林群英, 吳亮亮, 張鋒倫, 吳素玲, 項春榮, 孫曉明*

(1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042；2.江蘇鴻豐果蔬食品有限公司，江蘇 宿遷 223700； 3.鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)正東生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212000)

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利用秀麗線蟲評價4種食藥用菌水提物抗氧化活性

林群英1,2, 吳亮亮1,2, 張鋒倫1, 吳素玲1, 項春榮3, 孫曉明1,2*

(1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042；2.江蘇鴻豐果蔬食品有限公司，江蘇 宿遷 223700； 3.鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)正東生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212000)

利用秀麗線蟲為模型對樺褐孔菌、靈芝、云芝、灰樹花水提物進行抗氧化活性評價。結(jié)果表明：樺褐孔菌水提物最佳抗氧化濃度為0.2 mg/mL，線蟲平均壽命為7.84 d，比對照組延長了1.17倍；靈芝、云芝和灰樹花水提物最佳抗氧化濃度均為1.0 mg/mL，線蟲平均壽命分別為8.84 d、6.75 d、5.98 d，比對照組分別延長0.92倍、1.08倍和1.20倍。研究結(jié)果為這些食藥用菌的開發(fā)提供有用的參考依據(jù)。

樺褐孔菌；靈芝；云芝；灰樹花；抗氧化

目前我國已成為世界第一大食用菌生產(chǎn)國。據(jù)對全國27個省、自治區(qū)、直轄市統(tǒng)計調(diào)查，2014年全國食用菌總產(chǎn)量3 270萬噸，產(chǎn)值2 258.1億元[1]。食用菌富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素、微量元素等營養(yǎng)成分[2]，還含有多糖、黃酮等活性成分[3]，具有營養(yǎng)及保健價值。隨著研究的深入開展，食用菌的活性功能越來越受關(guān)注。金針菇(Flammulinavelutipes)具有抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力和增強記憶的功能[4]?；覙浠?Grifolafrondosa)具有良好的護肝、抗腫瘤的活性功效[5]。藥用大型真菌的藥用功效同樣備受關(guān)注。據(jù)《中國藥典》記載，靈芝(Ganodermalucidum)具有補氣安神，止咳平喘的功能，同時規(guī)定了靈芝含多糖不得少于0.50 %；云芝(Coriolusversiclor)具有健脾利濕，清熱解毒的功效，含云芝多糖不得少3.2 %[6]。樺褐孔菌(Inonotusobliquus)是俄羅斯的一種民間藥用真菌，具有顯著的抗癌作用和抗氧化活性[7-8]。食藥用真菌資源的開發(fā)價值已經(jīng)得到越來越多的證實和認可，為開發(fā)保健和功能產(chǎn)品提供了寶貴的生物資源。

秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)是生物研究的理想模式種，其生物學和基因組均得到充分的研究。秀麗線蟲易在顯微鏡下觀察，生命周期短，在20oC下平均壽命約為30天，且易于培養(yǎng)。在基因上與人類有60%～80%的相似度，研究結(jié)果具有意義，適合進行高通量的功效藥物篩選[9]。因具有以上眾多優(yōu)勢，除了在基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用，秀麗線蟲在藥物篩選、功能評價等方面也已經(jīng)得到越來越廣泛的應(yīng)用[10-11]。在植物和微生物資源功能評價方面均有應(yīng)用，在大型真菌方面亦開始有報道[12]。利用模式生物秀麗隱桿線蟲可以有效區(qū)分不同產(chǎn)地靈芝的生物活性[13]。靈芝多糖可延長線蟲壽命，被認為具有良好的抗衰老作用[14]。本研究以秀麗線蟲為模型，對樺褐孔菌、靈芝、云芝和灰樹花等4種食藥用真菌的抗氧化活性進行研究，為開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與原材料

百草枯和5-氟尿嘧啶均購自Sigma公司，其余試劑為國產(chǎn)試劑。灰樹花由上海森明公司提供；靈芝和云芝為市售產(chǎn)品，產(chǎn)地為遼寧；樺褐孔菌提取物由杭州百山祖生物科技有限公司提供。

