周 強，史慶玲，董永彬，李彥偉，鄧 飛，馬智艷，喬大河，李玉玲

(河南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心/小麥玉米作物學國家重點實驗室，河南 鄭州450002)

opaque-2基因?qū)Ρ延衩鬃蚜Ｐ誀睢⑵焚|(zhì)和膨爆特性的影響

周 強，史慶玲，董永彬*，李彥偉，鄧 飛，馬智艷，喬大河，李玉玲*

(河南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心/小麥玉米作物學國家重點實驗室，河南 鄭州450002)

采用分子標記輔助選擇技術(shù)將opaque-2(o2)基因?qū)氲?個爆裂玉米自交系中，分析了o2基因?qū)Ρ延衩鬃蚜Ｐ誀?、品質(zhì)及膨爆特性的影響。結(jié)果表明，利用分子標記輔助選擇可以高效地將o2基因?qū)氲奖延衩鬃越幌?；在BC3F2群體中o2爆裂玉米籽粒的粗蛋白含量比野生型降低0.34%～3.97%，百粒膨化體積比野生型減少17.50～96.50 mL；爆花率比野生型降低25.00%～98.00%；膨化倍數(shù)比野生型減少1.50～10.24 mL/g；而o2基因?qū)Ρ延衩灼渌誀钣绊戄^小。因此，o2基因?qū)Ρ延衩鬃蚜５拇值鞍缀亢团虮匦杂绊戄^大。

爆裂玉米；opaque-2 基因； 籽粒性狀； 品質(zhì)； 膨爆特性

opaque-2(o2)基因是玉米胚乳發(fā)育中重要的轉(zhuǎn)錄因子，該基因發(fā)生突變可導致玉米胚乳中氨基酸構(gòu)成和蛋白質(zhì)組成發(fā)生變化，使玉米胚乳中賴氨酸、色氨酸含量顯著增加[1-3]。因此，可以利用回交轉(zhuǎn)育法將o2基因?qū)氲接衩鬃越幌担瑒?chuàng)制高賴氨酸含量玉米種質(zhì)[4-5]。但含有o2基因的玉米種質(zhì)一般會表現(xiàn)出胚乳質(zhì)地松軟、容重低、籽粒品質(zhì)差等缺陷[6-7]。前人研究發(fā)現(xiàn)，在玉米胚乳中存在o2修飾基因，在不同遺傳背景中o2修飾基因能夠不同程度地提高玉米胚乳的硬質(zhì)度，利用o2修飾基因是克服o2玉米缺陷的主要途徑之一[8-12]。

爆裂玉米是一種專門用于制作玉米膨化食品的特種玉米，在常壓條件下加熱可以爆裂膨化至原體積的幾倍甚至幾十倍[13-14]。膨爆特性是決定爆裂玉米利用價值的關(guān)鍵指標，但受品種本身特性和加工條件諸多因素的影響[15-18]。膨爆特性與籽粒性狀、胚乳結(jié)構(gòu)和成分均存在一定的相關(guān)性。爆裂玉米的胚乳幾乎都是由角質(zhì)淀粉構(gòu)成的，質(zhì)地堅硬，角質(zhì)胚乳越多，膨爆能力就越強[13-15,19]。但玉米籽粒蛋白質(zhì)一般缺乏賴氨酸和色氨酸，從而影響了其營養(yǎng)品質(zhì)。因此，本研究利用分子標記輔助選擇技術(shù)將普通玉米o2基因?qū)氲奖延衩鬃越幌抵?，探討了o2基因?qū)Ρ延衩鬃蚜Ｐ誀睢⑵焚|(zhì)和膨爆特性的影響，以期為爆裂玉米改良提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為野生型O2爆裂玉米自交系N10、N04，o2普通玉米自交系。

1.2o2基因回交導入系構(gòu)建

利用分子標記輔助選擇結(jié)合回交轉(zhuǎn)育技術(shù)將o2基因分別導入爆裂玉米自交系N04、N10。首先是親本材料雜交；然后將F1與輪回親本進行回交獲得BC1F1，從回交后代中利用分子標記篩選目標單株，從中選擇含有目的基因且綜合性狀好的植株與輪回親本連續(xù)回交；然后選擇包含目的基因且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的植株進行自交純化(圖1)。

