李冬杰

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018））

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑果枸杞愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及分化的影響

李冬杰

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018））

為建立黑果枸杞高頻再生體系及進(jìn)行細(xì)胞突變體篩選、遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)，以黑果枸杞葉片、莖段和腋芽為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖及不定芽分化研究。結(jié)果表明：誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L；在愈傷組織的繼代培養(yǎng)過(guò)程中，高濃度的2，4-D有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，但對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L；在愈傷組織的再分化過(guò)程中，6-BA對(duì)再生芽的分化效果最好，出芽率高，且多誘導(dǎo)出叢芽，最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.10mg/L。試驗(yàn)表明：黑果枸杞葉片、莖段和腋芽均可誘導(dǎo)愈傷組織，莖段誘導(dǎo)率最高；篩選出了莖段愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及再生芽分化的適宜培養(yǎng)基，為其細(xì)胞工程育種及規(guī)模化生產(chǎn)提供支撐。

黑果枸杞；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；愈傷組織；誘導(dǎo)；增殖；不定芽

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科枸杞屬的多年生灌木，藥食兼用，為傳統(tǒng)珍貴中藥材[1]。果實(shí)中富含花青素為天然自由基清除劑，能延緩細(xì)胞衰老，增強(qiáng)免疫力；具有防治糖尿病、保肝、抗腫瘤、疏通血管、降壓、保護(hù)心血管等功效[2-3]，藥用、生態(tài)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值相當(dāng)可觀。市場(chǎng)需求量逐年攀升，野生資源遭受破壞而逐漸枯竭，人工栽培已成為黑果枸杞發(fā)展的重要途徑。目前，黑果枸杞研究基礎(chǔ)薄弱，人工種植存在技術(shù)瓶頸。如種源多來(lái)源于野生、半野生的采集狀態(tài)，造成種質(zhì)不清、優(yōu)劣混雜現(xiàn)象較為突出[4]，成為制約黑果枸杞質(zhì)量提高的內(nèi)在因素。所以優(yōu)良種苗快繁技術(shù)是加快其育種和新品種推廣的重要環(huán)節(jié)[5-6]。有關(guān)黑果枸杞快繁技術(shù)的報(bào)道在逐漸增多[7-9]。本文著重黑果枸杞的高頻再生體系研究，探討不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑果枸杞愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及分化的影響，為其細(xì)胞工程育種及規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為2a生黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr），采自河北科技大學(xué)藥用植物實(shí)驗(yàn)基地。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

選取2a生的黑果枸杞莖段、葉片、腋芽為外植體。從試驗(yàn)田取材后，自來(lái)水沖洗30min，在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精浸潤(rùn)30s，用無(wú)菌水沖洗3次。再用0.1%的升汞（HgCl2）消毒，葉片、莖段、腋芽分開(kāi)消毒，葉片消毒3min，莖段、腋芽消毒5min，然后用無(wú)菌水沖洗3次。

在滅過(guò)菌的濾紙上把葉片切成0.5cm×0.5cm的方塊，莖切成0.5～0.6cm長(zhǎng)的莖段，帶腋芽的外植體保留1個(gè)腋芽，長(zhǎng)約為0.5～0.6cm，最后接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（見(jiàn)表1）。把葉片、莖段、腋芽平放在培養(yǎng)基上。每種外植體在每種培養(yǎng)基上接10瓶，每瓶接4個(gè)外植體。接種后在黑暗條件下培養(yǎng)，定時(shí)觀察愈傷組織的誘導(dǎo)情況。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)基

1.2.2 愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)

將表1中的培養(yǎng)基作為繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，將誘導(dǎo)的愈傷組織在滅菌的濾紙上切成直徑大約為0.3～0.4cm左右的小塊，轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基處理10瓶，每瓶接愈傷組織4塊。接種后在黑暗條件下繼代培養(yǎng)。一段時(shí)間后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。

1.2.3 愈傷組織的再分化培養(yǎng)

在愈傷組織繼代培養(yǎng)后，將分散性較好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基（見(jiàn)表2）上進(jìn)行再分化誘導(dǎo)。將愈傷組織在滅菌的濾紙上切成直徑大約為0.5cm的愈傷組織塊，然后轉(zhuǎn)接到表2所示的再分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)不定芽或不定根的再生。每種培養(yǎng)基處理10瓶，每瓶接種4塊。接種后在光照條件下培養(yǎng)，每天給予光照12～13h，溫度控制在25℃。一段時(shí)間后，觀察愈傷組織的分化情況。

