宋曉敏，呂曉杰，邱智敏，邢建宏，陳世品，譚芳林，陳 偉*

?

紅樹植物秋茄類黃酮代謝及其抗氧化活性對(duì)高鹽脅迫的響應(yīng)

宋曉敏1，呂曉杰1，邱智敏3，邢建宏4，陳世品3，譚芳林2，陳 偉1*

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2 福建林業(yè)科學(xué)研究院，福州 350012；3 福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福州 350002；4 三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院，福建三明 365004)

以紅樹植物秋茄為試驗(yàn)材料，設(shè)置不同濃度NaCl(0、200和500 mmol·L-1)處理的砂培實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用qRT-PCR分析秋茄葉片中類黃酮物質(zhì)合成上游的4個(gè)關(guān)鍵酶基因——苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)、肉桂酸羥化酶基因(C4H)、4-香豆酰輔酶A連接酶基因(4CL)和查爾酮合成酶基因(CHS)的轉(zhuǎn)錄水平，并對(duì)關(guān)鍵酶活性進(jìn)行了分析，同時(shí)測(cè)定了幼苗生物量、鉀鈉離子含量、類黃酮含量及其抗氧化活性，以探討秋茄耐鹽性與類黃酮物質(zhì)的關(guān)系，為揭示木本植物耐鹽機(jī)制奠定基礎(chǔ)。結(jié)果顯示：(1)在鹽處理?xiàng)l件下，秋茄葉片中PAL、4CL、C4H和CHS4個(gè)關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，PAL、4CL、C4H酶活性和CHS含量隨著鹽濃度的增加而明顯上升。(2)與對(duì)照相比，秋茄根、莖、葉干重在鹽處理3 d和15 d后均無(wú)顯著變化，而秋茄株高僅在200 mmol·L-1鹽處理15 d后顯著增加，其余濃度和時(shí)間均未發(fā)現(xiàn)有顯著性變化。(3)隨著鹽濃度的升高，秋茄葉片類黃酮含量顯著增加，K+/Na+明顯下降，丙二醛含量顯著降低，活性氧自由基清除率顯著增加。研究表明，鹽處理加強(qiáng)了秋茄葉片中類黃酮代謝過程中相關(guān)酶基因的表達(dá)，類黃酮物質(zhì)的累積有助于其抗氧化能力的提高，進(jìn)而提高秋茄的抗鹽性，維持鹽脅迫下秋茄的正常生長(zhǎng)。

秋茄；鹽脅迫；類黃酮代謝；抗氧化；qRT-PCR

土壤鹽堿化是影響全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境最主要的非生物脅迫因子之一。目前，全世界的鹽堿土地超過10億公頃，占陸地總面積的30%；中國(guó)大約有3 600 hm2的鹽漬地，占總耕地面積的6.62%[1]。土壤中高濃度的鹽分對(duì)植株的傷害主要表現(xiàn)在離子毒害、滲透脅迫、營(yíng)養(yǎng)缺乏等方面，受到鹽脅迫的作物生長(zhǎng)受到限制，甚至?xí)劳鯷2-3]。植物一般通過抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)體系來(lái)抵御逆境脅迫，同時(shí)，也可通過積累次生代謝物質(zhì)(如類黃酮、花青素等)來(lái)清除活性氧(ROS)，起到保護(hù)植物體的作用[4]。類黃酮等次生代謝物質(zhì)在植物防御逆境過程中起重要作用[5-6]，其中最顯著的作用是參與逆境脅迫下植物的解毒抗氧化和ROS清除。高曉輝等[7]研究表明，梨(PyrusbretschneideriRehd. cv. Pingguoli)果實(shí)在蘋果酸處理下，其體內(nèi)過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性顯著增加，同時(shí)相關(guān)次生代謝產(chǎn)物類黃酮含量也提高。

