宋軍營(yíng)　張　娜　潘曉麗　王　琦　吳耀松　蔣時(shí)紅　張振強(qiáng)▲

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州　450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州　450046

疏松結(jié)締組織鋪片方法在組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中應(yīng)用與體會(huì)

宋軍營(yíng)1，2張娜2潘曉麗2王琦2吳耀松2蔣時(shí)紅2張振強(qiáng)1，2▲

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州450046

為了提高《組織學(xué)與胚胎學(xué)》的教學(xué)質(zhì)量，培養(yǎng)學(xué)生的綜合素質(zhì)，在中醫(yī)院校開展了“疏松結(jié)締組織鋪片法”的實(shí)驗(yàn)課教學(xué)。通過復(fù)合染色方法，可一張鋪片呈現(xiàn)藍(lán)、紅、紫三種顏色，使得鏡下能夠觀察到兩種纖維和三種細(xì)胞。這種方法的實(shí)施不僅增強(qiáng)學(xué)生動(dòng)手能力，而且能很好地了解疏松結(jié)締組織中細(xì)胞的不同表型和分布，同時(shí)，既豐富組織學(xué)內(nèi)容，把教學(xué)、科研連接一起，又達(dá)到提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量的目的。

疏松結(jié)締組織；鋪片；實(shí)驗(yàn)教學(xué)；復(fù)合染色

［Abstract］To improve the teaching quality of histology and embryology，meet the students'desire for knowledge and train their overall quality，the experiment teaching methods of"loose connective tissue"was carried out in Chinese medicine colleges.Three colors:blue，red，purple were present in a piece of glass，two kinds of fibers and three kinds of cells were observed by themicroscope.The implementation of themethod is not only strengthen the student beginning ability，but also is a good understanding of different phenotypes and distribution of cells in loose connective tissue. Meanwhile，the contents of the histology are enriched，teaching and scientific research are connected together，and the goal of the experiment teaching quality is improved.

［Key words］Loose connective tissue；Stretched preparation；Experimental teaching；Compound staining

《組織學(xué)與胚胎學(xué)》這門課程是中醫(yī)院校醫(yī)學(xué)生較早接觸的主要基礎(chǔ)課之一，對(duì)于奠定相近基礎(chǔ)學(xué)科的作用具有重要意義［1］。中醫(yī)院?！督M織學(xué)與胚胎學(xué)》教學(xué)模式是在理論教學(xué)的基礎(chǔ)上，再通過實(shí)驗(yàn)教學(xué)著重對(duì)相應(yīng)理論進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)教學(xué)中則一般采用理論教學(xué)結(jié)合切片示教型實(shí)驗(yàn)教學(xué)，即通過教師指導(dǎo)學(xué)生利用光學(xué)顯微鏡，觀察切片標(biāo)本的細(xì)胞、組織和器官等，并簡(jiǎn)單描繪出400倍下觀察的部分標(biāo)本圖像。這對(duì)于研究微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)、具有龐大的專業(yè)名詞和概念及抽象三維立體結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證性學(xué)科來說，學(xué)生要想理解和掌握所學(xué)內(nèi)容是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，所以加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)課教學(xué)手段，使學(xué)生在實(shí)驗(yàn)課上獲得形象化、具體化的感性認(rèn)識(shí)。因此，實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)質(zhì)量對(duì)培養(yǎng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和提高教學(xué)效果具有重要意義，直接影響后續(xù)課程的教學(xué)質(zhì)量［2］。

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通訊作者

為了提高中醫(yī)院校醫(yī)學(xué)生的綜合素質(zhì)，響應(yīng)學(xué)校最新提出的教學(xué)方法改革提案，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的內(nèi)容和講述方式進(jìn)行創(chuàng)新：即在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開展制作疏松結(jié)締組織鋪片實(shí)驗(yàn)，由教師示范操作后劃分成組的學(xué)生自己獨(dú)立操作完成。疏松結(jié)締組織鋪片方法是比較常用的組織學(xué)技術(shù)，通過不同方法著色使其各種細(xì)胞和纖維顯現(xiàn)出來，有助于對(duì)疏松結(jié)締組織成份的認(rèn)識(shí)。通過復(fù)合染色方法可一張鋪片呈現(xiàn)藍(lán)、紅、紫三種顏色，使得鏡下能夠觀察到兩種纖維和三種細(xì)胞［3，4］。這種方法的實(shí)施不僅增強(qiáng)學(xué)生動(dòng)手能力，而且能很好地了解疏松結(jié)締組織中細(xì)胞的不同表型和分布，既豐富組織學(xué)內(nèi)容，把教學(xué)、科研連接一起，又達(dá)到提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量的目的，由此也改變了學(xué)生被動(dòng)接受性學(xué)習(xí)和不利的創(chuàng)新能力培養(yǎng)，充分體現(xiàn)學(xué)生的主體作用，給學(xué)生提供多動(dòng)手多動(dòng)腦及進(jìn)行創(chuàng)造性思維的機(jī)會(huì)［5］。

