史一珺， 宋曉明， 于忠偉， 張洪亮， 焦緒娜， 黃 娟， 單 虎

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室， 山東青島266109；2.乳山市午極鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，山東乳山264503；3.煙臺市飼料監(jiān)察所， 山東煙臺264008)

不同宿主來源犬瘟熱病毒H基因的克隆測序與分析

史一珺1， 宋曉明2， 于忠偉3， 張洪亮1， 焦緒娜1， 黃 娟1， 單 虎1

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室， 山東青島266109；2.乳山市午極鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，山東乳山264503；3.煙臺市飼料監(jiān)察所， 山東煙臺264008)

應(yīng)用RT-PCR的方法從2013-2015年來自我國部分地區(qū)20份犬、貂、狐和貉源犬瘟熱陽性病料中克隆得到犬瘟熱病毒(CDV)H基因。序列分析結(jié)果表明，20株CDV的H基因核苷酸與推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為:90.6%～100%和90.5%～100%；相應(yīng)地，與CDV3、Onderstepoort等傳統(tǒng)疫苗株相比，其同源性分為90.4%～99.9%和89.0%～99.8%?；贑DV H基因推導(dǎo)氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果顯示，除TS1510屬于Amecica-1型外，其余全部為Asia-1型。表明Asia-1型犬瘟熱病毒仍為目前一些地區(qū)流行基因型，弱毒感染動物也可使之產(chǎn)生典型犬瘟熱癥狀。

犬瘟熱病毒； H基因； 同源性比較； 進(jìn)化樹分析

犬瘟熱(Canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(CaninedistemperVirus，CDV)引起的一種發(fā)病急、傳播速度快，可導(dǎo)致犬、狐、貉和貂等多種食肉目動物發(fā)病，且接觸性極高的傳染病[1-2]。CDV易與其他細(xì)菌、病毒以混合感染或繼發(fā)感染的方式危害動物，致死率最高可達(dá)80%。CDV對不同宿主動物的跨種屬感染，是2016年來許多研究者關(guān)注的重點[3-5]。

CDV基因組主要編碼N、P、F、M、H、L六個蛋白，其中H基因表達(dá)的血凝素蛋白會影響病毒與SLAM受體的識別與結(jié)合，且H蛋白的基因、抗原變化頻率最高，被認(rèn)為是導(dǎo)致CDV不斷變異的重要因素，常用來評估CDV的變異情況[6-8]。本試驗以實驗室收集的出現(xiàn)典型犬瘟熱癥狀的患病動物病料為模板，對得到的H基因進(jìn)行分析，來探究一些地區(qū)近年來CDV毒株之間H基因遺傳特征差異及病毒在宿主中進(jìn)化的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 病料 臨床樣品取自山東、河北一些地區(qū)毛皮動物養(yǎng)殖場及動物醫(yī)院送檢的臨床癥狀明顯的犬瘟熱陽性病例。

1.2 試劑 RNA提取試劑盒，購自Bioflux公司；PrimeScriptTMcDNA Synthesis Kit、ExTaqDNA聚合酶、 pMD18-T載體、DH5α細(xì)胞、限制性內(nèi)切酶，均購自寶生物工程(大連)有限公司；膠回收、質(zhì)粒提取試劑盒，均購自O(shè)mega公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。1.3 病毒RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及H基因的克隆 用RNA提取試劑盒提取犬瘟熱陽性病料中的病毒RNA，用特異性引物(序列：CDV-H-F 5’-AACAATGCTCTCCTACCAAGA-3’，CDV-H-R 5’-AATGCTAGAGATGGTTTAATT-3’)反轉(zhuǎn)錄合成病毒cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 10.5 μL，5xRT Buffer 4 μL，dNTP(10mmol/L)2 μL，CDV-H-F (10 pmol/μL)1 μL，CDV-H-R(10 pmol/μL)1 μL，M-MLV(10 U/μL)1 μL， RRI(40 U/μL)0.5 μL，42 ℃水浴1 h后70 ℃ 15 min。以cDNA作為模板參照文獻(xiàn)[3]中方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物后克隆至pMD18-T載體。各樣品選取最少3個酶切鑒定正確的陽性克隆，送至北京華大基因科技服務(wù)有限公司測序，結(jié)果與GenBank上已公開的CDV H基因序列的ORF進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 H基因的克隆與酶切鑒定 將得到的H基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，并克隆至pMD18-T 載體，用BamHⅠ和HindⅢ對陽性質(zhì)粒pMD18-T-H進(jìn)行雙酶切。結(jié)果如圖1，得到的兩條帶(分別2 690 bp和1 921 bp左右)與預(yù)期值相符。測序結(jié)果表明，各樣品H基因被成功克隆至pMD18-T載體中。