秋茄[Kandeliacandel(L.) Druce]屬紅樹科秋茄樹屬植物，是一種典型的非泌鹽紅樹植物，分布于熱帶、亞熱帶陸海交匯處，在中國(guó)主要分布于海南、廣西、廣東、臺(tái)灣、福建、香港的海灣，對(duì)維護(hù)海岸生態(tài)平衡有重要作用[8]。此外，秋茄是一種鹽生木本植物，生活于海水浸漬的較高鹽度的泥灘中，經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化形成了一套木本植物特有的耐鹽機(jī)制，因此秋茄體內(nèi)蘊(yùn)含著豐富的抗逆基因資源，挖掘其耐鹽基因具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，前人對(duì)植物的鹽響應(yīng)機(jī)制的研究主要集中在植株生長(zhǎng)和生理特性的變化方面。例如，在鹽脅迫處理下，烤煙(flue-cured tobacco)葉片中的苯丙氨酸解氨酶活性和類黃酮含量明顯增加[9]；紫葉李(Prunuscerasiferavar.atropurea)在鹽脅迫下葉色逐漸轉(zhuǎn)綠，葉綠素、花青苷、類黃酮含量呈先上升后下降的趨勢(shì)[10]。但是，紅樹植物耐鹽性與類黃酮代謝的關(guān)系研究還鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)對(duì)秋茄轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下秋茄葉片中類黃酮代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)變化顯著[11]。本研究以此為切入點(diǎn)，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)一步分析秋茄葉片類黃酮代謝途徑中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸羥化酶(C4H)、4-香豆酰輔酶A連接酶(4CL)和查爾酮合成酶(CHS)4個(gè)關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，并測(cè)定了類黃酮含量及其抗氧化活性，探討秋茄耐鹽性與類黃酮物質(zhì)的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示木本植物耐鹽機(jī)制提供有價(jià)值信息，同時(shí)也為今后應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將紅樹植物耐鹽相關(guān)基因轉(zhuǎn)入主要作物，培育耐鹽植物奠定相關(guān)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用成熟的秋茄胚軸采自福建泉州洛陽(yáng)河紅樹林保護(hù)區(qū)，經(jīng)緯度分別為24°58′N和118°39′E，海水鹽度為8‰～20‰。選擇外觀完好、無(wú)蟲害、大小相近的胚軸培養(yǎng)于潔凈的砂子中，每盆(30 cm× 42 cm× 14 cm)種植10～15株，每隔2 d每盆澆灌1 L Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，平時(shí)補(bǔ)充水分。待秋茄幼苗第二對(duì)葉片完全展開時(shí)，對(duì)幼苗進(jìn)行鹽脅迫處理，以Hoagland營(yíng)養(yǎng)液為基本溶液，添加NaCl配制適宜濃度(200 mmol·L-1NaCl)和高濃度(500 mmol·L-1NaCl)鹽脅迫處理液，以無(wú)添加NaCl為對(duì)照組，處理3 d后取葉片樣品，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 qRT-PCR分析的引物列表

1.2 秋茄葉片C4H、4CL、PAL和CHS基因表達(dá)的qRT-PCR驗(yàn)證

采用CTAB-LiCl沉淀法[12]提取葉片總RNA后，參照TaKaRa公司PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time；TaKaRa公司，日本)產(chǎn)品使用說(shuō)明書，將秋茄葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。獲得的cDNA產(chǎn)物于-20 ℃貯藏備用。根據(jù)秋茄的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，應(yīng)用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因的Real-time PCR引物(表1)。qRT-PCR按照熒光定量試劑盒SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa公司，日本)說(shuō)明書在ABI 7500 PCR儀進(jìn)行分析。qRT-PCR反應(yīng)體系為：2×SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)5.0 μL，Primer-S(10 μmol·L-1)0.2 μL，Primer-A(10 μmol·L-1)0.2 μL，cDNA模板0.5 μL，DNase Free ddH2O補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)；65 ℃升至95 ℃，每升高0.5 ℃，恒溫保持5 s，期間進(jìn)行熒光信號(hào)采集。選擇Actin作為內(nèi)參基因?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法[13]進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 秋茄幼苗生物量 在鹽處理3和15 d后分別采集10株幼苗進(jìn)行生物量的測(cè)定，株高采用直尺測(cè)定從根部到第一個(gè)莖葉分叉端的高度[14]，根、莖、葉干重參照陳穎等[15]方法。

1.3.2 秋茄葉片PAL、C4H、4CL活性及CHS含量 PAL活性參照陳雷等[16]方法，以每分鐘OD290值變化0.01定義為一個(gè)酶活單位(U),酶活性用U·mg-1表示。C4H活性參照Lamb等[17]方法，以每分鐘OD340值變化0.01定義為一個(gè)酶活單位(U),酶活性用U·mg-1表示。4CL活性參考范存斐等[18]方法，以每分鐘OD333值變化0.01定義為一個(gè)酶活單位(U),酶活性用U·mg-1表示。CHS含量測(cè)定參考植物CHS酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)操作步驟進(jìn)行：稱取0.5 g葉片，加入3 mL磷酸緩沖液(pH 7.5)，低溫下迅速研磨成勻漿，靜置30 min后4 ℃、15 000 g離心10 min，上清液為CHS粗酶液；接著在酶標(biāo)板中加入30 μL樣品稀釋液和20 μL CHS粗酶液，37 ℃溫育30 min，棄去液體，甩干后每孔加滿洗滌液，靜置30 s，棄去，重復(fù)5次，將酶標(biāo)板倒扣在濾紙上拍干后，加入50 μL酶標(biāo)試劑，37 ℃溫育30 min，每孔加滿洗滌液洗滌5次后拍干，然后加入顯色劑A、B各50 μL，37 ℃避光顯色10 min，最后加入50 μL終止液終止反應(yīng)，在450 nm下測(cè)定吸光值。先用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CHS含量。所有酶活性測(cè)定均采用蛋白含量進(jìn)行計(jì)算，蛋白含量按照Bradford方法[19]測(cè)定，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.3 秋茄葉片鉀鈉離子含量、類黃酮含量及其抗氧化活性 葉片中鉀、鈉離子含量的測(cè)定采用火焰分光光度法[20]。類黃酮含量參考趙亞婷等[21]方法，丙二醛(MDA)含量參照李合生[22]方法，羥自由基清除率參照郭亞力[23]方法，超氧離子自由基清除率參照賈之慎等[24]方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，用SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P< 0.05為顯著差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下秋茄葉片C4H、4CL、PAL和CHS基因表達(dá)分析

