劉萌萌，徐志豐，魯瑩瑩，張有做，王 姝，倪勤學(xué)

（浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300）

鵝毛竹葉酪氨酸酶抑制物提取工藝優(yōu)化及活性評(píng)價(jià)

劉萌萌，徐志豐，魯瑩瑩，張有做，王 姝，倪勤學(xué)

（浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300）

該試驗(yàn)研究鵝毛竹葉酪氨酸酶抑制物的最佳提取工藝及其竹葉特征性成分的含量及活性。采用響應(yīng)面法優(yōu)化鵝毛竹葉酪氨酸酶抑制物的提取工藝，在此基礎(chǔ)上利用分極法制備酪氨酸酶抑制活性部位（SAE），并采用HPLC法定量分析其中綠原酸、咖啡酸、異葒草苷、葒草苷、對(duì)香豆酸、牡荊苷、異牡荊苷、山奈酚和苜蓿素9個(gè)竹葉特征性成分；通過DPPH法、ABTS法、FRAP法和酪氨酸酶催化氧化左旋多巴速率法評(píng)價(jià)SAE及竹葉特征性成分的抗氧化和酪氨酸酶抑制能力。結(jié)果顯示：鵝毛竹葉酪氨酸酶抑制物的最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇濃度70%，料液比1:16，提取溫度80益，提取時(shí)間1h。以此提取物為原料制備的SAE對(duì)酪氨酸酶的抑制IC50為658.46μg/mL，含有綠原酸（0.4285mg/g）、咖啡酸（0.0463mg/g）、異葒草苷（0.2999mg/g）、對(duì)香豆酸（0.4593mg/g）、山奈酚（1.7152mg/g）及苜蓿素（2.5513mg/g）6種竹葉特征性成分。其中咖啡酸的抑制酪氨酸酶活性最強(qiáng)，顯著高于陽性對(duì)照熊果苷，推測(cè)為鵝毛竹葉抑制酪氨酸酶的主要活性成分之一。表明鵝毛竹葉是一種來源豐富的酪氨酸酶抑制原料，具有進(jìn)一步研究和開發(fā)的意義。

鵝毛竹葉；響應(yīng)面；竹葉特征性成分；酪氨酸酶抑制；抗氧化

酪氨酸酶廣泛存在于生物體內(nèi)，是一種催化黑色素合成的關(guān)鍵限速酶[1]，與生物體的許多重要生理過程密切相關(guān)，其活性的過量異常表達(dá)既可以導(dǎo)致人體色素沉著性疾病的產(chǎn)生，也是引起果蔬褐變的主要原因[2]。因此，抑制酪氨酸酶活性的研究，一直是調(diào)控生物體黑色素生成的重點(diǎn)。由于近年來人們對(duì)“回歸大自然”和“組分天然化”的呼聲越來越高，所以尋求高效、安全的純天然酪氨酸酶抑制劑有著十分重要的意義。

竹子屬于禾本科竹亞科，具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、用途廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是非常有研究?jī)r(jià)值的分類群之一。竹葉里含有豐富的次生代謝物，具有抗病毒、抗氧化、抗衰老、提高免疫力和防治老年退行性疾病等作用[3]。竹葉提取物中的特征性成分主要是以綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸為代表的植物酚酸和以牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷和苜蓿素為代表的黃酮類[4]。我國(guó)的竹葉資源是量大而廉價(jià)的林業(yè)潛在資源，但經(jīng)化學(xué)成分分析的竹種數(shù)量?jī)H占我國(guó)竹種總數(shù)的4%左右[5]，且主要集中在桿型高大的剛竹屬竹種。而地被竹種桿型矮小，葉生物量大，葉子密集，便于機(jī)械化采摘，具有開發(fā)成葉用竹林的潛在優(yōu)勢(shì)。課題組前期研究比較了6種地被竹葉的有效成分含量、抗氧化和酪氨酸酶抑制活性，發(fā)現(xiàn)倭竹屬鵝毛竹（Shibataea chinen-sis Nakai）顯著優(yōu)于其他竹種[6]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)鵝毛竹葉醇提物的乙酸乙酯相總酚、總黃酮、三萜含量及抗氧化能力和酪氨酸酶抑制活性顯著高于其他分極相[7]，推測(cè)為鵝毛竹葉的主要酪氨酸酶抑制活性部位（SAE）。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，以提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制效應(yīng)為響應(yīng)值，用響應(yīng)面法優(yōu)化鵝毛竹葉酪氨酸酶抑制物的回流提取工藝，進(jìn)一步用乙酸乙酯富集活性物質(zhì)，得到鵝毛竹葉酪氨酸酶抑制活性部位（SAE）。利用HPLC外標(biāo)法分析活性部位的9種竹葉特征性成分含量，并對(duì)其特征性成分進(jìn)行抗氧化和酪氨酸酶抑制能力的評(píng)價(jià)。以期為天然酪氨酸酶抑制劑的研究開發(fā)和鵝毛竹葉在食品、保健品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鵝毛竹葉于2012年8月采自浙江省臨安市浙江農(nóng)林大學(xué)的翠竹園。

