孫曉霞 ， 藺文成 ， 李曉齊 ， 曹 紅 ， 王永強 ， 鄭世軍

(中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院農業(yè)生物技術國家重點實驗室 ， 北京海淀100193)

傳染性囊病病毒VP5 蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

孫曉霞 ， 藺文成 ， 李曉齊 ， 曹 紅 ， 王永強 ， 鄭世軍

(中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院農業(yè)生物技術國家重點實驗室 ， 北京海淀100193)

傳染性囊病病毒(InfectiousBursalDiseaseVirus，IBDV)的非結構蛋白VP5 在病毒感染細胞的不同階段發(fā)揮著抑制或誘導細胞凋亡的重要作用。為制備抗血清I 型IBDV VP5 蛋白的單克隆抗體，取經(jīng)His-VP5 蛋白免疫4 次的BALB/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞(SP2/0)進行融合，3次亞克隆后獲得2株能穩(wěn)定分泌VP5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為5EC7和2BE5。經(jīng)間接ELISA 測定，以上2株單抗的親和力解離常數(shù)分別為1.14×10-10和4.87×10-10，亞類分別為IgG2a 和IgG1。通過Western Blot 和間接免疫熒光試驗檢測，2 株單抗均能識別IBDV 感染DF-1 細胞后產(chǎn)生的VP5 蛋白。Western Blot 試驗表明，2 株單抗識別的抗原表位區(qū)域為VP5 N-端的1～10 aa。該單抗為研究血清I型IBDV VP5蛋白的生物學功能及病毒致病機理奠定基礎。

傳染性囊病病毒 ； VP5蛋白 ； 原核表達 ； 單克隆抗體

傳染性囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是一種以危害雛雞為主的急性、高度傳染性的免疫抑制性疾病，其病原為傳染性囊病病毒(IBDV)。IBDV 能損傷B 淋巴細胞前體，誘導其凋亡，抑制機體體液免疫應答，從而誘導機體產(chǎn)生免疫抑制[1]，使病禽易繼發(fā)感染其他病原，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。

IBDV 屬于雙RNA 病毒科禽雙RNA 病毒屬，病毒基因組由A 和B 兩個片段的雙股RNA 組成[2]。A 片段包括兩個開放性閱讀框(Open reading frame，ORFs)，分別編碼病毒非結構蛋白VP5和多聚蛋白pVP2-VP4-VP3，pVP2-VP4-VP3 前體蛋白可被VP4 蛋白水解酶水解為病毒蛋白VP2、VP3 和VP4[3]。B 片段編碼VP1 蛋白。VP5 是病毒的非結構蛋白，不參與病毒粒子的組成[4]。在IBDV 感染的早期，VP5 蛋白可與PI3K 的p85α亞基結合抑制Akt 的激活，從而抑制細胞凋亡的發(fā)生，該作用對于病毒的增殖具有重要意義[5]。而在IBDV 感染晚期，VP5蛋白與電壓依賴性陰離子通道2(VDAC2)結合，促進細胞色素c等促凋亡因子的釋放，激活內源性細胞凋亡通路，促進細胞凋亡和病毒釋放[6]。本研究制備了能穩(wěn)定分泌抗血清I 型IBDV VP5 蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞系，為進一步研究VP5 蛋白在IBDV 感染過程中的功能和IBDV的致病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒、質粒、菌株、細胞與實驗動物 傳染性囊病病毒IBDV Lx 毒株由北京市農林科學院劉爵研究員惠贈。pET-28a-VP5 重組質粒、pGEX-6p-1 表達質粒、大腸桿菌E.coli DH5α和E.coli BL21、骨髓瘤細胞(SP2/0)、DF-1 細胞、HEK293T 細胞以及His-VP5 蛋白由本實驗室保存。4～8 周齡雌性BALB/c 小鼠，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM 高糖培養(yǎng)基，購自Gibco 公司；胎牛血清，購自HyClone 公司；HRP 標記山羊抗小鼠IgG 和FITC 標記兔抗小鼠IgG，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；限制性內切酶、LA Taq 酶和DNA 快速連接試劑盒，購自TaKaRa 公司(中國大連)；高純度小量快速提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司；HAT、HT、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents，購自SIGMA 公司(美國)；96 孔板酶標儀，購自TECAN公司。