C4H、4CL、PAL和CHS是類黃酮代謝途徑的關(guān)鍵酶。與對(duì)照組相比，秋茄葉片中PAL、C4H、4CL和CHS基因表達(dá)水平均隨著NaCl處理濃度的增加而顯著提高(P< 0.05)，且鹽處理間大多差異顯著(圖1)。其中，秋茄葉片中PAL基因表達(dá)水平在200 和500 mmol·L-1NaCl處理下分別比對(duì)照顯著提高了1.5和2.3倍，C4H基因表達(dá)水平分別顯著提高了1.0和0.8倍，4CL基因表達(dá)水平分別顯著提高了2.0和3.0倍，而CHS表達(dá)水平分別比對(duì)照顯著提高了1.0和3.25倍。

2.2 鹽脅迫下秋茄葉片PAL、C4H、4CL酶活性和CHS含量分析

在適宜濃度(200 mmol·L-1)和高濃度(500 mmol·L-1)鹽脅迫處理下，秋茄葉片中PAL、C4H、4CL和CHS 活性均比對(duì)照不同程度提高，且除適宜濃度鹽處理的PAL活性外均達(dá)到顯著水平(P< 0.05)，并以高濃度鹽脅迫處理顯著高于適宜濃度鹽脅迫處理(圖2)。其中，與對(duì)照相比較，200 和500 mmol·L-1處理秋茄葉片中PAL活性分別上升了1%和 80%(圖2，A)，C4H活性分別顯著提高了30%與63%(圖2，B)，4CL活性分別顯著提高了7%和39%(圖2，C)，類黃酮物質(zhì)合成關(guān)鍵酶CHS含量分別顯著提高了33%和92%(圖2，D)。

2.3 鹽脅迫下秋茄鉀鈉離子含量、類黃酮含量及其抗氧化活性分析

與對(duì)照相比，秋茄葉片類黃酮含量隨著鹽脅迫濃度的上升而提高，其在200和 500 mmol·L-1NaCl處理下分別上升了6%和 26%，但僅500 mmol·L-1NaCl處理達(dá)到顯著水平(圖3，A)。同時(shí)，秋茄葉片MDA含量在鹽脅迫下比對(duì)照顯著降低(P< 0.05)，并有隨著鹽濃度的上升而下降的趨勢(shì)，200 和500 mmol·L-1NaCl處理葉片中MDA含量分別比對(duì)照顯著下降了38%和 46%，但兩鹽脅迫處理間無(wú)顯著差異(圖3，B)。同葉片MDA含量相呼應(yīng)，與對(duì)照組相比，秋茄葉片中羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率在鹽脅迫下均顯著上升(P< 0.05)，200 和500 mmol·L-1NaCl處理的羥自由基清除率升幅分別為39%和45%，而它們相應(yīng)的超氧陰離子自由基清除率升幅分別為27%和37%，但兩鹽脅迫處理間無(wú)顯著差異(圖3，C、D)。另外，在鹽脅迫條件下，秋茄葉片K+含量與對(duì)照組相比沒有顯著變化(P> 0.05)，而葉片中Na+含量隨著鹽濃度的提高而顯著上升(P< 0.05)，200 和500 mmol·L-1NaCl處理的Na+含量分別比對(duì)照組顯著上升了9%和31%，從而導(dǎo)致葉片中K+/Na+隨著鹽濃度的升高而顯著降低，且高鹽處理降低幅度更大(圖3，E、F)。

不同小寫字母表示同一基因不同處理間差異顯著(P<0.05)圖1 鹽脅迫下秋茄葉片類黃酮代謝途徑相關(guān)差異基因的qRT-PCR分析The different normal letters mean significant differenre at differente treatments with the same gene (P<0.05)Fig.1 qRT-PCR analyses of differential expression genes of flavonoid metabolism in K.candel under salt stress

