李美麗

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分子技術(shù)在臨床微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用

李美麗

【摘要】隨著分子技術(shù)在現(xiàn)代社會(huì)的廣泛應(yīng)用，微生物檢驗(yàn)逐漸提高到了一個(gè)新的水平，分子技術(shù)已逐漸成為臨床診斷的主要依據(jù)。作為一門實(shí)踐性較強(qiáng)的學(xué)科，臨床微生物要求微生物檢驗(yàn)人員理論與實(shí)踐相結(jié)合，結(jié)合臨床實(shí)踐。文章簡要介紹了分子技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用，主要包括PCR技術(shù)、核酸探針技術(shù)、基因芯片技術(shù)和其它相關(guān)的分子技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用，使得分子技術(shù)在臨床微生物檢驗(yàn)中發(fā)揮最大的作用，更好的應(yīng)用于臨床。

【關(guān)鍵詞】分子技術(shù)；微生物檢驗(yàn)；聚合酶鏈反應(yīng)；核酸

With the wide application of molecular techniques in modern society，microbiological testing is gradually raised to a new level，molecular technology has gradually become the main basis for clinical diagnosis. As a practical strong discipline，clinical microbiology requires inspectors to combine theory with practice. This article briefly describes the application of molecular techniques in microbiological testing，including PCR technology，nucleic acid probes，gene chip technology and other related molecular techniques in microbial testing of such molecular techniques to maximize the clinical microbiological testing of action，better clinical application.

【Key words】Molecular techniques，Microbiology inspection，Plolymerase chain reaction，Nucleic acid

作為21世紀(jì)的主導(dǎo)技術(shù)之一，分子技術(shù)發(fā)展越來越迅速，且更廣泛地應(yīng)用于微生物檢驗(yàn)，使得一些病原微生物能從RNA、DNA的水平上檢測出來，這就在一定程度上減輕了醫(yī)務(wù)工作者的負(fù)擔(dān)。聚合酶鏈反應(yīng)（plolymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，能對(duì)病毒基因進(jìn)行快速診斷、對(duì)病原微生物進(jìn)行鑒定，同時(shí)，在篩查腫瘤方面也較好，因此得到了廣泛的推廣運(yùn)用［1］。核酸探針技術(shù)比較廣泛用于病原菌檢測，又快又敏感，且精準(zhǔn)［2］?；蛐酒夹g(shù)能快速檢測多種待檢產(chǎn)品，信息量相對(duì)較大，通量也相對(duì)較高，因此對(duì)于病原菌的檢測具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。通常的傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)技術(shù)，主要根據(jù)微生物存在狀態(tài)進(jìn)行分類。由于同一種生物在其生理生化性狀及形態(tài)都存在差異，這些方法存在一定誤差，因此很難準(zhǔn)確鑒定。現(xiàn)如今，由于其迅速發(fā)展的速度，分子技術(shù)已經(jīng)廣被接受，且越來越多通過一些研究，將微生物放在核酸水平上進(jìn)行考慮，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行鑒定。其鑒定結(jié)果更具備說服力，究其原因，是因?yàn)榉肿蛹夹g(shù)具有與其它不同的特點(diǎn)，包括快速、簡便、可靠、高效，而這些傳統(tǒng)的微生物檢驗(yàn)方法不具備此特點(diǎn)?，F(xiàn)在探討核酸探針、PCR及基因芯片等分子技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中的最新應(yīng)用研究，從而為相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1　PCR技術(shù)

PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，其最大特點(diǎn)，是能大幅增加微量的DNA。因此，無論是兇殺案中兇手所遺留的皮膚、毛發(fā)或血液，或是歷史人物的殘骸、化石中的古生物，只要能分離出相對(duì)較少的DNA，就能用PCR加以放大，進(jìn)行比對(duì)。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。PCR的設(shè)想最初是由美國Mullis在1983年首次提出，隨著1985年聚合酶鏈反應(yīng)的問世，即簡易DNA擴(kuò)增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到2013年，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。1973年，臺(tái)籍科學(xué)家錢嘉韻，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻(xiàn)。

PCR作為一種新興的分子技術(shù)，兼具應(yīng)用廣、發(fā)展快、生命力強(qiáng)大等特點(diǎn)，通過進(jìn)一步的研究，研究人員逐漸推導(dǎo)出聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的特性和原理，并經(jīng)過多年的發(fā)展，使得該技術(shù)得到進(jìn)一步完善。不僅如此，研究學(xué)者經(jīng)過長時(shí)間的研究，發(fā)掘出其它的相關(guān)用途，比如，連接酶鏈反應(yīng)是依賴核酸序列的擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄依賴擴(kuò)增系統(tǒng)以及免疫PCR等［3］。隨著時(shí)間的發(fā)展，到了20世紀(jì)末，我國便已經(jīng)開始將PCR技術(shù)應(yīng)用在病原微生物檢驗(yàn)中，如檢驗(yàn)獲得免疫性病毒、性病致病菌、肝炎病毒等［4］。

雖然PCR技術(shù)比較先進(jìn)，但也存在一些問題，比如形成引物二聚體、出現(xiàn)假陽性、RNA病毒的PCR檢測操作繁瑣等。這些問題的出現(xiàn)，讓更多專家學(xué)者不得不再次對(duì)其進(jìn)行研究，為了彌補(bǔ)其不足，通過不斷的研究，一些新的PCR技術(shù)逐漸衍生出來并被用于實(shí)踐，如巢式PCR、熱啟動(dòng)PCR、限制性長度多態(tài)性分析（RFLP）、通用引物PCR、隨機(jī)引物DNA 多態(tài)性擴(kuò)增（RAPD）、多重PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR（real-time PCR）等［5］。