1　實(shí)驗(yàn)教學(xué)方法

根據(jù)2014年3月的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，4月完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。取健康日本大耳白兔（批準(zhǔn)號(hào)：DWLL201403015）1只，體重2 kg，連續(xù)腹腔注射1%臺(tái)盼藍(lán)（美國(guó)sigma公司）3 d，然后第5天和第7天再注射，共注射5 d，每天1次；兔緣靜脈注射20%烏拉糖溶液（美國(guó)sigma公司）麻醉（5 mL/kg），打開腹腔取皮下腸系膜鋪于蠟盤上，用蛙釘固定；用20%福爾馬林固定液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）固定10～15 min（用時(shí)新配）；然后用蒸餾水水洗3次；用解剖剪剪成小塊，分給學(xué)生（1塊/人），用解剖針輕輕展開腸系膜薄層，借助于組織液黏附于載玻片上，使腸系膜展平完全鋪開，盡量不要有重疊的部分；滴加堿性復(fù)紅（北京索萊寶科技有限公司）溶液，放入40℃溫箱內(nèi)染15 min；出恒溫箱（上海精密儀器公司）用蒸餾水水洗，再用95%酒精（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）分色1～2 min；分色后再次蒸餾水水洗，滴加偶氮卡紅（北京索萊寶科技有限公司）溶液，在60℃溫箱內(nèi)復(fù)染1～2 min；出恒溫箱后，直接入95%酒精液分色1～2 min；用無水乙醇脫水，用二甲苯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）透明，最后滴加中性樹膠封片，鏡下觀察。

2　學(xué)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)做的比較成功的鋪片學(xué)生可在顯微鏡（日本Nikon）下觀察到：巨噬細(xì)胞形態(tài)大小不一，但外形比較清楚，在纖維中間分布，細(xì)胞核較小而染色較深，主要呈圓形或橢圓形，在胞質(zhì)中可以觀察到粗大的藍(lán)色吞噬顆粒；成纖維細(xì)胞相對(duì)數(shù)量較多，而且胞體呈梭形或星形，細(xì)胞核大，呈卵圓形，染色后呈淺紅色，但胞質(zhì)內(nèi)無藍(lán)色顆粒；肥大細(xì)胞呈橢圓形，胞質(zhì)有大量細(xì)小顆粒呈淺紫紅色；鏡下看到數(shù)量較多呈紅色的膠原纖維，有分支且粗細(xì)不等；而呈紫紅色的彈力纖維數(shù)量較少，多數(shù)彈力纖維單根走行呈細(xì)絲狀，在其斷端卷曲成波浪形。根據(jù)數(shù)量和著色情況能夠清晰分辨出彈力纖維和膠原纖維（染色時(shí)間短時(shí)膠原纖維較清晰，染色時(shí)間長(zhǎng)時(shí)彈性纖維較清晰），這樣的片子可以作為教學(xué)示片（封三圖12）。

實(shí)驗(yàn)做的不成功的鋪片會(huì)出現(xiàn)組織塊重疊、時(shí)間把握不好（染色過度或染色過短），有的同學(xué)會(huì)在中間環(huán)節(jié)缺少個(gè)別步驟，使分色效果不好等，這些結(jié)果都不能很好地在顯微鏡下觀察到實(shí)驗(yàn)要求的三種細(xì)胞和兩種纖維。

3　討論

3.1“疏松結(jié)締組織鋪片的實(shí)驗(yàn)制作”的教學(xué)心得

“疏松結(jié)締組織鋪片的實(shí)驗(yàn)制作”是一項(xiàng)常用的組織學(xué)技術(shù)，其各種細(xì)胞和纖維的清晰程度對(duì)疏松結(jié)締組織成分的認(rèn)識(shí)具有重要作用，而制作良好的標(biāo)本是培養(yǎng)學(xué)生觀察能力、提高學(xué)習(xí)興趣和教學(xué)效果的必備條件，選擇適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)材料和染色方法是提高制片質(zhì)量的前提。一張理想的教學(xué)用疏松結(jié)締組織鋪片應(yīng)具備達(dá)到以下幾點(diǎn)：①所有要觀察的細(xì)胞核清楚，著色清晰；巨噬細(xì)胞吞噬顆粒清晰，均勻分布于胞漿中，成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯很多，胞內(nèi)無顆粒；肥大細(xì)胞形態(tài)明顯，胞質(zhì)有細(xì)小顆粒；②膠原纖維、彈力纖維示清晰且著色不同顯。臺(tái)盼藍(lán)的注射量、配制濃度和注射時(shí)間要適當(dāng)。濃度低、量少、時(shí)間短則巨噬細(xì)胞中吞噬顆粒不明顯，過多則會(huì)造成吞噬顆粒堆積，鋪片過程中易破裂，同時(shí)肥大細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中也有少量藍(lán)色顆粒，使三種細(xì)胞不易區(qū)別［5］。