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05),下同圖2 鹽脅迫對(duì)秋茄葉片PAL、C4H、4CL活性和CHS含量的影響The different normal letters mean significant difference among treatments at 0.05 level, the same as Fig.3Fig.2 Effect of salinity on the activities of PAL, C4H, 4CL and CHS content in K. candel leaves

圖3 鹽脅迫對(duì)秋茄葉片鉀鈉離子含量、類黃酮含量及其抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of salinity on the contents of K+, Na+ and flavonoids and the antioxidant activity in K. candel leaves

培養(yǎng)天數(shù)Cultivationtime/dNaCl濃度NaClconcentration/(mmol·L-1)株高Height/cm每株干重Dryweight/g葉Leaf根Root莖Stem3036．8±2．1a0．2506±0．0313a0．3272±0．0396a0．2186±0．0253a20038．1±1．9a0．2718±0．0320a0．3508±0．0309a0．2328±0．0237a50035．9±2．3a0．2361±0．0316a0．3102±0．0325a0．2106±0．0229a15040．2±2．2b0．2984±0．0274ab0．3596±0．0368ab0．2502±0．0262ab20043．9±2．1a0．3269±0．0257a0．3955±0．0402a0．2788±0．0284a50037．5±2．5b0．2804±0．0294b0．3318±0．0352b0．2214±0．0243b

注：同列不同字母表示處理間在 0.05水平上達(dá)到顯著性差異(P<0.05)

Note： Different letters in the same column indicate significant differences among treatments at 0.05 level

2.4 鹽脅迫下秋茄生物量分析

植物生物量是反映鹽脅迫傷害程度的最直觀準(zhǔn)確指標(biāo)。表2顯示，與對(duì)照組相比，在各濃度鹽脅迫處理3 d后，秋茄的株高以及根、莖、葉干重均未發(fā)生顯著性變化。在鹽處理15 d后，秋茄的株高在200 mmol·L-1NaCl處理下顯著高于對(duì)照組(P< 0.05)，在500 mmol·L-1NaCl處理下則稍低于對(duì)照組但差異不顯著，而同期秋茄的根、莖、葉干重在200 和500 mmol·L-1NaCl 處理下均與對(duì)照組無(wú)顯著性差異?？梢?，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的處理濃度和處理時(shí)間下，秋茄植株生長(zhǎng)沒有受到鹽脅迫顯著抑制，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽脅迫能力。

3 討 論

眾所周知，植物體內(nèi)類黃酮代謝中物質(zhì)合成起始于苯丙氨酸，通過PAL、C4H和4CL 3個(gè)關(guān)鍵酶的作用下再由苯丙氨酸生成4-香豆酰CoA，4-香豆酰CoA在CHS的作用下形成查爾酮，因此CHS也是類黃酮物質(zhì)合成途徑的限速酶[25]。本研究結(jié)果顯示，鹽脅迫提高了秋茄葉片中PAL、C4H、4CL和CHS基因的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)增強(qiáng)了秋茄葉片PAL、C4H、4CL活性和增加了CHS含量。PAL存在于植物和微生物中，能夠應(yīng)答干旱、UV-B輻射、植物激素和稀土元素等多種脅迫誘導(dǎo)[25-26]。楊晨等[14]以姜黃(Curcumaaromatica)組培苗為試驗(yàn)材料，分別以不同濃度NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)在50～100 mmol·L-1NaCl脅迫下，PAL活性顯著提高；陳穎等[15]發(fā)現(xiàn)在4～8 d內(nèi)，在適度鹽濃度處理下，銀杏(GinkgobilobaL.)細(xì)胞內(nèi)PAL活性隨著鹽濃度的提高而增強(qiáng)，且NaCl濃度越高，酶活性越強(qiáng)。本研究結(jié)果與他們相一致。C4H活性可以影響類黃酮和木質(zhì)素的合成等多條代謝支路。閆麗等[27]報(bào)道，高粱[(Sorghumbicolor(L.) Moench)]中C4H活性直接影響木質(zhì)素的合成；陳鴻翰等[28]發(fā)現(xiàn)苦蕎(Fagopyrumtataricum)在UV-B脅迫下類黃酮含量與FtC4H基因表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系。4CL是類黃酮代謝主要途徑向分支途徑轉(zhuǎn)折的一個(gè)關(guān)鍵酶，在植物與環(huán)境相互作用中起到了一個(gè)關(guān)鍵作用。有研究表明，UV-B處理可提高植物4CL活性，促進(jìn)次生代謝物質(zhì)的生成，進(jìn)一步增強(qiáng)植株的抗氧化能力[29]。CHS為類黃酮提供基本的碳架結(jié)構(gòu)，為類黃酮、花青素合成提供保障。CHS是合成類黃酮物質(zhì)的關(guān)鍵酶，而其本身又在植物的抗脅迫、花色素的積累、類黃酮物質(zhì)合成以及外源基因的表達(dá)等方面起著重要的作用[30]。本研究發(fā)現(xiàn)CHS含量隨著鹽濃度的升高而增加，這意味著鹽處理下CHS含量的增加有助于秋茄葉片中類黃酮、花青素等次生代謝物質(zhì)的合成。

