張美曦， 隋 欣，2， 劉超男， 呂曉萍， 鄭世民， 高雪麗

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省雞西市動物疫病預(yù)防與控制中心， 黑龍江雞西158200)

雙歧桿菌對雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量及黏蛋白2含量的影響

張美曦1， 隋 欣1，2， 劉超男1， 呂曉萍1， 鄭世民1， 高雪麗1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省雞西市動物疫病預(yù)防與控制中心， 黑龍江雞西158200)

本試驗應(yīng)用過碘酸雪夫染色法、熒光定量PCR、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗對飼喂雙歧桿菌后雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量、MUC2 mRNA表達量及腸液黏蛋白2(MUC2)含量變化進行研究，揭示雙歧桿菌對雛雞局部黏膜免疫的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂雙歧桿菌后1～18 d雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量、MUC2 mRNA表達量及腸液MUC2含量不同程度高于對照雛雞。其中，回腸杯狀細(xì)胞數(shù)量、MUC2 mRNA及腸液MUC2含量于飼喂后1～4 d明顯高于對照雛雞(P<0.05或P<0.01)；結(jié)直腸MUC2 mRNA于飼喂后1～7 d極顯著高于對照雛雞(P<0.01)。結(jié)果表明，雙歧桿菌能增加雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量，提高MUC2的分泌量，增強雛雞腸道黏膜免疫功能。

雙歧桿菌； 雛雞； 腸道； 杯狀細(xì)胞； 黏蛋白2

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是動物腸道的優(yōu)勢菌群之一，經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)：該菌有提高機體免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗腫瘤、降膽固醇等作用，且憑借無毒、無害、無殘留、無污染等優(yōu)勢，現(xiàn)已用作飼料添加劑服務(wù)于畜牧業(yè)。王雪飛[1]研究發(fā)現(xiàn)，苦豆籽粕-雙歧桿菌合生元可以提高肉仔雞免疫器官指數(shù)、血清IFN-γ含量及NK細(xì)胞活性，從而增強肉仔雞的免疫功能；邱春雷[2]等發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌活菌制劑治療潰瘍性結(jié)腸炎療效顯著。黏蛋白2(Mucin 2)是腸道杯狀細(xì)胞分泌的一種黏蛋白[3]，是腸道黏液的主要成分，有潤滑腸道、抵抗機械性破壞及防止腸內(nèi)有害物質(zhì)侵襲等作用，在腸道黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。目前，對雙歧桿菌的研究主要集中在腸道的分布及營養(yǎng)作用，而對其能否通過增加腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量及MUC2表達量，加強雛雞局部黏膜免疫功能沒有較系統(tǒng)的研究。本試驗通過對飼喂雙歧桿菌后雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量及MUC2含量的動態(tài)變化進行研究，旨在探討雙歧桿菌提高雛雞腸道黏膜免疫的機制，為雙歧桿菌在禽業(yè)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 1日齡海藍(lán)白雛雞50只，雌雄各半，購自哈爾濱某孵化場。經(jīng)雞馬立克病、雞傳染性腔上囊病、雞傳染性喉氣管炎和雞新城疫等抗體檢測，結(jié)果均呈陰性。

1.2 菌種 雙歧桿菌BB-12，購自丹麥科漢森有限公司。

1.3 主要試劑 高碘酸，堿性品紅，偏重亞硫酸鈉，甲基綠，活性炭；Oligo(dT)15，北京天根生物科技有限公司；M-MLV Reverse Transcriptase，美國Promega公司；SYBR?Premix ExTaqT-MII，東洋紡(上海)生物科技有限公司；MUC2酶聯(lián)免疫分析試劑盒，上海瑞齊生物科技有限公司。

1.4 實驗動物分組及處理 將50只雛雞隨機分為對照組(簡稱C組)、雙歧桿菌組(簡稱B組)，其中，C組雛雞每日灌服一定劑量的空微膠囊，1次/d，連續(xù)灌服3 d；B組雛雞每日灌服一定劑量的雙歧桿菌微膠囊，1次/d，每次4×109CFU/mL，連續(xù)灌服3 d。兩組雛雞分別于灌服微膠囊3 d后第1、4、7、10、18天隨機抽取5只，心臟采血處死，快速采取回腸、盲腸、結(jié)直腸及相應(yīng)腸段的腸液，低溫保存，備檢。1.5 腸道杯狀細(xì)胞統(tǒng)計 對雛雞腸道組織進行過碘酸雪夫染色(PAS染色)，觀察紅色深染的杯狀細(xì)胞，統(tǒng)計6個腸絨毛上的杯狀細(xì)胞。計數(shù)時選取的絨毛大小應(yīng)基本一致。