圖1 重組質(zhì)粒pMD18-T-H酶切鑒定結(jié)果

M：DL-5 000； 1-2：pMD18-T-H雙酶切后； 3：質(zhì)粒對照

2.2 H基因同源性分析 序列分析顯示，20個CDV H基因的ORF均為1 824 bp，其核苷酸與推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為90.6%～100%(CY1505與LS1507、WD1303與WD1304、LL1308與ZC1302 CDV H基因的核苷酸序列完全相同)和90.5%～100%，相應(yīng)地，與CDV3、Onderstepoort等傳統(tǒng)疫苗株相比，它們的同源性為90.4%～99.9%和89.0%～99.8%。其中TS1510與America-1型毒株核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列同源性較高，分別為97.0%～99.9%和95.1%～99.8%。

2.3 H基因推導(dǎo)的氨基酸的序列分析 將測得的20個CDV H基因推導(dǎo)的氨基酸序列與國內(nèi)部分流行株、疫苗株進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，其中LL1309、RC1508、WD1309、ZC1306、WD1508 H基因推導(dǎo)氨基酸均存在10處潛在N-糖基化位點，分別位在第19，149，309，391，422，456，542，584，587位和603位，與SD(13)7相同。TS1510毒株有7個潛在N-糖基化位點，與CDV3株相同，是首次發(fā)現(xiàn)H基因有7個潛在N-糖基化位點的貉源CDV。

2.4 CDV H基因的遺傳進(jìn)化分析 將測得的20個H基因序列和國內(nèi)外CDV毒株核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖2，其中19個在同一個分支上，屬于Asia-1型且親緣關(guān)系較近；而TS1510屬于America-1型，與其他19株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 基于CDV H基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹

(▲：本文所測得的CDV H基因)

3 討論

如圖2可見，CDV可分為Asia-1、Asia-2、Asia-3、Asia-4[8]、America-2、Europe-1、Europe-2、Arctic和America-1(Vaccine)9個基因型[10]。CDV基因型的差異與病毒的分布直接相關(guān)，且其毒力會隨糖基化位點數(shù)的減少而減弱[11]。本文測得來自山東19份病料中的CDV H基因序列均為Asia-1型，可判斷為野毒感染動物而發(fā)生嚴(yán)重犬瘟熱；來自河北的TS1510為America-1型，是首次發(fā)現(xiàn)的弱毒感染致貉子發(fā)病的犬瘟熱病例。CDV與SLAM受體結(jié)合的重要區(qū)域包含H蛋白第542～544位的氨基酸[12]，它的突變會影響病毒入侵細(xì)胞、致病性與抗原蛋白表達(dá)水平；本文所測得序列中有5份樣品的H基因序列存在10個潛在N-糖基化位點，增加的位點正處于第542～544位，這或許導(dǎo)致CDV H蛋白的中和表位改變，使病毒對疫苗株誘導(dǎo)的中和抗體的中和作用產(chǎn)生逃避，從而使疫苗免疫失敗。

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Genetic analysis of haemagglutinin gene of canine distemper virus from Different hosts

SHI Yi-jun1, SONG Xiao-ming2, YU Zhong-wei3, ZHANG Hong-liang1, JIAO Xu-na1, HUANG Juan1, SHAN Hu1

(1.Shandong Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109,China; 2.Animal Husbandry and Veterinary Station of WUJi town,Rushan 264503, China; 3.Inspectorate of feed,Yantai 264008,China)

Twenty field CDV strains were collected from infected dog, mink, fox, and raccoon dog in different places of China in 2013～2015. The H genes were cloned and sequenced. Sequence analysis showed that the similarity of the measured CDV H gene nucleotides and deduced amino acid sequences were as follows: 90.6% to 100% and 90.5% to 100%, corresponding with CDV3. When compared with onderstepoort strains , the similarity for nucleotides and deduced amino acid sequence was 90.4% to 99.9% and 89.0% to 99.8%. Phylogenetic analysis showed that these strains belonged to Asia-1 genotype except TS1510, which belonged to Amecica-1 type. Our findings indicates that Asia-1 type CDV is still the prevalent genotype in some place.

canine distemper virus; H gene; homology; phylogenetic analysis

s:SHAN Hu; HUANG Juan

2016-01-18

史一珺(1989-)，女，碩士，從事動物傳染病防治及生物制品學(xué)的研究，E-mail：xifan_1989@sina.com

單虎，E-mail：shanhu67@163.com；黃娟，E-mail：happyhj888@163.com

S852.65+9.5

A

0529-6005(2016)12-0031-03