表2 愈傷組織再分化培養(yǎng)基

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑果枸杞愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在愈傷組織的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，采用了8種添加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的MS培養(yǎng)基，研究了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上25d后，8種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、濃度不同對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)效果不同，誘導(dǎo)率不同，而且愈傷組織的生長(zhǎng)情況也不同。A3培養(yǎng)基和A7培養(yǎng)基均對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有很好的效果，愈傷組織塊大，顏色淡乳白色，質(zhì)地較疏松，表面較干爽。比較NAA和2，4-D兩種生長(zhǎng)素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的效果，2，4-D的效果更好一些，誘導(dǎo)率達(dá)到95.8%，出愈時(shí)間較早，而且愈傷組織生長(zhǎng)速度較大。A1、A2、A5、A6培養(yǎng)基中，外植體上愈傷組織出現(xiàn)較晚，所以愈傷組織塊小。A4培養(yǎng)基和A8培養(yǎng)基上出現(xiàn)愈傷組織的時(shí)間較早，而且分化率高，但容易褐變，25d時(shí)觀察，已有部分愈傷組織發(fā)生褐變。所以，最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為A7培養(yǎng)基，即MS+2，4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L。

表3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑果枸杞愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑果枸杞愈傷組織繼代增殖的影響

將初代誘導(dǎo)的愈傷組織28d后轉(zhuǎn)接到與初代培養(yǎng)相同的新鮮培養(yǎng)基上，在黑暗條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)（見(jiàn)圖1A），轉(zhuǎn)接后的愈傷組織繼代培養(yǎng)5d后，愈傷組織塊有所增大。12d后愈傷組織的顏色由淡黃綠色轉(zhuǎn)為明亮的乳白色，生長(zhǎng)速度明顯加快，細(xì)胞團(tuán)快速增大，彼此接觸，使愈傷組織塊增大1～2.5倍。21d繼代1次，如此反復(fù)繼代3次后，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。如表4所示：不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響和對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響不相同。高濃度的2，4-D有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，但是對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)有抑制作用。在A2培養(yǎng)基和A6培養(yǎng)基上，愈傷組織生長(zhǎng)較快、質(zhì)地疏松，是較好的分化培養(yǎng)材料。比較這兩種培養(yǎng)基，A6培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)更好一些，長(zhǎng)勢(shì)更快，增殖倍數(shù)達(dá)到2.5，質(zhì)地更疏松（圖1B）。在A1培養(yǎng)基和A5培養(yǎng)基上的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)較慢，而且質(zhì)地較致密。在A3、A4、A7、A8培養(yǎng)基上的愈傷組織開(kāi)始時(shí)生長(zhǎng)的較快，但是，后來(lái)部分出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。所以，最佳的愈傷組織繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基是A6培養(yǎng)基，即MS+2，4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L。

表4 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑果枸杞愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)的影響

圖1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑果枸杞愈傷組織繼代增殖的影響

2.3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑果枸杞愈傷組織再分化的影響

在愈傷組織再分化實(shí)驗(yàn)中，采用了由不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的9種培養(yǎng)基，進(jìn)行了不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織再分化影響的試驗(yàn)。將繼代后的愈傷組織轉(zhuǎn)接到再分化培養(yǎng)基上后，觀察愈傷組織的再分化情況。在剛接入培養(yǎng)基的1～2d內(nèi)出現(xiàn)水漬化外觀，含水量較多，質(zhì)地松軟，3～4d后逐漸變得干燥、致密。愈傷組織在分化培養(yǎng)基上均有不同程度的增殖。7～9d后所有愈傷組織均在愈傷組織塊的邊緣出現(xiàn)新的淺綠色呈粒狀組織區(qū)，即為芽點(diǎn)（見(jiàn)圖2A）。14d左右愈傷組織表面有小芽萌發(fā)現(xiàn)象，在愈傷組織表面見(jiàn)有突起，隨著小芽的不斷發(fā)育，就會(huì)形成不定芽（見(jiàn)圖2B）。25d時(shí)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如表5所示。B5號(hào)培養(yǎng)基上最先出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，最先有小芽萌動(dòng)，分化出叢生芽，誘導(dǎo)率達(dá)39.6%。B1、B2、B3、B4培養(yǎng)基上芽的誘導(dǎo)率小，而且誘導(dǎo)的芽一般為單芽，不利于獲得大量不定芽。B6號(hào)培養(yǎng)基雖然誘導(dǎo)率也較高，而且也能誘導(dǎo)出叢芽。但是，不定芽長(zhǎng)勢(shì)較弱，不利于以后的生根及移栽。