本次實(shí)驗(yàn)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用1%臺(tái)盼藍(lán)，連續(xù)腹腔注射3 d，然后第5天和第7天再注射，共注射5 d，每天1次，這樣操作有利于組織間隙中多余染料被巨噬細(xì)胞充分吸收，同時(shí)也有利于清除掉成纖維細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)吸入的染料顆粒，從而使組織鋪片背景清晰。采用活體取材，即將大白兔麻醉后進(jìn)行取材，保證在活體狀態(tài)下取材，避免細(xì)胞和組織發(fā)生死后變化，能夠?qū)⒓?xì)胞完好的保存下來，特別是巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞，同時(shí)也避免取材時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致材料浪費(fèi)，能夠盡可能保持細(xì)胞和組織在活體狀態(tài)下被取下，制作更多的高質(zhì)量切片。為了在同一張鋪片中同時(shí)觀察到膠原纖維、彈性纖維、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種成分組成的疏松結(jié)締組織，需要采用多色染色法［6，7］。由于此次實(shí)驗(yàn)室采用復(fù)合染色方法，染色時(shí)間的長(zhǎng)短與染色后的結(jié)果有很大關(guān)系，學(xué)生在染色時(shí)間上掌握的不夠準(zhǔn)確，加上展片的技術(shù)不夠熟練，使染色結(jié)果呈現(xiàn)多色多樣。不過，大多數(shù)學(xué)生還是能夠掌握基本的原理和方法，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟制作片子，最后成功觀察到組織中的細(xì)胞和纖維（圖1）。但也有一小部分同學(xué)，由于不足夠細(xì)心，染色時(shí)間把握不好，或者鋪片不到位，有重疊現(xiàn)象，使結(jié)果呈現(xiàn)不理想。

在實(shí)驗(yàn)課時(shí)，很多同學(xué)都表現(xiàn)出積極的態(tài)度參與到實(shí)驗(yàn)中。從一開始飼養(yǎng)動(dòng)物到給予染色劑注射及實(shí)驗(yàn)課時(shí)的解剖工作，學(xué)生都自愿參與積極配合。通過這次實(shí)驗(yàn)教學(xué)培養(yǎng)了學(xué)生的動(dòng)手能力、觀察能力、思維能力、創(chuàng)新能力，提高了學(xué)生學(xué)習(xí)組織學(xué)與胚胎學(xué)的興趣和鞏固學(xué)生所學(xué)的相關(guān)基礎(chǔ)理論知識(shí)，同時(shí)，也培養(yǎng)學(xué)生的團(tuán)結(jié)協(xié)作能力，使學(xué)生在短時(shí)間內(nèi)熟練掌握相關(guān)理論和操作技能。

3.2開展“疏松結(jié)締組織鋪片實(shí)驗(yàn)”的意義

疏松結(jié)締組織是重要的基本組織，在人體中分布廣泛。“疏松結(jié)締組織鋪片的實(shí)驗(yàn)制作”是一項(xiàng)綜合性實(shí)驗(yàn)，此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)不僅能讓學(xué)生通過觀察結(jié)締組織的多種組成成分（包括細(xì)胞和纖維），從而認(rèn)識(shí)和掌握疏松結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，而且能把所學(xué)理論知識(shí)與相關(guān)外圍知識(shí)聯(lián)系起來，同時(shí)拓寬學(xué)生的知識(shí)面，也能夠讓學(xué)生初步掌握實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本喂養(yǎng)、解剖、取材方法和疏松結(jié)締組織鋪片的制備過程及觀察組織切片的方法［8］。在疏松結(jié)締組織鋪片的整個(gè)制作過程中，要以學(xué)生操作為主體，教師給予示范操作后，在一旁適當(dāng)指導(dǎo)，以使每個(gè)學(xué)生盡可能發(fā)揮潛能，達(dá)到培養(yǎng)和鍛煉學(xué)生的多種能力［9，10］。學(xué)生完成實(shí)驗(yàn)后可以把自己做好的鋪片放在顯微鏡下觀察，這種自己制作自己觀察描述的學(xué)習(xí)方式給學(xué)生留下深刻的印象，也會(huì)使學(xué)生對(duì)這部分知識(shí)掌握更牢固，取得更好的學(xué)習(xí)效果；同時(shí)，綜合性實(shí)驗(yàn)的開設(shè)活躍了課堂氣氛，學(xué)生觀察能力、動(dòng)手能力、分析及思維能力的培養(yǎng)及團(tuán)隊(duì)合作意識(shí)也得到了鍛煉，也為其他學(xué)科（病理學(xué)、微生物免疫學(xué)等）的實(shí)驗(yàn)技能打下基礎(chǔ)［11］。這樣也達(dá)到了理論與實(shí)驗(yàn)一體化教學(xué)的目的，使學(xué)生把所學(xué)的理論知識(shí)及時(shí)強(qiáng)化、印證，向?qū)嵺`轉(zhuǎn)化；將空洞的授課變得具體，抽象的內(nèi)容變得形象，感性認(rèn)識(shí)與理性認(rèn)識(shí)高度統(tǒng)一，學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和能力都得到提高［12］。