圖1 o2基因回交導入爆裂玉米的過程

1.3 田間試驗種植和性狀調(diào)查

2014年夏在鄭州古滎種植o2近等基因系BC3F2家系和親本，試驗地排灌設(shè)施良好，肥力中等。2行區(qū)，行長4 m，行距0.6 m，株距0.22 m。栽培管理同一般大田。玉米6～7葉時單株掛牌取樣。生理成熟后單株收獲。

自交或姊妹交果穗自然曬干后逐穗考種，考察粒長、粒寬、粒厚、百粒質(zhì)量、百粒體積等性狀。每小區(qū)隨機取無病蟲的完整籽粒，利用8620型Bruker FT-NIR近紅外光譜分析儀測定粗淀粉含量、粗蛋白含量、粗脂肪含量和賴氨酸含量。

1.4 DNA提取和標記檢測

1.4.1 PCR引物o2-1 R：5′-CTCCCTGAAG-CGGGTGATAGA-3′；o2-1 F：5′-ACCGTTGCCG-ACCGAAGC-3′。

1.4.2 樣品DNA提取 ①將樣品磨碎；②加入SLS緩沖液850 μL，破裂DNA；③在上述反應(yīng)液中加入酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)850 μL；④將反應(yīng)液混合均勻后13 000 r/min離心5 min；⑤抽取上清液600 μL加入異丙醇400 μL冰浴1 h，13 000 r/min離心10 min；⑥倒掉上清，加入75%乙醇1 000 μL進行洗滌，靜置過夜；⑦倒掉乙醇，晾干后加入ddH2O溶解。

1.4.3 PCR反應(yīng)體系 包括2× Pfu buffer 12.5 μL，Pfu酶0.5 μL，滅菌水9 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，提取樣品DNA 1 μL，共25 μL。

1.4.4 PCR反應(yīng)程序 95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性45 s，57 ℃復性45 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4.5 瓊脂糖凝膠電泳 ①稱取2 g瓊脂放入干凈錐形瓶，加入200 mL蒸餾水溶解；②待溫度降到50 ℃左右時倒膠，然后放入梳子；③等待膠板冷卻凝固，將其放入電泳槽(電泳緩沖液沒過膠板)進行點樣；④點樣結(jié)束后電泳30 min；⑤用DNA凝膠成像系統(tǒng)顯色成像。

1.5 CAPS標記開發(fā)

利用o2-1引物擴增含o2普通玉米和野生型爆裂玉米自交系N04、N10，PCR產(chǎn)物送到北京六合華大基因科技股份有限公司測序。根據(jù)測序結(jié)果開發(fā)了1個CAPS標記，該標記利用限制性內(nèi)切酶SmlⅠ酶切PCR擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物酶切體系(20 μL)：10× buffer 2 μL、SmlⅠ酶1 μL、滅菌水12 μL、PCR產(chǎn)物5 μL。55 ℃酶切2 h，反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，用DNA凝膠成像系統(tǒng)顯色成像。

1.6 樣品掃描電鏡觀察

取成熟期玉米籽粒，用刀片將籽粒胚乳背部橫切2次，讓其自然斷開，去掉兩端，留取中部胚乳為觀察樣本。將觀察樣本的一個截面用膠帶紙粘貼，置于載物臺上，在IB-3型離子濺射儀內(nèi)對樣品斷裂面噴金后，用Philips XL30-ESEM掃描電鏡觀察淀粉粒形態(tài)與結(jié)構(gòu)并照相。

1.7 膨爆特性測試

生理成熟后，按家系收獲。果穗自然曬干后，逐穗考種脫粒，以家系為單位混合籽粒。每家系隨機數(shù)取無病蟲的完整籽粒，用電子天平稱量粒質(zhì)量，用BZ-99型豪華爆花機膨化，計數(shù)未膨化粒數(shù)，由此計算出評價膨爆特性的3個主要指標：百粒膨化體積(mL，以下簡稱膨化體積)、爆花率(爆花籽粒數(shù)/總粒數(shù)×100%)和膨化倍數(shù)[膨化體積(mL)/百粒質(zhì)量(g)]。