近年來(lái)，大量研究表明由類黃酮代謝途徑產(chǎn)生的多種次生代謝物質(zhì)在植株生長(zhǎng)發(fā)育、抵抗蟲害及構(gòu)成植物細(xì)胞壁等方面具有重要意義[21]。本研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫15 d后，500 mmol·L-1NaCl處理下的秋茄株高、根莖葉干重與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異，這說(shuō)明高鹽脅迫并沒有抑制秋茄生長(zhǎng)。此外，植物在適應(yīng)逆境環(huán)境會(huì)產(chǎn)生各種次生代謝物，包括類黃酮物質(zhì)，而且生物類黃酮具有極強(qiáng)的抗氧化和抗自由基能力[31]。在環(huán)境脅迫條件下，植物通過增加植物體內(nèi)類黃酮化合物來(lái)防御環(huán)境脅迫，類黃酮是植物綜合防御體系的一部分，具有一定清除氧自由基的作用，能降低逆境脅迫對(duì)植株細(xì)胞的損傷，對(duì)細(xì)胞具有防護(hù)功能。王改利等[32]發(fā)現(xiàn)適宜干旱脅迫能誘導(dǎo)酸棗[(ZiziphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chow)]葉片中類黃酮含量顯著增加。同時(shí)，紅砂(Reaumuriasoongorica)類黃酮含量在UV-B輻射下也顯著增加，抗氧化能力增加，有效減輕了輻射脅迫對(duì)植株造成的氧化損傷[33]。一般在鹽脅迫條件下，非鹽生植物體內(nèi)離子平衡被打破，K+含量降低，Na+含量積累[20]。而在本研究中，鹽生植物秋茄葉片K+含量在鹽脅迫下沒有顯著性變化，Na+含量升高，K+/Na+降低，這說(shuō)明秋茄調(diào)節(jié)離子平衡的能力較強(qiáng)。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量的高低反映了細(xì)胞膜脂過氧化的程度和植株受逆境傷害的程度。然而，秋茄葉片膜脂系統(tǒng)在高鹽脅迫下并沒有遭到破壞，反而得以加強(qiáng)，并且抗氧化能力與類黃酮含量呈正相關(guān)。這與前人的研究報(bào)道相一致[32,33]。

綜上所述，鹽脅迫能誘導(dǎo)秋茄葉片PAL、C4H、4CL和CHS基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，促進(jìn)PAL、C4H、4CL活性和CHS含量顯著提高，引起相關(guān)次生代謝產(chǎn)物類黃酮含量的顯著增加以及葉片膜脂過氧化程度的降低和K+/Na+降低，導(dǎo)致活性氧自由基的清除率顯著提高，從而使得秋茄生物量在鹽脅迫下基本沒有受到顯著抑制。這些結(jié)果都說(shuō)明類黃酮代謝途徑的加強(qiáng)與秋茄抗氧化活性和滲透調(diào)節(jié)的增強(qiáng)密切相關(guān)，紅樹植物秋茄通過調(diào)控類黃酮代謝來(lái)適應(yīng)高鹽環(huán)境是其耐鹽性的一個(gè)重要特性。

[1] 朱金方, 劉京濤, 陸兆華, 等. 鹽脅迫對(duì)中國(guó)怪柳幼苗生理特性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2015, 35(15): 5 140-5 146.

ZHU J F, LIU J T, LU Z H,etal. Effects of salt stress on physiological characteristics ofTamarixchinensisLour. seedlings[J].ActaEcologicaSinica, 2015, 35(15): 5 140-5 146.

[2] 王永娟, 周 妍, 徐 明, 等. 鹽脅迫對(duì)大豆種子萌發(fā)及礦質(zhì)元素變化的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2015, 34(6): 1 565-1 571.

WANG Y J, ZHOU Y, XU M,etal. Germination parameters and mineral levels in soybean planats under salt stress[J].ChineseJournalofEcology, 2015, 34(6): 1 565-1 571.

[3] SONG Y, ZHANG C J, GE W N,etal. Identification of NaCl stress-responsive apoplastic proteins in rice shoot stems by 2D-DIGE[J].JournalofProteomics. 2011, 7(4): 1 045-1 067.