綜上所述，PCR技術(shù)盡管會(huì)有缺點(diǎn)，但將來仍有可能改變微生物檢驗(yàn)的發(fā)展，這種發(fā)展，不再僅僅局限于生理特性及外部形態(tài)結(jié)構(gòu)，而是讓微生物檢驗(yàn)發(fā)展成為分子水平以上的確診。

2　核酸探針技術(shù)

所謂核酸探針，主要是指帶有標(biāo)記的特異DNA片段，通過一些固定的原則（如堿基互補(bǔ)配對(duì)），讓其與目的DNA進(jìn)行雜交，最后再用特定的方法測定標(biāo)記物［4］。常見的探針標(biāo)記的方式主要有非放射性標(biāo)記及放射性標(biāo)記，而前者目前應(yīng)用較多，較為準(zhǔn)確與直觀［6］。例如，生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)標(biāo)記的探針目前的應(yīng)用越來越受到廣大研究學(xué)者的歡迎，已在一些相應(yīng)的檢測中得到了應(yīng)用，主要的檢測指標(biāo)包括乙型肝炎病毒、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌以及沙門氏菌的檢測［7］。

現(xiàn)如今，核酸探針在微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用，主要包括：（1）用于流行病學(xué)調(diào)查研究，區(qū)分無毒及有毒菌株；（2）用于檢測不能進(jìn)行生化鑒定、無法培養(yǎng)、以及缺乏診斷抗原等病原體的檢測；（3）檢測細(xì)菌內(nèi)之間的抗藥基因；（4）用于檢測病毒病，如檢測獲得免疫性缺陷病毒、肝炎病毒；（5）用于分析食品是否會(huì)被某些耐藥菌株污染，判定食品污染的特性。相關(guān)學(xué)者以啤酒腐敗菌中厭氧菌Pectinatus的16SrRNA作為靶分子設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，利用熒光標(biāo)記檢測啤酒是否發(fā)生污染。

3　生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期以來最具影響的學(xué)科之一，作為融合多種尖端科學(xué)（生物學(xué)、微電子學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等）的技術(shù)。生物芯片技術(shù)主要以玻片為載體，以生物活性分子為排列序列，經(jīng)過排列組合，可以起到同時(shí)檢驗(yàn)多種疾病的目的。基于其準(zhǔn)確高效的特點(diǎn)，基因芯片技術(shù)現(xiàn)如今已逐漸運(yùn)用到有關(guān)基因系列，且越來越多地被運(yùn)用到病原菌感染的研究中［8］。

基因芯片技術(shù)具有如下優(yōu)勢(shì)：首先，基因芯片技術(shù)檢驗(yàn)特性更加準(zhǔn)確，通過各種不同的方法，可將其它方法檢驗(yàn)不出的一些問題檢驗(yàn)出來，時(shí)效性較高，已經(jīng)廣泛運(yùn)用于基因序列的分析、病原微生物感染的快速診斷、病原菌變異及耐藥機(jī)制的研究。其次，基因芯片技術(shù)具有檢驗(yàn)抗體產(chǎn)生之前的感染的特性，因此針對(duì)有無感染的情況，通過檢驗(yàn)便知。同時(shí)，基因芯片技術(shù)具有更高效的檢驗(yàn)特性，能夠直接且快速地確定病原體的類型。傳統(tǒng)的檢測技術(shù)無法有效獲得患者的精確信息，因此醫(yī)生會(huì)由于諸類原因而無法有效的進(jìn)行治療［9］。隨著醫(yī)療技術(shù)及基因芯片技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，在不久的姜磊眾多的微生物全基因序列將得到測定，人們或許能在一張芯片上檢測出所有的病原菌。

4　其它分子技術(shù)

除上述分子技術(shù)，隨著分子技術(shù)的發(fā)展，越來越多的分子技術(shù)孕育而生。DNA分子標(biāo)記技術(shù)、ATP生物發(fā)光法、氣相色譜法、高效液相色譜法等，讓微生物檢驗(yàn)得到了更高的精準(zhǔn)度與效率。目前，分子技術(shù)的發(fā)展方向主要集中于高度自動(dòng)化、高度特異性及高度靈敏性［8］，使得各個(gè)技術(shù)之間的局限被打破，且能更好與其它學(xué)科進(jìn)行交叉并融合，從而將檢驗(yàn)的范圍擴(kuò)展；同時(shí)，隨著新分子技術(shù)的不斷孕育，分子技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用也隨之變得越來越廣泛［10］。

5　結(jié)語

綜上所述，分子技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中的運(yùn)用變得逐漸廣泛，現(xiàn)在分子技術(shù)的種類不斷增加，各個(gè)方法之間，有優(yōu)勢(shì)，也有不足。在實(shí)際的臨床應(yīng)用中，要想鑒定一個(gè)新的菌株，除了利用不同分子技術(shù)外，還要綜合各項(xiàng)鑒定結(jié)果，系統(tǒng)地從生理生化特征等方面逐一進(jìn)行鑒定，才能更好的確定菌株的分類與歸屬。分子技術(shù)能提高臨床微生物檢驗(yàn)的精準(zhǔn)度，提高檢驗(yàn)效率。

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Application of Molecular Techniques in Clinical Microbiology Inspection

LI Meili Clinical Laboratory，Liaoning Provincial Tumor Hospital of Anshan City，Anshan Liaoning 114034，China

【Abstract】

【中圖分類號(hào)】R446

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1674-9316（2016）09-0160-03

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2016.09.110

作者單位：遼寧省鞍山市腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 鞍山 114034