1.6 腸組織MUC2 mRNA表達量測定 應(yīng)用本實驗室已建立的雛雞MUC2 mRNA表達實時熒光定量PCR檢測方法[4]檢測腸組織MUC2 mRNA表達量。

1.7 腸液MUC2含量測定 按照MUC2酶聯(lián)免疫分析試劑盒提供方法檢測腸液MUC2含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，得出結(jié)論。

2 結(jié)果

2.1 腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量變化 應(yīng)用雙歧桿菌后1～18 d，雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量不同程度高于對照雛雞?；啬c杯狀細(xì)胞數(shù)量于1～4 d顯著高于對照雛雞(P<0.05)；結(jié)直腸杯狀細(xì)胞數(shù)量于第1天顯著高于對照雛雞(P<0.05)；盲腸杯狀細(xì)胞數(shù)量高于對照雛雞，但無統(tǒng)計學(xué)差異。如圖1,2(見中插彩版)。

圖1 應(yīng)用雙歧桿菌后雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量變化

*：有顯著性差異；**：有極顯著性差異；無*號：無顯著性差異，下表同

2.2 腸組織MUC2 mRNA表達變化 應(yīng)用雙歧桿菌后1～18 d，腸道MUC2 mRNA表達不同程度的高于對照雛雞。其中，回腸MUC2 mRNA于1～4 d顯著高于對照雛雞(P<0.01或P<0.05)；盲腸MUC2 mRNA于第1天顯著高于對照雛雞(P<0.05)；結(jié)直腸MUC2 mRNA于1～7 d極顯著高于對照雛雞(P<0.01)。如圖3。

2.3 腸液MUC2含量變化 應(yīng)用雙歧桿菌后1～18 d，雛雞腸液MUC2含量不同程度高于對照雛雞。其中，回腸腸液MUC2含量于1～4 d顯著高于對照雛雞(P<0.05或P<0.01)；結(jié)直腸腸液MUC2含量于第1天顯著高于對照雛雞(P<0.05)；盲腸腸液MUC2含量高于對照雛雞，但無統(tǒng)計學(xué)差異。如圖4。

圖3 應(yīng)用雙歧桿菌后腸組織MUC 2 mRNA表達變化

圖4 應(yīng)用雙歧桿菌后雛雞腸液MUC 2含量變化

3 討論

動物消化道黏膜面積較大，不僅是消化吸收的重要場所，也是體內(nèi)最大的外周免疫組織，是黏膜免疫系統(tǒng)重要組成部分。研究表明，禽類95%以上的感染發(fā)生在黏膜或由黏膜入侵，因此增強禽類局部黏膜免疫功能具有重要意義[5]。正常情況下，雙歧桿菌是腸道正常菌群中的優(yōu)勢菌群，可以通過占位作用、營養(yǎng)競爭以及分泌代謝產(chǎn)物和細(xì)菌素抑制病原菌生長，維持腸道菌群平衡，增強機體免疫功能[6]。腸上皮細(xì)胞、腸道內(nèi)的微生物群落及腸道黏液在腸道內(nèi)壁形成一層保護膜，在局部黏膜免疫中發(fā)揮重要作用，其中腸道黏液的主要成分是MUC2。

MUC2是腸道杯狀細(xì)胞分泌的一種分泌型黏蛋白。Juxing Chen[7]等發(fā)現(xiàn)，在腸屏障功能受損的肉雞體內(nèi)MUC2表達量降低；Chao[8]等研究表明，MUC2在黏液性結(jié)直腸癌的表達與局部浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)。這些研究表明，MUC2不僅與腸道的屏障作用相關(guān)，與腫瘤發(fā)生也密切相關(guān)。本試驗通過檢測飼喂雙歧桿菌后雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量及MUC2含量的變化，探討雙歧桿菌對雛雞腸道的營養(yǎng)作用及其對MUC2分泌的影響。

3.1 雙歧桿菌對雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響 雙歧桿菌可合成多種消化酶和維生素，促進氨基酸、脂類和維生素的代謝，促進蛋白吸收；雙歧桿菌產(chǎn)酸可使環(huán)境pH值下降，有利于二價鐵、維生素D及鈣的吸收。本試驗發(fā)現(xiàn)，雛雞飼喂雙歧桿菌后1～18 d，腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量不同程度高于對照雛雞，回腸及結(jié)直腸杯狀細(xì)胞數(shù)量分別于1～4 d、第1天明顯高于對照雛雞(P<0.05)。證明雙歧桿菌可提高雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量。王文利[9]等研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以使肉雞小腸絨毛增長，隱窩加深，黏膜增厚，通過改善小腸黏膜的結(jié)構(gòu)增強小腸的消化功能；劉克琳[10]等研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用益生菌生態(tài)制劑后，鯉魚前腸黏膜褶皺增多，微絨毛長而密，腸吸收面積增大，同時益生菌生態(tài)制劑也可促進鯉魚生長，增強免疫。以上試驗結(jié)果均證明益生菌可以改善腸黏膜的結(jié)構(gòu)并使機體向有益的方向發(fā)展。本試驗證實，雙歧桿菌可使雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量增加。