[4] 郭 偉, 于立河. 鹽堿脅迫對(duì)小麥幼苗根系活力和苯丙氨酸解氨酶活性的影響[J]. 作物雜志, 2012, 1: 31-34.

GUO W, YU L H. Effects of salinity-alkalinity stress on root activity and phenylalanine ammonia-lyase activity of wheat seedlings[J].Crops, 2012, 1: 31-34.

[5] 馬 杰, 胡文忠, 畢 陽(yáng), 等. 鮮切果蔬苯丙烷代謝的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(15): 391-393.

MA J, HU W Z, BI Y,etal. Advances on benzene propane metabolism of fresh-cut fruits and vegetables[J].ScienceandTechnologyofFoodIndustry, 2012, 33(15): 391-393.

[6] CHEN J Y, HE L H, JIANG Y M,etal. Expression of PAL and HSPs in fresh-cut banana fruit[J].EnvironmentalandExperimentalBotany, 2009, 66(1): 31-37.

[7] 高曉輝, 畢 陽(yáng), 溫曉麗, 等. 采后蘋果酸處理對(duì)梨果實(shí)苯丙烷代謝相關(guān)酶活性及終產(chǎn)物積累的誘導(dǎo)[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 44(6): 132-136.

GAO X H, BI Y, WEN X L,etal. Induction of postharvest malic acid treatment on activity of related enzymes and accumulation of final substances of benzene propance pathway in pears[J].JournalofGansuAgriculturalUniversity, 2009, 44(6): 132-136.

[8] 唐 密, 李 昆, 向洪勇, 等. 鹽脅迫對(duì)兩種紅樹植物生態(tài)、生理及解剖結(jié)構(gòu)的影響[J]. 生態(tài)科學(xué), 2014, 33(3):513-519.

TANG M, LI K, XIANG H Y,etal.. Research on ecological, physiological and morphological adaptability of two mangrove species to salt stress[J].EcologicalScience, 2014, 33(3): 513-519.

[9] 胡慶輝, 王程棟, 王樹聲, 等. NaCl脅迫下鮮煙葉中多酚物質(zhì)含量及PAL和PPO活性變化[J]. 中國(guó)煙草科學(xué), 2013, 34(1): 51-55.

HU Q H, WANG C D, WANG S S,etal. Changes of polyphenols contents, PPO and PAL activities of fresh tobacco leaves under NaCl stress[J].ChineseTobaccoScience, 2013, 34(1): 51-55.

[10] 胡曉立, 楊建民, 陳東亮, 等. NaCl脅迫對(duì)紫葉李葉片色澤的影響[J]. 林業(yè)科學(xué), 2010, 46(12): 64-69.

HU X L, YANG J M, CHEN D L,etal. Effect of NaCl stress on leaf coloration ofPrunuscerasiferavar.atropurea[J].ScientiaSilvaeSinicae, 2010, 46(12): 64-69.

[11] 王玲霞. 紅樹植物秋茄響應(yīng)鹽脅迫的分子生理機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2015.

[12] 孫美蓮, 王云生, 楊冬青, 等. 茶樹實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的選擇[J]. 植物學(xué)報(bào), 2010, 45(5): 579-587.

SUN M L, WANG Y S, YANG D Q,etal. Reference genes for real-time fluorescence quantitative PCR inCamelliasinensis[J].ChineseBulletinofBotany, 2010, 45(5): 579-587.

[13] LIVAK K J, SCHNUTTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod[J].Methods, 2001, 25: 402-408.

[14] 楊 晨, 劉建福, 王明元, 等. NaCl脅迫對(duì)姜黃組培苗生理特性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2014, 33(2):388-393.

YANG C, LIU J F, WANG M Y,etal. Effect of NaCl stress on physiological characteristics of invitroCurcumaaromaticaplant-lets[J].ChineseJournalofEcology, 2014, 33(2): 388-393.

[15] 陳 穎, 羅永亞, 邱娜菲, 等. NaCl處理對(duì)銀杏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)、耐鹽性和黃酮積累的影響[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2015, 39(6): 45-50.

CHEN Y, LUO Y Y, QIU N F,etal. Effects of NaCl treatment on the growth,sallt tolerance and flavonoids accumulation inGinkgobilobasuspension cells[J].JournalofNanjingForestryUniversity(Natural Sciences Edition), 2015, 39(6): 45-50.

[16] 陳 雷, 常 麗, 曹福亮, 等. 銀杏葉黃酮類化合物含量及相關(guān)酶活性對(duì)溫度和干旱脅迫的響應(yīng)[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2013, 33(4): 755-762.

CHEN L, CHANG L, CAO F L,etal. Effects of temperature and soil water deficit on the flavnoid content and activities of enzymes involved in ginkgo leaves[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 2013, 33(4): 755-762.