主要試劑：蘑菇酪氨酸酶、DPPH（2，2，-二苯基-1-苦味酰苯肼）、ABTS+、綠原酸、咖啡酸、異葒草苷、葒草苷、對(duì)香豆酸、牡荊苷、異牡荊苷、山奈酚、苜蓿素購自Sigma公司，純度均大于98%；L-DOPA購自阿拉丁公司，純度>99%；乙腈、甲醇、冰乙酸為色譜純；石油醚、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器設(shè)備

QEY-1000型粉碎機(jī)（浙江屹立工貿(mào)有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DGG-9053AD型鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；UV-1800型紫外分光光度計(jì)（上海島津有限公司）；SevenEasy型pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；A60159型精密電子天平（瑞士METTLERTOLEDO公司）；LC20AT高效液相色譜儀（上海島津有限公司）；MultiSkan FC酶標(biāo)儀（Thermo Scientific公司）。

1.3 竹葉酪氨酸酶抑制物的提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)

樣品前處理：采集新鮮的鵝毛竹葉，清洗，瀝干，立即用WD800G微波爐加熱（間隙加熱3次，每次1min）。葉樣放于60℃烘箱中干燥，粉碎，過40目篩，備用。

工藝流程：精密稱取鵝毛竹葉粉末5.00g寅在一定條件下回流提取3次寅趁熱過濾寅少量提取溶劑洗渣寅定容至一定濃度。

設(shè)置其他條件一致的基礎(chǔ)上，分別研究乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30）、提取溫度（50、60、70、80、90℃）、提取時(shí)間（10、30、60、90、120、150min）4個(gè)因素下竹葉提取物對(duì)酪氨酸酶活性抑制能力的影響。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇對(duì)酪氨酸酶活性抑制影響較大的因素乙醇濃度（X1）、料液比（X2）和溫度（X3）進(jìn)行考察，因素水平編碼見表1。確定浸提時(shí)間為1h，以對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率為響應(yīng)值，利用Design-Ex-pert.V8.0軟件優(yōu)化鵝毛竹葉酪氨酸酶抑制物的最佳提取條件。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平編碼

為進(jìn)一步考察上述優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性，以優(yōu)化的工藝條件提取竹葉酪氨酸酶抑制物，測(cè)定其酪氨酸酶抑制活性。

1.4 鵝毛竹葉酪氨酸酶抑制活性部位（SAE）的制備

根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稱取5.00g鵝毛竹葉粉末，按照最佳提取條件提取，浸膏用一定體積的蒸餾水充分混懸，加入適量石油醚除去弱極性物質(zhì)，以1:1的溶劑量用乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯萃取物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮干燥至恒重，得到SAE。

1.5 HPLC法測(cè)定有效成分的含量

1.5.1 色譜條件

[8]的方法并加以改進(jìn)：色譜柱為Agi-lent TC-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相A為1%冰乙酸、B為乙腈；梯度洗脫，0～10min，17%B；10～15min，17%～23%B；15～35min，23%B；35～ 40min，23%～40%B；40～50min，40%B；50～52min，40%～17%B；52～60min，17%B；體積流量為0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為330nm；柱溫為40℃；進(jìn)樣量10μL。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、異葒草苷、葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、山奈酚和苜蓿素標(biāo)準(zhǔn)品各2.50mg，用甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，搖勻，分別量取上述溶液各100μL混合搖勻，得到每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度均為62.5μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用甲醇稀釋成6個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為31.25、20.83、15.63、12.5、10.42μg/mL）。將上述溶液分別進(jìn)樣10μL，記錄各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品峰面積。以綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、異葒草苷、葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、山奈酚和苜蓿素的量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸。