3.2 雙歧桿菌對雛雞腸道MUC2分泌量的影響 MUC2對腸黏膜有直接保護作用，當(dāng)其質(zhì)和量發(fā)生變化時，腸道屏障功能受損，通透性增高，腸腔內(nèi)抗原、內(nèi)毒素等促炎癥物質(zhì)進入腸黏膜固有層，誘發(fā)免疫反應(yīng)[11]。試驗發(fā)現(xiàn)，雛雞應(yīng)用雙歧桿菌后1～18 d，腸道MUC2含量不同程度高于對照雛雞。其中，腸道MUC2 mRNA表達量于飼喂雙歧桿菌后1～4 d、1 d及1～7 d顯著高于對照雛雞(P<0.01或P<0.05)；回腸腸液MUC2含量于飼喂雙歧桿菌后1～4 d顯著高于對照雛雞(P<0.05或P<0.01)。以上結(jié)果表明，飼喂雙歧桿菌后，雛雞腸道MUC2分泌量增加，機體局部免疫功能增強。雙歧桿菌在雛雞腸道內(nèi)定植后，當(dāng)其增殖到一定數(shù)量時，可以通過激活巨噬細(xì)胞，活化自然殺傷細(xì)胞和提高免疫球蛋白(特別是IgA)的水平，增強機體非特異性和特異性免疫[12]。

腸道杯狀細(xì)胞分泌受多種因素影響，如腸道激素水平，腸道內(nèi)源及外源性物質(zhì)等。Stanley C M[13]在人大腸癌HT29-18N2細(xì)胞系檢測緩激肽對糖蛋白合成和黏液素分泌的調(diào)節(jié)，證實緩激肽可增加黏液素釋放；Kim S等[14]發(fā)現(xiàn)，杯狀細(xì)胞黏液素的分泌與表皮生長因子受體(EGFR)的表達和活化有關(guān)；崔宏偉[15]等研究發(fā)現(xiàn)，飼喂乳酸桿菌可以增加雛雞腸道MUC2含量。以上研究均表明杯狀細(xì)胞分泌受多種因素的影響，益生菌能夠誘導(dǎo)MUC2的分泌以及上調(diào)基因表達，拮抗致病菌的腸道粘附、侵襲以及易位作用。

4 結(jié)論

雙歧桿菌通過增加雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量，上調(diào)腸道組織MUC2mRNA的表達量及腸液中MUC2含量，提高腸道黏膜免疫，增強機體抵抗致病菌的能力。

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Effects of Bifidobacterium to the number of goblet cells and the content of MUC2 in intestinal tract of chicks

ZHANG Mei-xi1， SUI Xin1,2， LIU Chao-nan1， LV Xiao-ping1， ZHENG Shi-min1， GAO Xue-li1

(1.College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China； 2.Center of Anima Disease Control and Prevention of Jixi City，Jixi 158200，China)

In order to study the effects of Bifidobacterium on local mucosal immune,periodic acid-schiff staining,quantitative real-time PCR and indirect enzyme-linked immunosorbent assay were used to study the number of goblet cells,expression of MUC2 mRNA of chicks’ intestinal tract and the content of MUC2 in intestinal mucus after administrated Bifidobacterium.The results were as follows：the number of goblet cells of chicks’ intestinal tarct,expression of MUC2 mRNA of chicks’ intestinal tract and the content of MUC2 in intestinal mucus in chicks administrated with Bifidobacterium were significantly enhanced when compared with those in the control group.Meantime,the number of goblet cells of ileum intestinal tract,the impression of MUC2mRNA of ileum intestinal tract and the content of MUC2 in ileum intestinal mucus were also significantly higher than those in the control group at 1-4 days after administrated Bifidobacterium (P<0.05orP<0.01); the impression of MUC2mRNA of colon intestinal tarct is extremely significantly higher than the control group in 1-7 days after administrated Bifidobacterium (P<0.01).The results showed that Bifidobacterium can enhance the number of goblet cells and affect the seretion of MUC2,each of which can enhance chicks’ intestinal mucosal immune function.

Bifidobacterium；chick；intestinal tarct；goblet cell；MUC2

GAO Xue-Li

2016-04-13

國家自然科學(xué)基金項目(31972162)

張美曦(1991-)，女，碩士生，研究方向為動物病理生理學(xué)，E-mail：zhangmercy@163.com

高雪麗，E-mail：gaoxueli@neau.edu.cn

S852.33

A

0529-6005(2016)12-0024-04