陳 童， 楊瑞梅， 單 虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室， 山東青島266109)

山東地區(qū)水貂腸炎病毒VP2基因的克隆和測序分析

陳 童， 楊瑞梅， 單 虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室， 山東青島266109)

本研究對濰坊、煙臺、威海和青島地區(qū)的疑似水貂病毒性腸炎病毒(MEV)糞便樣品進(jìn)行檢測，并在9份樣品QD1309、QD1407、WH1407、WH1408、WH1508、WH1509、WF1310、WF1408、YT1408中擴(kuò)增出VP2基因，和GenBank上已經(jīng)公布的4株MEV參考株的VP2基因進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示，13份MEV VP2基因的核苷酸和氨基酸均有較高的同源性，分別為97.5%～99.8%和96.9%～99.7%。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹表明，QD1309、YT1408、MEV-Beregovoj-Bincentr(MEV-BB)、MEV-e屬于同一個組群，不同毒株主要在第5、62、87、101、232、236、279、300、534位氨基酸發(fā)生了替換。本研究對水貂細(xì)小病毒流行株的主要衣殼蛋白VP2的編碼蛋白進(jìn)行遺傳變異分析，為更好地預(yù)防和控制貂源細(xì)小病毒提供基礎(chǔ)。

水貂腸炎病毒； VP2基因； 遺傳變異分析

水貂病毒性腸炎病毒(minkenteritisvirus，MEV)引起的主要臨床癥狀是劇烈腹瀉，腸道出血，腸內(nèi)容物呈煤焦油狀。MEV為單股負(fù)鏈DNA病毒，屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，基因組全長約為5 kb，其基因組含有2個開放閱讀框，其中一個調(diào)控病毒復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，另一個組呈衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2[1]。VP2蛋白是細(xì)小病毒的主要衣殼蛋白，其對病毒的宿主范圍、組織嗜性、抗原性、血凝性等起重要作用。該蛋白中某幾個甚至一個氨基酸殘基的突變，都可能導(dǎo)致整個病毒的生物學(xué)特性發(fā)生改變[2-3]。本研究旨在初步調(diào)查山東省主要地區(qū)的MEV流行情況,系統(tǒng)地分析MEV VP2基因的變異狀態(tài)并進(jìn)行分析，以探索山東省MEV分子流行病學(xué)趨勢[4]。

1 材料與方法

1.1 病料采集 病料取自濰坊、威海、煙臺、青島地區(qū)的某些水貂養(yǎng)殖場，臨床排血便，剖檢為腸內(nèi)容物呈煤焦油狀，小腸黏膜充血。

1.2 主要試劑 ExTaqDNA聚合酶、dNTP、DL-2 000 DNA Marker、DL-5000 DNA Marker、pMD18-T、DH5α、EcoRⅠ、SalⅠ限制性內(nèi)切酶，均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，購自O(shè)MEGA公司。

1.3 樣品處理 用棉棒蘸取腸內(nèi)容物加入PBS緩沖液中，顛倒混勻5～8次，7 000r/min離心10 min，取上清，-70 ℃反復(fù)凍融3次。12 000r/min離心10 min，取上清。

1.4 DNA的提取 取500 μL病毒上清液，加入500 μL DNAiso Reagant，顛倒混勻6～8次，靜置10 min。10 000 r/min離心10 min。取上清800 μL，加入400 μL無水乙醇，顛倒混勻6～8次，4 000 r/min離心2 min，棄上清。加入1 mL 75%乙醇，顛倒混勻6～8次，12 000 r/min離心5 min，棄上清。用吸水紙把底部的75%乙醇吸干，用20 μL ddH2O吹打混勻制備成PCR擴(kuò)增的模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 MEV的PCR鑒定 參考GenBank中公布的MEV NS基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計一對引物，上游引物為：5′-GTAAGCTTCCAGGAGACTTT-3′,下游引物為：5′-GTAAGCTTCGTCGTGTTCTT-3′，擴(kuò)增片段長度671 bp。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL：模板1.5 μL，10× ExTaqBuffer 2.5 μL,上下游引物各1 μL，dNTP 2 μL，ExTaq酶0.2 μL，滅菌純水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 變形40 s；52 ℃退火30 s。72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測樣品，同時設(shè)定陽、陰性對照，瓊脂糖凝膠電泳，驗證為陽性的樣品擴(kuò)增VP2基因全長。