1.5.3 分析方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液以10μL的進(jìn)樣量，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，分別計(jì)算各對(duì)照品峰面積的RSD。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取待測(cè)液10μL，分別于0、2、4、6、8h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各對(duì)照品峰面積的RSD。

1.5.4 樣品的測(cè)定

各樣品用50%甲醇配制成一定濃度，過0.45μm微孔濾膜后進(jìn)樣測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

1.6 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[9]并加以改進(jìn)，準(zhǔn)確稱取0.01g DPPH試劑，用甲醇定容后得0.10mmol/L DPPH溶液。分別取0.1mL待測(cè)樣品溶液和3.9mL DPPH溶液混合均勻，室溫下反應(yīng)1h，于517nm波長(zhǎng)下測(cè)定A值。以甲醇為空白對(duì)照，計(jì)算各樣品抑制率。

以待測(cè)樣品濃度為橫坐標(biāo)（X），抑制率為縱坐標(biāo)（Y）得待測(cè)樣品清除DPPH自由基的曲線。根據(jù)回歸方程，計(jì)算得到待測(cè)樣品清除DPPH自由基的半抑制濃度（IC50）。Vc為陽性對(duì)照。

1.7 ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)

取濃度為140mmol/L的過硫酸鉀水溶液176uL加入到10mL濃度為3.84mg/mL的ABTS+溶液中，混合均勻，避光反應(yīng)12～15h后加入無水乙醇將ABTS+溶液稀釋到在734nm波長(zhǎng)處吸光值為0.700依0.02。用無水乙醇調(diào)零分光光度計(jì)。將0.1mL的待測(cè)液與3.9mL的ABTS+溶液混合搖勻，室溫下反應(yīng)6min，在734nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值（A樣品）。用樣品溶解劑代替樣品測(cè)定吸光度值A(chǔ)空白。

以待測(cè)樣品濃度為橫坐標(biāo)（X），抑制率為縱坐標(biāo)（Y）得待測(cè)樣品清除ABTS+自由基的曲線。根據(jù)回歸方程計(jì)算得到待測(cè)樣品的半抑制濃度（IC50）。Vc為陽性對(duì)照。

1.8 FRAP法分析鐵離子還原能力

參照文獻(xiàn)[10]方法，把樣品配制成0.1mg/mL，各取0.3mL加入2.7mL工作液（0.3mol/L醋酸鹽緩沖液25mL，20mmol/LFeCl3溶液2.5mL，10mmol/L TPTZ溶液2.5mL，），混勻后于37℃條件下反應(yīng)10min，在593nm處測(cè)定A值。用樣品溶解劑做空白對(duì)照。

準(zhǔn)確稱取6.08mg硫酸亞鐵溶于適量水中，加入0.25mL硫酸溶液（18mol/L），用水稀釋至50mL，得0.8mmol/L的硫酸亞鐵溶液，置入小鐵釘。依次配制25、50、100、200、400μmol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，以硫酸亞鐵濃度為橫坐標(biāo)（X），A值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.0018X+0.0019（R2=0.9996）。

把樣品反應(yīng)后的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得的相應(yīng)硫酸亞鐵濃度（μmol/L）定義為FRAP值。Vc為陽性對(duì)照。

1.9 酪氨酸酶抑制活性的測(cè)定

1.9.1 酶活力的測(cè)定

底物L(fēng)-DOPA經(jīng)酪氨酸酶催化后產(chǎn)生多巴醌，多巴醌經(jīng)過氧化生成黑色素，黑色素在475nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。酶活力單位（U）：反應(yīng)液每分鐘在475nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD475）增加0.001為1個(gè)酶活力單位。具體方法：在pH6.8的磷酸緩沖液中，以5mmol/L的L-DOPA為底物，37℃下測(cè)定波長(zhǎng)為475nm的光密度值（OD475）隨時(shí)間的增長(zhǎng)直線，從斜率計(jì)算酶的活力，產(chǎn)物的消光系數(shù)按3700L/（mol·cm）計(jì)算[11]。