[17] LAMB C J, RUBERY P H. A spectrophotometric assay for trans-cinnamic acid 4-hydroxylase activity[J].AnalyticalBiochemistry, 1975, 68(2): 554-561.

[18] 范存斐, 畢 陽(yáng), 王云飛, 等. 水楊酸對(duì)厚皮甜瓜采后病害及苯丙烷代謝的影[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(3): 584-589.

FAN C F, BI Y, WANG Y F,etal. Effect of salicylic acid dipping on postharvest diseases and phenylpropanoid pathway in muskmelon fruits[J].ScientiaAgriculturaSinica, 2012, 45(3): 584-589.

[19] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].AnalyticalBiochemistry, 1976, 72(1): 248-254.

[20] 宋姍姍, 隆小華, 劉 玲, 等. 鈉鉀比對(duì)鹽脅迫下盛花期長(zhǎng)春花離子分布和光合作用的影響[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2011, 48(4):883-887.

SONG S S, LONG X H, LIU L,etal. Effects of Na+/K+ion distribution in various organs and photosynthetic characteristics ofCatharanthusroseusat the flowering stage under salt stress[J].ActaPedologicaSinica, 2011, 48(4):883-887.

[21] 趙亞婷, 朱 璇, 馬 玄, 等. 采前水楊酸處理對(duì)杏果實(shí)抗病性及苯丙烷代謝的誘導(dǎo)[J].食品科學(xué), 2015, 36(2): 216-220.

ZHAO Y T, ZHU X, MA X,etal. Induction of disease resistance and phenylpropanoid metabolism in apricot fruits by pre-aarvest salicylic acid treatment[J].FoodScience, 2015, 36(2): 216-220.

[22] 李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京:高等教育出版社, 2000.

[23] 郭亞力, 李 聰, 歐靈澄, 等. 3種分光光度法對(duì)天然抗氧化物質(zhì)抗自由基性能的分析檢測(cè)[J]. 分析試驗(yàn)室, 2004, 23(10): 43-48.

GUO Y L, LI C, OU L C,etal. Studies on the resistance capability to oxidation of natural antioxidants by three photometric methods[J].ChineseJournalofAnalysisLaboratory, 2004, 23(10): 43-48.

[24] 賈之慎, 唐孟成, 朱祥瑞. 桑樹黃酮類化合物清除超氧離子自由基O的研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1996, 22(5): 519-523.

JIA Z S, TANG M C, ZHU X R. Study on effect of scavenging superoxide free radical on mulberry flavonoids[J].JournalofZhejiangAgriculturalUniversity, 1996, 22(5): 519-523.

[25] 祖艷群, 孫晶晶, 閔 強(qiáng), 等. 二年生三七中黃酮含量對(duì)砷脅迫的響應(yīng)及其酶學(xué)機(jī)理[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2014,20(6): 1 005-1 010.

ZU Y Q, SUN J J, MIN Q,etal. Response of flavonoid content inPanaxnotoginsengto As and its enzymological mechanism[J].ChineseJournalofAppliedandEnvironmentalBiology, 2014, 20(6): 1 005-1 010.

[26] 邱宗波, 張晉豫, 孫 立, 等. 增強(qiáng)UV-B輻射下矮牽牛表型變異生理及RAPD多態(tài)性變化[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2010, 16(3): 323-327.

QIU Z B, ZHANG J Y, SUN L,etal. Physiological and RAPD variation ofPetuniahybridaexposed to enhanced ultraviolet-B radiation [J].ChineseJournalofAppliedandEnvironmentalBiology, 2010, 16(3): 323- 327.

[27] 閆 麗, 夏光敏, 黃應(yīng)華, 等. 高粱肉桂酸羥化酶基因SbC4H1降低擬南芥的木質(zhì)素合成[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2013, 49(12): 1 433-1 441.

YAN L, XIA G M, HUANG Y H,etal. Cinnamic acid 4-hydroxylase of sorghum [Sorghumbicolor(L.) Moench] geneSbC4H1 restricts lignin synthesis in Arabidopsis[J].PlantPhysiologyJournal, 2013, 49(12): 1 433-1 441.

[28] 陳鴻翰, 袁夢(mèng)求, 李雙江, 等. 苦蕎肉桂酸羥化酶基因(FtC4H)的克隆及其UV-B 脅迫下的組織表達(dá)[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2013, 21(2): 137-147.

CHEN H H, YUAN M Q, LI S J,etal. Cloning of cinnamate 4-hydroxylase gene (C4H) from tartary buckwheat (Fagopyrumtararicum) and its tissue-specific expression under UV-B stress during seed germination[J].JournalofAgriculturalBiotechnology, 2013, 21(2):137-147.

