586(2016)05-0120-01
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