1.9.2 對(duì)酪氨酸酶抑制能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12]的方法加以改進(jìn)：配制不同濃度的樣品溶液，以5mmol/L的L-DOPA為底物，反應(yīng)總體系為200μL，準(zhǔn)確吸取1、2、3、4組反應(yīng)液（表2），充分混合后于37℃水浴30min，用酶標(biāo)儀在475nm處測(cè)定吸光度A，按以下公式計(jì)算抑制率。

A1：指只含有底物、酪氨酸酶的測(cè)活體系的吸光度值；

A2：指只含有底物的測(cè)活體系的吸光度值；

A3：指含有底物、酪氨酸酶、抑制物的測(cè)活體系的吸光度值；

A4：指只含有底物、抑制物的測(cè)活體系的吸光度值。

以樣品濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制曲線，求出各樣品抑制酪氨酸酶的IC50值。熊果苷為陽性對(duì)照。

表2 反應(yīng)液組成

1.10 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以X+s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝毛竹葉酪氨酸酶抑制物提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用BOX-Behnken中心組和設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert.V8.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 響應(yīng)面二次模型方差分析

由表3響應(yīng)面分析得到酪氨酸酶抑制率與各因素的二次擬合回歸方程：酪氨酸酶抑制率（Y）=

由表4可知：模型p<0.0001表明模型極顯著，失擬項(xiàng)p=0.0647>0.05，在琢=0.05水平上不顯著，說明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，實(shí)驗(yàn)誤差主要來源于隨機(jī)誤差。模型的確定系數(shù)R2越0.9819，調(diào)整系數(shù)R2adj=0.9587，說明模型能解釋95.87%響應(yīng)值變化，因而擬合度好，可以用此模型對(duì)鵝毛竹葉酪氨酸酶抑制物的提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。對(duì)模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)X1乙醇濃度和X2料液比極顯著（p約0.01），X3溫度顯著（p約0.05）；交互項(xiàng)X1X2極顯著（p約0.01），X1X3顯著（p約0.05），X2X3不顯著（p>0.05）；平方項(xiàng)均極顯著（p約0.01）。因此，各個(gè)因素對(duì)酪氨酸酶抑制活性的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

通過模型優(yōu)化得出鵝毛竹葉酪氨酸酶抑制物最優(yōu)提取條件為：乙醇濃度71.45%，料液比1:15.99，提取溫度81.28℃，提取時(shí)間為1h，此時(shí)酪氨酸酶的抑制率達(dá)到最大值46.78%。

2.1.2 響應(yīng)面和等高線圖分析

由方差分析可知：各因素之間有較強(qiáng)交互作用，根據(jù)回歸方程，作出各因素之間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖見圖1。如圖1所示，每個(gè)圖均有極值點(diǎn)，證明回歸方程模型可靠，且乙醇濃度（X1）、料液比（X2）及提取溫度（X3）對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響顯著；乙醇濃度與料液比之間的等高線明顯呈橢圓形，說明兩者之間交互作用非常顯著；乙醇濃度與提取溫度之間的交互作用顯著。

2.1.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

圖1 各因素之間的交互作用

為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行鵝毛竹葉酪氨酸酶抑制物的制備，考慮到實(shí)際操作的局限性，為了節(jié)省時(shí)間，節(jié)約成本，將提取工藝參數(shù)修正為：乙醇濃度70%，料液比為1：16，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為1h，測(cè)得的酪氨酸酶抑制率為45.35%，與理論預(yù)測(cè)值基本相符。表明采用該模型優(yōu)化的工藝參數(shù)具有可行性。

2.2 SAE的竹葉特征性成分分析

以綠原酸、咖啡酸、異葒草苷、葒草苷、對(duì)香豆酸、牡荊苷、異牡荊苷、山奈酚和苜蓿素的量對(duì)應(yīng)峰面積的線性回歸方程及線性范圍見表5。

SAE用50%甲醇溶解，取10μL樣液濾過后注入HPLC色譜儀分析測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算綠原酸、咖啡酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊苷、對(duì)香豆酸、牡荊苷、山奈酚和苜蓿素的量。各成分占SAE的含量見表5，相應(yīng)HPLC譜圖見圖2。由表5可知：SAE中含有綠原酸、咖啡酸、異葒草苷、對(duì)香豆酸、山奈酚和苜蓿素6種竹葉特征性成分，葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷未檢測(cè)到。其中苜蓿素和山奈酚含量較高。