1.3 抗VP5 單克隆抗體的制備 小鼠免疫程序按照羅正等所述方法進行[7]。細胞融合和陽性雜交瘤細胞的篩選參照Current Protocol in Immunology[8]的方法進行。腹水的制備純化參考文獻[8]所述方法進行。

1.4 單抗亞類及表位識別鑒定 亞類鑒定按照SIGMA 公司的Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 試劑盒說明書進行。將實驗室保存的VP5 的8 個截短表達質粒分別轉染HEK293T 細胞，收集細胞蛋白，利用Western Blot 方法檢測單克隆抗體對截短體的識別情況。

1.5 單抗親和力的測定 以1 μg/mL 的GST-VP5融合蛋白包被酶標板，分別以2 株純化后的單抗為一抗，2 株單抗的初始濃度均為2 μg/mL，依次進行倍比稀釋，將其加入酶標板后按照常規(guī)ELISA 操作進行，測定OD450 nm 值。試驗數(shù)據(jù)的處理按照文獻[9]所述方法。

1.6 單抗特異性檢測及對天然感染狀態(tài)下VP5蛋白的識別以實驗室保存的病毒感染后的細胞蛋白為抗原，分別以5EC7 和2BE5 株單抗做一抗，以Western Blot 法檢測單抗對各病毒蛋白的識別情況。

將DF-1 細胞接種于24 孔板，待細胞密度達到80%時，用IBDV 感染DF-1細胞，24 h后棄去病毒液，4%多聚甲醛固定，0.2% Triton X-100 進行透化，1% BSA封閉，抗VP5單克隆抗體作為一抗，F(xiàn)ITC標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，經(jīng)反應、洗滌后，熒光顯微鏡下進行檢測。

2 結果

2.1 單克隆抗體亞類及親和力的鑒定 經(jīng)鑒定，5EC7 株和2BE5 株單抗重鏈類型分別為IgG2a 和IgG1。如圖1所示，5EC7和2BE5的親和力解離常數(shù)(Kd)分別為1.14×10-10和4.87×10-10，均為高親和力抗體。

2.2 單抗特異性檢測及對天然感染狀態(tài)下VP5蛋白的識別 如圖2A，2株單抗只識別IBDV感染細胞后產(chǎn)生的VP5 蛋白，不能識別其他病毒蛋白。如圖2B 和2C，間接免疫熒光試驗表明，2 株單克隆抗體能識別IBDV感染DF-1細胞后產(chǎn)生的VP5 蛋白。以上結果表明，2 株單抗均為針對IB.DV VP5蛋白的特異性抗體。

圖1 單抗親和力測定

圖2 單抗特異性檢測

A：Western Blot檢測單抗識別IBDV感染產(chǎn)生的VP5蛋白； B：1～6：IBDV感染組； 1：抗IBDV 陽性血清，2：SPF雞陰性血清，3：IgG1同型對照，4：IgG2a同型對照，5-6：5EC7和2BE5株單抗； C：1～4：未感染組；1：抗IBDV 陽性血清，2：SPF雞陰性血清，3～4：5EC7和2BE5株單抗

單克隆抗體抗原識別區(qū)域的鑒定：如圖3 所示，2株單抗的識別位點均位于1～50位氨基酸之間；Western Blot 進一步分析表明1 株單抗的識別位點均位于1～10位氨基酸之間，如圖4所示。

圖3 單抗抗原識別區(qū)分析(I)

圖4 單抗抗原識別區(qū)分析(II)

3 討論

IBD 主要侵害雞的體液免疫中樞器官腔上囊等淋巴組織，因此危害不僅表現(xiàn)在疫病本身，更會引起雞體的免疫機能障礙，影響各種疫苗的免疫應答，甚至導致免疫失敗。由于免疫抑制，引起繼發(fā)和并發(fā)其他疾病，致死率升高，給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴重災害[10]。非結構蛋白VP5 在感染的不同階段發(fā)揮著抑制或誘導細胞凋亡的作用對病毒的增殖和擴散具有重要意義。