1.6 VP2基因的克隆和變異分析 根據(jù)GenBank上公布的MEV VP2基因序列設(shè)計引物，上游引物為：5′-CGGGATCCATGAGTGATGGAGCAGTTCAA-3′，下游引物為：5′-CCGCTCGAGATATAATTTTCTAGGTGCT-3′ ，擴(kuò)增片段長度為1 755 bp。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s。72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸3 min。將陽性產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)，經(jīng)PCR和雙酶切(EcoRⅠ和SalⅠ)鑒定后送到北京華大基因科技服務(wù)有限公司測序。使用DNAStar和Mega 5.0軟件進(jìn)行同源性分析及構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR鑒定 取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段約為671 bp，其大小與預(yù)期相符表明檢測的病毒為MEV(圖1)。

圖1 PCR鑒定結(jié)果

M：DL-2 000 DNA Marker；1：QD1309；2：QD1407；3：WH1407；4：WH1408；5：WF1408 ；6：YT1408

2.2 VP2基因擴(kuò)增和雙酶切鑒定 擴(kuò)增VP2基因，瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)與預(yù)期大小一致目的條帶，即1 755 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化后，菌液PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒，用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定大小正確，即2 694 bp 的載體帶和1 755 bp的目的條帶(圖2)。

圖2 陽性質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

M：DL-5 000 DNA Marker；1：陽性質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 MEV VP2基因核苷酸和氨基酸同源性分析 測序結(jié)果表明，9份樣品VP2序列全長為1 755 bp，編碼548個氨基酸。應(yīng)用DNAStar分析軟件，將其與GenBank上公布的4株國內(nèi)外MEV VP2基因進(jìn)行序列比較，發(fā)現(xiàn)13份樣品MEV VP2基因的核苷酸和氨基酸均有較高的同源性，分別為97.5%～99.8%和96.9%～99.7%，遺傳變異率較低。見圖3和圖4。

2.4 MEV VP2基因進(jìn)化分析 用DNAStar軟件對13株MEV VP2基因繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖5。從圖上可以看出，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹將13份MEV VP2基因分為兩個組群，第1個族群以樣品WH1407為代表，還包括樣品WF1310、WH1508、WH1408、WH1407、WH1509、QD1407、WF1408、JL2010和MEV-vaccine(MEV-vac)。第二個族群以QD1309為代表，還包括YT1408、MEV-BB、MEV-e。其中，組群一中的9株MEV又分為兩個亞群，WF1310、WH1508、WH1408、WH1407、Jl2010屬于第一亞群，WH1509、QD1407、WF1408和MEV-vac屬于第二亞群.

圖3 MEV VP2基因核苷酸序列分析

圖4 MEV VP2基因氨基酸序列分析

圖5 MEV VP2基因進(jìn)化樹分析

2.5 9株MEV VP2蛋白的氨基酸變異分析 本研究通過對比13份MEV VP2蛋白的氨基酸序列表明，MEV VP2的第80、93、103、323、564、568位氨基酸是決定宿主范圍的關(guān)鍵氨基酸，相對比較保守；不同毒株主要在第5、62、87、101、232、236、279、300、534位氨基酸發(fā)生了替換，QD1309在第5、87、279、534位分別發(fā)生了A→T、M→T、W→R、V→I替換,QD1407分別在第236、300、534位發(fā)生了S→T、I→A、V→I替換，WH1408分別在第62、101、232、236、300位發(fā)生了T→A、T→I、V→I、S→T、V→I替換，WH509和WF1408在第5位點發(fā)生了A→T替換。 WF1310分別在第62、232、236、300位點發(fā)生了T→A、V→I、S→T、I→V替換。YT1408分別在第5、87、279位發(fā)生了A→T、M→T、W→R替換。