B7、B8、B9添加KT的培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽的效果總體趨勢(shì)不如B1、B2、B3、B4、B5、B6添加6-BA的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率低，且誘導(dǎo)出的一般為單芽，不利于得到大量不定芽，而且添加KT培養(yǎng)基上的愈傷組織有不定根的出現(xiàn)，如表5中結(jié)果所示。大約2周后B7和B8培養(yǎng)基上的愈傷組織均長(zhǎng)出2條不定根，顏色為白色，長(zhǎng)度為1cm左右（見(jiàn)圖2C）。B1-B6號(hào)添加6-BA的培養(yǎng)基中未見(jiàn)有不定根出現(xiàn)，其大部分愈傷組織分化出不定芽。這與一些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比有利于誘導(dǎo)不定芽，而另有一些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比則更有利于不定根的誘導(dǎo)的結(jié)果一致[10]。

所以，最佳的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為B5號(hào)培養(yǎng)基，即MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.10mg/L。表明6-BA能夠顯著促進(jìn)愈傷組織的再分化，有利于不定芽的發(fā)生。但6-BA濃度過(guò)高會(huì)使芽變得纖細(xì)、脆弱，因此在不定芽誘導(dǎo)時(shí)宜選用6-BA的濃度為1～2mg/L。為了促進(jìn)芽的生長(zhǎng)，減弱6-BA的頂端抑制作用，在以MS+6-BA 2.0mg/L為基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加一定濃度的NAA。結(jié)果表明：NAA能夠顯著促進(jìn)芽的伸長(zhǎng)，濃度為0.10mg/L效果較好，而高濃度的NAA對(duì)愈傷組織出芽的誘導(dǎo)率以及芽的數(shù)目有略微的抑制作用。

誘導(dǎo)不定根的最佳培養(yǎng)基為B8培養(yǎng)基，即MS+KT 2.0mg/L+NAA 0.10mg/L，表明細(xì)胞分裂素KT對(duì)愈傷組織再分化出芽的作用不顯著，且獲得的芽較小，不利于以后的生根和移植培養(yǎng)，但有利于誘導(dǎo)不定根的發(fā)生，生根率高，達(dá)到53.2%。一定濃度的NAA能促進(jìn)不定根的生長(zhǎng)。

表5 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑果枸杞愈傷組織再分化的影響

圖2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑果枸杞愈傷組織再分化的影響

3 結(jié)論

黑果枸杞葉片、莖段和腋芽均可誘導(dǎo)出愈傷組織，莖段誘導(dǎo)率最高。誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L；在愈傷組織的繼代培養(yǎng)過(guò)程中，所需的條件與愈傷組織誘導(dǎo)的條件不同，高濃度的2，4-D有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，但是對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L；在愈傷組織的再分化過(guò)程中，6-BA對(duì)分化出芽的效果最好，出芽率高，且多誘導(dǎo)出叢芽，最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.10mg/L。篩選出了莖段愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及再生芽分化的適宜培養(yǎng)基，為黑果枸杞抗性細(xì)胞突變體篩選、細(xì)胞工程遺傳育種及規(guī)?；a(chǎn)提供支撐。

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Effects of Plant Growth Regulators on Callus Induction, Proliferation and Differentiation of Lycium ruthenicum Murr.

LI Dong-jie
（Department of Biological Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）

To establish a high-frequency regeneration system of Lycium ruthenicum Murr.and establish a basis for screening and genetic transformation of cell mutants.Using the leaves，stems and axillary buds of Lycium ruthenicum Murr as ex-plants，MS as the basic medium，the callus induction，proliferation and adventitious bud differentiation were studied when treatment with different concentrations of plant growth regulators.The optimal medium for callus induction was MS+2，4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L.In the process of callus subculture，the high concentration of 2，4-D was beneficial to the callus induction，but inhibited the callus growth，the optimal medium was MS+2，4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L.In the process of callus re-differentiation，6-BA had the best effect on the regeneration buds，the budding rate was high，and the buds were induced by the best culture medium，MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.10mg/L.The leaves，stem and axillary buds of Lycium ruthenicum Murr all could be induced into the callus and the stems had the highest induction rate.The suitable medium for callus induction，proliferation anddifferentiation of stem callus was screened out and which canprovide support for yhe cell engineering breeding and large-scale production of Lycium ruthenicum Murr.

Lycium ruthenicum Murr;Plant growth regulator;Callus;induction;Proliferation;Adventitious bud

S793.95

A

1002-3356（2016）04-0001-05

2016-06-22

項(xiàng)目來(lái)源：河北省科技支撐計(jì)劃（14237503D）。

李冬杰（1966-），碩士，教授，主要從事生物技術(shù)方面的教學(xué)與科研工作。