2 結(jié)果與分析

2.1o2基因的CAPS標記開發(fā)和利用

利用o2-1引物分別擴增o2普通玉米和野生型O2爆裂玉米自交系N04的DNA，PCR擴增產(chǎn)物送樣測序。結(jié)果表明，2個爆裂玉米自交系的擴增序列間沒有差異，但與普通玉米有多處堿基差異(圖2)。根據(jù)自交系間序列差異開發(fā)了一個功能型CAPS標記，該標記利用限制性內(nèi)切酶SmlⅠ酶切PCR擴增產(chǎn)物，該酶可以酶切野生型O2爆裂玉米自交系的PCR產(chǎn)物，而不能酶切含有o2普通玉米的PCR產(chǎn)物。因此，利用該標記可以區(qū)分出回交后代目標單株是否含有o2基因(圖3)。

方框指限制性內(nèi)切酶SmlⅠ酶切位點圖2 o2普通玉米和野生型O2爆裂玉米N04擴增序列比對

1、2、10為O2/O2野生型； 3、4、6、11、12為o2/o2基因型；5、7、9、13為O2/o2基因型； 14、15為親本基因型；8為DNA分子量標準

2.2o2基因?qū)氡延衩缀蟠硇丸b定

通過標記選擇和表型選擇相結(jié)合將o2基因回交導入到爆裂玉米。在BC3F2家系，含有o2基因家系自交后代的籽粒表現(xiàn)出opaque表型，而不含有o2基因家系自交后代的籽粒表現(xiàn)為野生型表型(圖4A)，這與分子標記檢測結(jié)果相一致。對從BC3F2家系獲得的o2爆裂玉米和野生型O2爆裂玉米的籽粒胚乳進行掃描電鏡觀察，在同樣的放大倍數(shù)下，淀粉粒大小以及附著蛋白質(zhì)均有明顯不同，野生型O2爆裂玉米淀粉粒較大且附著蛋白質(zhì)較少，而o2爆裂玉米胚乳淀粉粒變小且附著蛋白質(zhì)較多(圖4B、C)。

A.野生型爆裂玉米(上)和o2爆裂玉米籽粒(下)； B、C分別為野生型爆裂玉米、o2爆裂玉米的胚乳淀粉粒

2.3o2基因?qū)Ρ延衩鬃蚜Ｐ誀?、品質(zhì)及膨爆特性的影響

在相同環(huán)境條件下，BC3F2群體中o2爆裂玉米籽粒的賴氨酸含量為0.32%～0.40%，與野生型(0.34%～0.39%)相近，個別單株的賴氨酸含量甚至低于野生型(表1)；o2爆裂玉米籽粒的粗蛋白含量(7.71%～9.43%)明顯小于野生型(9.77%～11.68%)，降低了0.34～3.97個百分點；而粗淀粉和粗脂肪含量差異較小。o2爆裂玉米與野生型的粒長、粒寬、粒厚、百粒質(zhì)量、百粒體積等籽粒性狀差異也較小。o2爆裂玉米與野生型的膨爆特性差異較大，o2爆裂玉米籽粒的膨化體積變幅為18.50～32.50 mL，而野生型的膨化體積變幅為50.00～115.00 mL，減少了17.50～96.50 mL；o2爆裂玉米的爆花率變幅為0%～28.00%，而野生型的爆花率變幅為53.00%～98.00%，降低了25.00%～98.00%；o2爆裂玉米的膨化倍數(shù)變幅為2.16～3.85 mL/g，而野生型的膨化倍數(shù)變幅為5.35～12.40 mL/g，減少了1.50～10.24 mL/g(表1)。表明利用分子標記輔助選擇可以有效地將o2基因轉(zhuǎn)入到爆裂玉米中，爆裂玉米中導入o2基因?qū)ζ渑虮匦院痛值鞍缀坑休^大影響。