“疏松結(jié)締組織鋪片的制作”需要用到多方面的基本實(shí)驗(yàn)技能，也需要醫(yī)學(xué)生了解和掌握這些基本的實(shí)驗(yàn)技能。而且，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)也可能是后續(xù)的實(shí)驗(yàn)或科研中的重要環(huán)節(jié)，所以教師通過示范關(guān)鍵操作步驟并且在實(shí)驗(yàn)過程中隨時(shí)指導(dǎo)，讓學(xué)生嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟親自動(dòng)手操作，從而培養(yǎng)學(xué)生的嚴(yán)謹(jǐn)科研態(tài)度，認(rèn)真練習(xí)和掌握基本的實(shí)驗(yàn)操作技能。通過這次實(shí)驗(yàn)教學(xué)的開展，讓我們對(duì)實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)改革增加信心。我們可以在以后的實(shí)驗(yàn)教學(xué)當(dāng)中引入更多的實(shí)驗(yàn)操作課程，如血液章節(jié)制作“血涂片”實(shí)驗(yàn)，呼吸系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)課“觀察纖毛擺動(dòng)”，生殖系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)課開展“精子運(yùn)動(dòng)”實(shí)驗(yàn)課等，給學(xué)生更多的機(jī)會(huì)親自動(dòng)手做實(shí)驗(yàn)，直接觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，充分體現(xiàn)學(xué)生的主體作用，給學(xué)生提供多動(dòng)手、多動(dòng)腦、進(jìn)行創(chuàng)造性思維的機(jī)會(huì)［12］。通過這次實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革，培養(yǎng)了學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)技能的學(xué)習(xí)和認(rèn)識(shí)，提高了分析問題和解決問題的能力，激發(fā)了學(xué)生學(xué)習(xí)組織學(xué)與胚胎學(xué)的興趣，并且對(duì)鞏固學(xué)生所學(xué)的相關(guān)基礎(chǔ)理論知識(shí)具有重要意義。但是，也讓我們得到一個(gè)提示：在教學(xué)實(shí)踐過程中存在著一些不足之處，需要不斷的改進(jìn)教學(xué)方法，即可以通過成立科研興趣小組，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力：讓學(xué)生參與教研室老師的科研課題，接觸并學(xué)習(xí)一些基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如石蠟切片的制作、HE染色、免疫組化等，開闊學(xué)生的視野，培養(yǎng)學(xué)生的科研思維；定期開放實(shí)驗(yàn)室，并配備相關(guān)教師對(duì)學(xué)生進(jìn)行輔導(dǎo)和幫助，鼓勵(lì)學(xué)生在業(yè)余時(shí)間多去實(shí)驗(yàn)室，通過觀察切片和模型，加深對(duì)理論知識(shí)的理解和記憶［13，14］，使學(xué)生能夠很好地將理論學(xué)習(xí)與基礎(chǔ)訓(xùn)練結(jié)合起來，激發(fā)學(xué)生發(fā)揮主觀能動(dòng)性，在教學(xué)過程中培養(yǎng)學(xué)生的獨(dú)立性和自主性，通過實(shí)驗(yàn)或病例分析引導(dǎo)學(xué)生質(zhì)疑、討論、探究，在學(xué)習(xí)中主動(dòng)思考等［15］，只有這樣才能夠提高組織學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量，培養(yǎng)醫(yī)學(xué)生綜合素質(zhì)，促進(jìn)學(xué)生的個(gè)性發(fā)展。

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The application and experience of the stretched preparation method of loose connective tissue in experiment teaching

SONG Junying1，2ZHANG Na2PAN Xiaoli2WANG Qi2WU Yaosong2JIANG Shihong2ZHANG Zhenqiang1，2
1.Laboratory of Medical Immunology，He'nan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China；2.He'nan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China

R4

C

1673-9701（2016）15-0130-03

河南省教育科學(xué)“十二五”規(guī)劃重點(diǎn)課題（［2013］-JKGHB-0034）；河南中醫(yī)學(xué)院校級(jí)科研課題（2012JX15）；河南中醫(yī)學(xué)院博士科研基金項(xiàng)目（BSJJ2012-07）

2016-03-31）