[29] 喻 譞, 姜璐璐, 王煥宇, 等. UV-C處理對(duì)楊梅采后品質(zhì)及苯丙烷類代謝的影響[J].食品科學(xué), 2015, 36(12): 255-259.

YU X, JIANG L L, WANG H Y,etal. Effects of UV-C treatment on quality and phenylpropanoid metabolism of postharvest Chinese bayberry fruit[J].FoodScience, 2015, 36(12): 255-259.

[30] 唐 寅, 張威威, 許 鋒, 等. 植物苯丙氨酸代謝相關(guān)酶基因啟動(dòng)子研究進(jìn)展[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2010, 7(2): 68-71.

CHEN Y, ZHANG W W, XU F,etal. Research progress of genes promoters of related enzymes in phenylalanine metabolism[J].JournalofYangtzeUniversity(Natural Science Edition), 2010, 7(2): 68-71.

[31] 劉安成, 李 慧, 王亮生, 等. 石榴類黃酮代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報(bào). 2011, 46(2):129-137.

LIU A C, LI H, WANG L S,etal. Recent advances in metabolic products of flavonoids inPunicagranatum[J].ChineseBulletinofBotany, 2011, 46(2): 129-137.

[32] 王改利, 魏 忠, 賀少軒, 等. 土壤干旱脅迫對(duì)酸棗葉片黃酮類代謝及某些生長(zhǎng)和生理指標(biāo)的影響[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào), 2011, 20(3): 1-8.

WANG G L, WEI Z, HE S S,etal. Effects of drought stress in soil on flavonoids metabolism in leaf and some growth and physiological indexes ofZiziphusjujubavar.spinosa[J].JournalofPlantResourcesandEnvironment, 2011, 20(3): 1-8.

[33] 劉美玲, 曹 波, 劉玉冰, 等. 紅砂黃酮類物質(zhì)代謝及其抗氧化活性對(duì)UV-B輻射的響應(yīng)[J]. 中國(guó)沙漠, 2014, 34(2): 426-432.

LIU M L, CAO B, LIU Y B,etal. Responses of the flavonoid pathway and antioxidant ability to UV-V radiation stress inReaumuriasoongorica[J].JournalofDesertResearch, 2014, 34(2): 426-432.

(編輯:裴阿衛(wèi))

Flavonoid Metabolism and Antioxidant Activity in Response to Salt Stress in MangroveKandeliacandel

SONG Xiaomin1, Lü Xiaojie1, QIU Zhimin3，XING Jianhong4,CHEN Shipin3，TAN Fanglin2，CHEN Wei1*

(1 College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2 Fujian Academy of Forestry, Fuzhou 350012, China; 3 College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 4 College of Resources and Chemical Engineering, Sanming University, Sanming, Fujian 365004, China)

In the present study, mangroveKandeliacandel(L.) Druce were potted in sand and treated with different NaCl concentrations (0, 200 and 500 mmol·L-1).The relative expression of four key genes in the flavonoid metabolism, phenylalanine ammonia lyase (PAL), cinnamic acid hydroxylase (C4H), 4-p-coumaric acyl coenzyme A ligase (4CL) and chalcone synthase(CHS) were analyzed in response to salt stress by quantificational Real-time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). In addition, the biomass, K+and Na+contents, the activities of key enzymes, the contents of flavonoid and the antioxidant activity in response to salt ofK.candelwere investigated. Our results showed that: (1) the expression levels ofPAL, 4CL,C4HandCHSwere up-regulated significantly under salt conditions; the activities of PAL, 4CL and C4H as well as CHS content were increased significantly with salt concentration increasing; compared with the control. (2) The plant height as well as the dry weight of leaf, root and stem were not changed significantly in NaCl treatment for 3 d and 15 d except the plant height significantly changed in 200 mmol·L-1NaCl treatment for 15 d. (3) The content of flavonoid, and the scavenging rate of hydroxyl radical and superoxide free radical were increased, the K+/Na+ratio and the content of MDA were decreased significantly. These results indicate that the flavonoid metabolism inK.candelunder salt conditions can be enhanced and may play an important role in the adaption to the saline environment. Accumulation of flavonoids contributes to oxidation resistance and salt tolerance ofK.candelin order to maintain plant growth under salt conditions.

Kandeliacandel; salt stress; flavonoid metabolism; antioxidant; qRT-PCR

1000-4025(2016)12-2461-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2461

2016-07-31;修改稿收到日期:2016-12-12

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201504415)；福建省自然科學(xué)基金(2014J01137)

宋曉敏(1992-)，女，碩士，主要從事植物生理與分子生物學(xué)研究。E-mail:18750193499@163.com

*通信作者:陳 偉，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物生理與分子生物學(xué)研究。E-mail: weichen909@163.com

Q945.78

A