3 討論

通過對山東地區(qū)的9份MEV樣品和國內(nèi)外4份樣品MEV VP2基因進(jìn)行同源性分析表明，核苷酸和氨基酸具有很高的同源性，分別為97.5%～99.8%和96.9%～99.7%。說明山東地區(qū)的MEV VP2基因遺傳變異率較低。山東地區(qū)的9份MEV樣品和目前國內(nèi)使用的疫苗毒株MEV-vac的核苷酸同源性為99.0%～99.5%，氨基酸同源性為98.6%～99.5%；通過進(jìn)化樹結(jié)果表明，9份MEV 樣品屬于兩個組群，彼此都有一定的親緣性。山東地區(qū)大部分MEV和與疫苗毒株屬于同一個群組，說明分離馴化于20年以前的疫苗毒株仍然適用于目前山東地區(qū)水貂病毒性腸炎的防治。通過 13株 MEV 氨基酸序列比較分析，不同樣品主要在第5、62、87、101、232、236、279、300、534位氨基酸發(fā)生了替換，其中62、87、101、279、534位是在山東地區(qū)發(fā)現(xiàn)的新的變異位點。其中，QD1309、WH1509、WF1408、YT1408在第5位發(fā)生了A→T的替換，QD1407、WH1408、WF1310都在第236位發(fā)生了S→T的替換，是否發(fā)生生物學(xué)特性變化需要進(jìn)一步研究。針對山東地區(qū)的MEV分子流行病學(xué)調(diào)查研究，對于控制該病在山東地區(qū)的流行就顯得非常有必要。本研究對發(fā)現(xiàn)的9份MEV樣和GenBank上公布的4株MEV參考株VP2基因序列進(jìn)行分析對比，對山東地區(qū)MEV的變異情況有了初步了解，可為山東地區(qū)MEV的診斷及防控提供參考。

[1] Reed A P,Jones E V,Miller T J.Nucleotied sequence and genome organization of canine parvovirus[J].J Virol，1988，62(1):266-276.

[2] Schofield F W.virus enteritis in mink[J].North Am Vet,1949,30;651-654.

[3] Truyen U,Agbandje M,Parrish C R.Characterization of the feline host range and a specific epitope of feline panleukopenia virus[J].Virology,1994,200(2)：494-503.

[4] 楊玲，徐向明，殷俊,等.犬細(xì)小病毒病毒分離株 VP2基因的克隆與序列分析[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報，2002，2(3)：12-13.

[5] 閆喜軍，張海玲，柴秀麗,等.水貂腸炎細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因的克隆和序列分析[J].特產(chǎn)研究，2011(4):1-3.

Cloning and Sequencing of VP2Gene of Mink Enteritis Parvovirus in SHAN DONG Province

CHEN Tong ， YANG Rui-mei , SHAN Hu

(Qingdao Agricultural University,Key laboratory Preventive veterinary medicine in Shandong province,Qingdao 266109,China)

We tested samples of suspected parvovirus feces in Weifang,Weihai,Yantai,and Qingdao and got 9 VP2genes from QD1309,QD1407,WH1407,WH1408,WH1508,WH1509,WF1310,WF1408,and YT1408.We compared them with 4 MEV VP2genes out or in our country from GenBank.Results showed that the 13 MEV VP2genes had high homology of nucleotide and amino acids,which were 97.5%～99.8% and 96.9%～99.7%.Phylogenetic analysis showed that QD1309,YT1408,MEV-BB,and MEV-e belonged to the same group,and the difference for different strains were mainly at the site of 5,62,87,101,232,236,279,300,and 534 amino acid.

mink enteritis virus(MEV);VP2gene; genetic variation analysis

s:SHAN Hu;YANG Rui-mei

2015-12-25

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(2012FY111000)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303042)；山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(2014ZZCX07105);山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題;山東省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目

陳童(1983-)，男，碩士，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究，E-mail:1141549063@qq.com

單虎，E-mail: shanhu67@163.com; 楊瑞梅，E-mail: yrm.cc@163.com

Q78

A

0529-6005(2016)12-0028-03