1.2 秀麗線蟲

野生型秀麗線蟲 N2由美國Caenorhabditis Genetics Center(CGC)提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 水提物制備

將樺褐孔菌、靈芝和云芝粉碎至20目以下，按1∶20 (w/v)的比例加水煮沸2 h，紗布過濾后，再提取1次，將2次濾液合并，進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至生藥濃度為100 mg/mL。樺褐孔菌提取物用水溶解成水溶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抗氧化活性評價

秀麗線蟲同步化及培養(yǎng)按參考文獻[15]，利用野生型秀麗線蟲N2進行。將水提物配制成一定濃度后，添加至培養(yǎng)有秀麗線蟲的96孔板中，于20 ℃培養(yǎng)培養(yǎng)48 h，隨后往每個孔里添加百草枯至終濃度為40 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)。每天記錄線蟲存活數(shù)目，直至線蟲全部死亡。以0.5 mm粗的鉑金絲輕觸線蟲，無反應(yīng)者記為死亡。每組實驗所測線蟲數(shù)目不少于80條。

1.3.3 壽命試驗

根據(jù)抗氧化活性評價結(jié)果，用最佳濃度對N2進行壽命試驗。挑取同步化的L4期線蟲到各組含水提物的NGM平板培養(yǎng)基中，每組不低于100條。于20 ℃培養(yǎng)，從轉(zhuǎn)移時刻開始計算線蟲存活天數(shù)，轉(zhuǎn)移當天記為壽命實驗第0天，每天檢查線蟲，紀錄死亡數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樺褐孔菌水提物抗氧化活性

樺褐孔菌物水提物在低濃度(0.2 mg/mL)時可明顯提高秀麗線蟲的抗氧化能力，最大壽命為13 d，高長于對照組(9 d，圖1a)。但隨著濃度的提高，樺褐孔菌物水提物在0.5 mg/mL和1.0 mg/mL時，其抗氧化能力反而下降，平均壽命分別為5.12 d和5.45 d，均低于0.2 mg/mL處理組的平均壽命(7.84 d)，而高于對照組(4.08 d，圖1b)。

圖1 樺褐孔菌水提物對百草枯處理的秀麗線蟲壽命的影響

圖2 靈芝水提物對百草枯處理的秀麗線蟲壽命的影響

2.2 靈芝水提物抗氧化活性

在高濃度靈芝水提物(1.0 mg/mL)的處理下，秀麗線蟲的抗氧化能力最強，最大壽命為15 d，顯著高于對照組的最大壽命，(9 d，圖2a)，平均壽命為8.84 d，比對照組延長了4.40 d(圖2b)。在中低濃度下，靈芝水提物的抗氧化能力下降，平均壽命為3.69 d，短于1.0 mg/mL處理組的平均壽命，但仍長于對照組(圖2b)。

2.3 云芝水提物抗氧化活性

云芝水提物具有良好的抗氧化活性。濃度為1.0 mg/mL時，秀麗線蟲的抗氧化能力最強，最大壽命為12 d，顯著高于對照組的最大壽命，(8 d，圖3a)，平均壽命為6.75 d，明顯長于對照組(3.25 d，圖3b)。在0.2 mg/mL和0.5 mg/mL的濃度下，云芝水提物的抗氧化能力出現(xiàn)下降，平均壽命分別為4.90 d和5.15 d，但比對照組長(圖3b)。

圖3 云芝水提物對百草枯處理的秀麗線蟲壽命的影響

圖4 灰樹花水提物對百草枯處理的秀麗線蟲壽命的影響

2. 4 灰樹花水提物抗氧化活性

灰樹花水提物具有良好的抗氧化活性。濃度為1.0 mg/mL時，秀麗線蟲的抗氧化能力最強，最大壽命為13 d，顯著高于對照組的最大壽命(7 d，圖4a)，平均壽命為5.98 d，明顯長于對照組(2.72 d，圖3b)。0.5 mg/mL的濃度下，灰樹花水提物的抗氧化能力下降，平均壽命為4.88 d，比對照組長(圖3b)。水提物濃度為0.1 mg/mL時，無抗氧化活性，最大壽命和平均壽命分別為4 d和2.66 d，均低于對照組。