表5 竹葉特征性成分分析方法學(xué)考察結(jié)果及在SAE的含量（n=5）

圖2 混合對(duì)照品（A）、SAE（B）的HPLC色譜圖

2.3 SAE及其特征性成分抗氧化活性

對(duì)SAE及其6個(gè)特征性成分的抗氧化性能進(jìn)行了DPPH、ABTS+和亞鐵離子還原力3個(gè)體系的測(cè)定。由表6可知：SAE具有較強(qiáng)的自由基清除能力和亞鐵離子還原力。對(duì)香豆酸和苜蓿素的DPPH自由基清除能力較弱，其他幾個(gè)單體Vc>綠原酸>咖啡酸>山奈酚>異葒草苷，均顯著高于SAE（p<0.05）。山奈酚的ABTS+自由基清除能力較弱，其他單體對(duì)香豆酸>綠原酸>Vc>苜蓿素、咖啡酸>異葒草苷。亞鐵離子還原力綠原酸>Vc>山奈酚>咖啡酸>異葒草苷、苜蓿素?？傮w上，特征性單體成分的抗氧化活性強(qiáng)于SAE。

2.4 SAE及其特征性成分酪氨酸酶抑制能力

以L-多巴為底物，SAE及其特征性成分酪氨酸酶抑制能力的試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表6可知：SAE的酪氨酸酶抑制能力弱于咖啡酸，但顯著高于其他幾種單體（p<0.05）。說明粗提物中化合物之間存在著酪氨酸酶抑制的相互協(xié)同作用，以粗提物的形式存在對(duì)酪氨酸酶抑制性能更強(qiáng)。

表6 SAE及其特征性成分的抗氧化及酪氨酸酶抑制活性（n=3）

3 討論

竹子含有豐富的次生代謝物，是我國(guó)重要的森林資源。以竹葉提取物為主要功能成分的一些保健品已在人類的健康事業(yè)中發(fā)揮了重要作用。地被竹因其植株矮小，萌發(fā)快，生長(zhǎng)周期短，竹葉面積大等特點(diǎn)，為開發(fā)新竹葉資源鋪開了新的道路。鵝毛竹是地被竹中有效成分含量較高的竹種，采用響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝，再利用分極法制備的酪氨酸酶抑制活性部位（SAE）具有較強(qiáng)的抗氧化性能力和酪氨酸酶抑制性能力（IC50為658.46μg/mL）。進(jìn)一步的HPLC外標(biāo)法試驗(yàn)，表明SAE含有綠原酸、咖啡酸、異葒草苷、對(duì)香豆酸、山奈酚和苜蓿素6種竹葉特征性成分。其中咖啡酸的酪氨酸酶抑制活性最強(qiáng)，顯著高于陽性對(duì)照熊果苷，推測(cè)為鵝毛竹葉抑制酪氨酸酶的主要活性成分之一。另外，鵝毛竹葉SAE中含有許多未知成分，有待進(jìn)一步的分離，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行鑒定和檢測(cè)，以期獲得新物質(zhì)和新的酪氨酸酶抑制劑，為豐富我國(guó)的竹葉資源和竹葉活性成分在保健品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］Ismaya W T，Rozeboom H J，Weijn A，et al.Crystal structure of Agaricus bisporus mushroom tyrosinase：iden-tityofthetetramersubunitsandinteractionwith tropolone［J］.Biochemistry，2011，50（24）：5477-5486.

［2］Sehgal V N，Verma P，Srivastava G，et al.Melasma： treatment strategy［J］.J Cosmet Laser Ther，2011，13（6）：265-279.

［3］MantawyEM，El-BaklyWM，EsmatA，etal. Chrysin alleviates acute doxorubicin cardiotoxicity in rats viasuppression of oxidative stress，inflammationand apoptosis［J］.Eur J Pharmacol，2014，728：107-118.

［4］龔金炎，吳曉琴，夏道宗，等.RP-HPLC法測(cè)定竹葉提取物中黃酮類和酚酸類成分［J］.中草藥，2010，41（1）：63-65.