表1 BC3F2群體中o2爆裂玉米與野生型及親本各性狀表型

3 結(jié)論與討論

在傳統(tǒng)育種中，主要根據(jù)表型進行選擇，效率低。要提高選擇的效率，最理想的方法是能夠直接對基因型進行選擇[20-21]。分子標記輔助選擇不受其他基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響，結(jié)果較為可靠，同時可以在低世代及苗期進行分子篩選，有助于加快目標基因的回交導入以及改良現(xiàn)有種質(zhì)，大大縮短育種年限[4-5,20-21]。本研究根據(jù)含有o2基因的普通玉米和野生型爆裂玉米自交系序列差異開發(fā)了一個功能型CAPS標記，利用該標記成功地將隱性o2基因?qū)氲?個爆裂玉米自交系中。

o2基因?qū)μ岣哂衩灼焚|(zhì)具有關(guān)鍵性作用，通過減少醇溶蛋白的合成可以顯著提高玉米籽粒中賴氨酸和色氨酸含量[1-3]。本研究表明，o2基因?qū)Ρ延衩椎淖蚜Ｐ誀?、粗淀粉含量、粗脂肪含量和賴氨酸含量影響較小，而對膨爆特性和粗蛋白含量影響較大，這嚴重影響了爆裂玉米的膨爆特性。爆裂玉米的膨爆特性與籽粒淀粉等級呈正相關(guān)，其胚乳主要是由角質(zhì)淀粉構(gòu)成，角質(zhì)淀粉的比例一般都高于其他類型的玉米，角質(zhì)胚乳越多，爆裂膨化能力越強[14-19]。但o2爆裂玉米胚乳質(zhì)地松軟，導致爆裂玉米膨爆特性變差。近年來，人們發(fā)現(xiàn)了o2基因的修飾基因，利用修飾基因可以改良o2玉米籽粒結(jié)構(gòu)，使籽粒產(chǎn)量、籽粒硬度和農(nóng)藝性狀類似于普通玉米，而賴氨酸和色氨酸含量卻明顯高于普通玉米[22]。o2修飾基因的發(fā)現(xiàn)在一定程度上解決了o2基因?qū)τ衩鬃蚜５牟焕绊?，使o2基因在玉米育種和生產(chǎn)中得到一定的應(yīng)用[22]。除了o2基因，還有其他基因影響玉米籽粒醇溶蛋白的合成，而且在不同遺傳背景下玉米籽粒賴氨酸含量不同[10]。利用ChIP-Seq技術(shù)分析o2基因編碼蛋白的DNA結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)了1 143個基因的1 686個DNA結(jié)合位點，顯示該基因在玉米胚乳發(fā)育中具有生物學功能的多效性[23]。因此，需要從分子水平上深入研究o2基因轉(zhuǎn)錄激活的結(jié)構(gòu)基因家族的表達調(diào)控機制，以期用于改良爆裂玉米的籽粒品質(zhì)。

[1] Mertz E T,Bates L S,Nelson O E.Mutant gene that changes protein composition and increases lysine content of maize endosperm[J].Science,1964,145:279-280.

[2] Hartings H,Maddaloni M,Lazzaroni N,etal.Theo2 gene which regulates zein deposition in maize endosperm encodes a protein with structural homologies to transcriptional activators[J].EMBO J,1989,8(10):2795-2801.

[3] Schmidt R J,Burr F A,Aukerman M J,etal.Maize regulatory geneopaque-2 encodes a protein with a “l(fā)eucine-zipper” motif that binds to zein DNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1990,87(1):46-50.

[4] 郝炯，渠云芳.DNA分子標記在作物育種中的應(yīng)用[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學，2009，37(3):81-85.

[5] 田清震，李新海，李明順，等.優(yōu)質(zhì)蛋白玉米的分子標記輔助選擇 [J].玉米科學，2004，12(2):108-110.

[6] Lambert R J，Alexander D E，Dudley J W.Relative performance of normal and modified protein(opaque-2) maize hybrids[J].Crop Sci,1969,9(2):242-243.

[7] Loesch P J Jr,Foley D C,Cox D F.Comparative resistance ofopaque-2 and normal inbred lines of maize to ear-rotting pathogens[J].Crop Sci,1976,16(6):841-842.

[8] Paez A V,Helm J L,Zuber M S.Lysine content ofopaque2 maize kernels having different phenotypes[J].Crop Sci,1969,9(2):251-252.