2.5 抗衰老活性評價

通過分析4種食藥用菌對秀麗線蟲壽命的影響，可反映其抗衰老活性。在樺褐孔菌、靈芝、云芝和灰樹花水提物最佳濃度下，線蟲的最大壽命分別為19 d、19 d、20 d和18 d，均延長了線蟲的壽命，平均壽命則分別為14.55 d、14.65 d、14.15 d和13.7 d(圖5a,b)。與對照組比較，除灰樹花無顯著性差異外，其余3種水提物均有明顯的差異。

圖5 4種食藥用菌水提物對正常培養(yǎng)的秀麗線蟲壽命的影響

3 小結(jié)與討論

利用秀麗線蟲對樺褐孔菌、靈芝、云芝和灰樹花的抗氧化活性進行研究。因秀麗線蟲為活體模型，與體外自由基方法相比，評價結(jié)果更具參考價值。通過添加百草枯引起線蟲出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，加速其死亡速度。這4種食藥用菌的水提物均能在很大程度上保護線蟲，延緩其死亡速率?；覙浠▽⑵骄鶋勖娱L了1.20倍，樺褐孔菌、靈芝和云芝分別延長了1.17倍、0.92倍和1.08倍?？梢姡覙浠ǖ目寡趸钚宰顝?。但這一結(jié)果與抗衰老活性的結(jié)果不一致。這可能是由于衰老是一個更為復(fù)雜的長時間過程，受影響的因素眾多，而抗氧化只是延緩衰老其中一個因素[16]。利用果蠅為模型和體外試驗分別證實樺褐孔菌菌絲體和子實體多糖具有抗氧化能力，與本文結(jié)果相一致[17-18]。本文以秀麗線蟲為生物模型分析食藥用菌的抗氧化活性，更直接有效地評價其抗氧化功能，為食藥用菌的開發(fā)提供有力的參考依據(jù)。

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Evaluation of Antioxidant Activities of Four Edible/Medicinal Mushroom Water Extracts Using Caenorhabditis elegans

Lin Qunying1, 2, Wu Liangliang1, 2, Zhang Fenglun1, Wu Suling1, Xiang Chunrong3, Sun Xiaoming1,2

( 1. Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants, Nanjing 210042, China; 2. Jiangsu Hongfeng Fruit and Vegetable Food Co., Ltd., Suqian 223700, China; 3. Zhenjiang City Dantu District Zhengdong Ecological Agriculture Development Center, Zhenjiang 212000, China)

Evaluation of antioxidant activities of four edible/medicinal mushroom water extracts was performed usingCaenorhabditiselegans. The results showed that the best concentration of water extact ofInonotusobliquuswas 0.2 mg/mL, with mean lifespan at 7.84 d, 1.17 folds longer than CK. The optimized concentrations were all at 1.0 mg/mL forGanodermalucidum,CoriolusversiclorandGrifolafrondosa. The mean lifespans were 8.84 d, 6.75 d and 5.98 d, respectively, 92%, 108% and 120% longer than CK. The findings could provide useful reference for further exploration of these mushrooms.

Inonotusobliquus;Ganodermalucidum;Coriolusversiclor;Grifolafrondosa; antioxidant

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.06.004

2016-05-12

“十二五”國家科技支撐計劃資助項目(2013BAD16B07)。

林群英(1979―)，女，博士，副研究員，研究方向：食用菌栽培與應(yīng)用研究。E-mail: linqunying1007@126.com

*通訊作者： 孫曉明(1964―)，男，碩士，研究員，研究方向：食用菌栽培與深加工。E-mail: sunxm64@163.com

S759.81

A

1006-9690(2016)06-0017-04