本研究獲得的2 株不同亞型的雜交瘤細胞株，其分泌的單抗可有效識別血清I 型IBDV 感染細胞后表達的VP5 蛋白。利用His-VP5 蛋白免疫BALB/c 小鼠，用GST-VP5 蛋白作為ELISA 包被抗原對雜交瘤細胞株進行篩選，可有效防止篩選到抗His 蛋白的雜交瘤細胞株。本研究用于篩選的GST-VP5 蛋白為可溶性融合蛋白，其大小約為43 kDa，但純化后有4 個主條帶，經(jīng)Western Blot 鑒定，4 個條帶均可被GST 單抗識別，這可能是由于融合蛋白斷裂造成的。巨噬細胞和胸腺細胞能分泌有促進雜交瘤細胞生長的IL-6，而傳統(tǒng)的飼養(yǎng)層細胞(即小鼠腹腔巨噬細胞)易污染雜交瘤，本研究使用4～6 周齡未經(jīng)免疫的BALB/c 小鼠的胸腺，制備無菌細胞懸液培養(yǎng)雜交瘤細胞代替?zhèn)鹘y(tǒng)的飼養(yǎng)層細胞[9，11]，取得了較好的效果。

秦立廷等制備了針對血清II 型IBDV VP5 的單克隆抗體[12]，但并不能識別危害養(yǎng)禽業(yè)的血清I 型的VP5 蛋白；張寧等制備了抗血清I 型IBDVVP5 的單克隆抗體[13]，但其抗原識別區(qū)并不明確。本研究制備的針對血清I 型IBDV VP5 蛋白的單克隆抗體，抗原識別區(qū)位于1～10位氨基酸，并且可有效識別IBDV 感染細胞12 h～36 h 表達的VP5蛋白。有助于深入研究非結構蛋白VP5的功能，為疫苗研發(fā)和IBDV 致病機理的探索奠定基礎。

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Development and identification of monoclonal antibodies against Infectious Bursal Disease Virus(IBDV)VP5

SUN Xiao-xia ， LIN Wen-cheng ， LI Xiao-qi ， CAO Hong ，WANG Yong-qiang ， ZHENG Shi-jun

(State Key Laboratory of Agrobiotechnology and College of Veterinary Medicine China Agricultural University，Beijing 100193，China)

VP5 is a nonstructural protein of IBDV and plays an important role in inducing or inhibiting apoptosis during IBDV infection.In order to develop monoclonal antibodies(McAbs)against IBDV VP5，we vaccinated BALB/c mice with His-VP5 protein. Hybridomas were generated by fusing mouse myeloma cells SP2/0 with the splenocytes from the immunized mice.After screening and subcloning，we obtained 2 hybridoma cell lines(5EC7，and 2BE5)that stably secreted McAbs against the IBDV VP5.The dissociation constants(Kds)of these McAbs were 1.14×10-10and 4.87×10-10，respectively.The isotypes of these McAbs were IgG2a and IgG1.These McAbs specially bound to VP5 in IBDV-infected DF-1 cells as demonstrated by Western Blot and indirect immunofluorescence assay.The recognition regions of these McAbs were all located between 1to 10 aa of VP5 as demonstrated by Western Blot.These McAbs will be useful in analyzing the biological activities of VP5and the mechanisms of IBDV infection.

Infectious Bursal Disease Virus ； VP5 ； prokaryotic expression ； monoclonal antibody

ZHENG Shi-jun

2015-06-03

國家自然科學基金(31272543)；現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金(NYCYTX-41)

孫曉霞(1990-)，女，碩士生，主要從事病原與宿主相互作用機制的研究，E-mail：sxxburning@163.com

鄭世軍，E-mail：sjzheng@cau.edu.cn

S852.465+9.4

A

0529-6005(2016)12-0010-04