［5］賴忻，陳其兵.竹葉提取物的化學(xué)成分及其生理功能研究進(jìn)展［J］.福建林業(yè)科技，2013，40（1）：214-220.

［6］倪勤學(xué)，劉穎坤，龔凌霄，等.6種地被竹葉有效成分及其抗氧化活性研究［J］.中草藥，2011，42（11）：2317-2321.

［7］張蕾，王姝，倪勤學(xué)，等.鵝毛竹葉提取物抗氧化及酪氨酸酶抑制活性的研究［J］.浙江林業(yè)科技，2014，34（5）：8-15.

［8］李喜鳳，師繪敏，陳隨清.HPLC同時(shí)測(cè)定蒲公英中咖啡酸和綠原酸的含量［J］.中成藥，2008，30（10）：1553-1556.

［9］Wu H W，Jing F，Tang L Y，et al.Quality evaluation of astragali radix based on DPPH radical scavenging activ-ity and chemical analysis［J］.Chin Herb Medic，2014，6（4）：282-289.

［10］趙琳靜，王斌，喬妍，等.香茅葉揮發(fā)油的化學(xué)成分及其體外抗氧化活性［J］.中成藥，2016，38（4）841-845.

［11］劉艷杰，王倩，姜民，等.基于譜效一構(gòu)效關(guān)系篩選大黃中酪氨酸酶活性抑制成分的方法研究［J］.中草藥，2012，43（11）2120-2126.

［12］Han P，Chen C Q，Zhang C L，et al.Inhibitory ef-fects of 4-chlorosalicylic acid on mushroom tyrosinase and its antimicrobial activities［J］.Food Chem，2008，107（2）：797-803.

Optimized Extraction Ttechnology of Tyrosinase Inhibitor From Leaves of Shibataea chinensis Nakai and Its Activities Evaluation

LIU Meng-meng，XU Zhi-feng，LU Ying-ying，ZHANG You-zuo，WANG Shu，NI Qin-xue
（Zhejiang A&F University，Lin'an，Zhejiang 311300）

To optimize the extraction technology of tyrosinase inhibitor from Shibataea chinensis Nakai and investigate the ef-fective components and their antioxidant and tyrosinase inhibition ability.According to the results of single factor test，the ty-rosinase inhibitor extraction from leaves of S.chinensis Nakai was optimized using response surface methodology.The S.chi-nensis Nakai active extract（SAE）was further prepared by polarization.Nine characteristic compounds（chlorogenic acid，caffeic acid，iso-orientin，Orientoside，p-coumaric acid，Vitexin，isovitexin，kaempferol and tricin）were quantitatively ana-lyzed by HPLC synchronously.The anti oxidative active of SAE and its characteristic components were assessed by DPPH，ABTS and FRAP assay.Tyrosinase inhibit ability was also estimated.The optimal technological parameters were ethanol con-centration 70%，solid-liquid ratio 1:16，extraction temperature of 80℃，extraction time of 1 h.The SAE showed an excel-lent tyrosinase inhibit ability（IC50658.46μg/mL），which contained six characteristic compounds，i.e.chlorogenic acid（0.4285mg/g），caffeicacid（0.0463mg/g），iso-orientin（0.2999mg/g），p-coumaricacid（0.4593mg/g），kaempferol（1.7152mg/g）and tricin（2.5513mg/g）.Caffeic acid showed stronger tyrosinase inhibit ability then others（p<0.05），which was speculated one of the main active ingredient of leaves of S.chinensis Nakai.Leaves from S.chinensis Nakai are a rich source of tyrosinase inhibitor，that worth further research and development.

Shibataea chinensis Nakai leaves;Response surface;Characteristic components;Tyrosinase inhibition;Antioxidant

S795

A

1002-3356（2016）04-0006-07

2016-08-11

國(guó)家自然科學(xué)基金（31401497）

劉萌萌（1989-），女，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)研究及功能性食品研發(fā)。E-mail:1035163724@qq.com.

倪勤學(xué)（1983-），女，碩士生導(dǎo)師，副教授，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)研究及功能性食品研發(fā)。E-mail：niqinxue@zafu. edu.cn.