[9] Kodrzycki R,Boston R S,Larkins B A.Theopaque-2 mutation of maize differentially reduces zein gene transcription[J].Plant Cell,1989,1(1):105-114.

[10] Zhao G,Li M,Zhang S,etal.Kernel lysine content does not increase in some maize opaque2 mutants[J].Planta,2012,235(1):205-215.

[11] 李明順，張世煌，李新海，等.優(yōu)質(zhì)蛋白玉米(QPM)選育方法和發(fā)展策略[J].玉米科學，2004，12(3):36-39.

[12] 齊建雙，鐵雙貴，孫建軍，等.opaque-2 基因?qū)Σ煌衩追N質(zhì)胚乳質(zhì)地的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學，2005(2):30-32.

[13] 劉艷陽，李玉玲，余永亮，等.爆裂玉米膨爆機理的研究進展[J].玉米科學，2007，15(2):58-60.

[14] 曾三省.爆裂玉米的品質(zhì)及其選育[J].玉米科學，1999，7(1):14-17.

[15] 潘桂娣，許燕.爆裂玉米的爆裂性及其影響因素[J].作物品種資源，1989(2):17.

[16] 饒春富，張蔭成，胡春花，等.爆裂玉米膨爆機理探討[J].新疆農(nóng)業(yè)科學，1991(4):154-158.

[17] 劉大文.爆裂玉米爆裂品質(zhì)研究[J].西南農(nóng)業(yè)學報,1998,11(2):34-39.

[18] 樓辰軍，王鵬文，王國琴.爆裂玉米研究現(xiàn)狀[J].天津農(nóng)業(yè)科學，2000，6(3):45-48.

[19] 陳火英.爆裂玉米爆裂品質(zhì)與籽粒結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究[J].上海農(nóng)學院學報，1994，12(3):157-160.

[20] 徐云碧.北京：分子植物育種[M].北京：科學出版社，2014.

[21] 李建生.玉米分子育種研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報，2007，9(2):10-13.

[22] 史慶玲，董永彬，周強，等.玉米賴氨酸相關(guān)基因opaque-2 及其修飾基因研究進展[J]. 生物技術(shù)進展，2015，5(2):109-112.

[23] Li C,Qiao Z,Qi W,etal.Genome-wide characterization of cis-acting DNA targets reveals the transcriptional re-gulatory framework ofOpaque2 in maize[J].Plant Cell,2015,27(3):532-545.

Effect ofopaque-2 Gene on Grain,Quality and Popping Characteristics of Popcorn

ZHOU Qiang,SHI Qingling,DONG Yongbin*,LI Yanwei,DENG Fei,MA Zhiyan, QIAO Dahe,LI Yuling*

(College of Agronomy,Henan Agricultural University/Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops/National Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science,Zhengzhou 450002,China)

In this study,opaque-2 (o2) gene was transferred into two popcorn inbred lines by marker-assisted selection technique,and the effects ofo2 gene on grain,quality and popping characteristics were analyzed in popcorn.The results showed that theo2 gene could be effectively transferred into popcorn inbred lines by marker-assisted selection technique.In the BC3F2population,crude protein content of popcorn witho2 gene was reduced by 0.34%—3.97% compared with that of wild type,popping volume decreased by 17.50—96.50mL,popping rate reduced by 25.00%—98.00%, popping fold decreased by 1.50—10.24 mL/g.But the other traits were less affected byo2 gene.Therefore,the crude protein content and popping characteristics were influenced significantly byo2 gene in popcorn.

popcorn;opaque-2 gene; kernel characteristics; quality; popping characteristics

2015-07-23

基因項目：河南省高等學校重點科研項目(15A210003)；河南農(nóng)業(yè)大學博士科研啟動基金項目(30600284)

周 強(1987-)，男，河南羅山人，在讀博士研究生，研究方向：玉米遺傳育種。E-mail：zhouqiang108056@163.com

*通訊作者：董永彬(1978-)，男，河南商丘人，講師，博士，主要從事玉米遺傳育種研究。E-mail：dyb0816@163.com 李玉玲(1962-)，女，河南舞陽人，教授，博士，主要從事玉米遺傳育種研究。E-mail：yuling_li@126.com

S513

A

1004-3268(2016)01-0024-05