張 沖，劉 芳，趙 東，鄧瑞廣，張改平,3，李學(xué)伍*

(1.河南科技大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 洛陽 471003； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

豬偽狂犬病毒gB和gC蛋白B細(xì)胞表位編碼序列的融合表達(dá)及活性測定

張 沖1,2，劉 芳1，趙 東2，鄧瑞廣2，張改平2,3，李學(xué)伍2*

(1.河南科技大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 洛陽 471003； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

依據(jù)豬偽狂犬病毒gB和gC蛋白的B細(xì)胞表位編碼序列，分別設(shè)計gB和gC蛋白B細(xì)胞表位編碼序列的融合擴增引物，利用融合PCR技術(shù)，將gB和gC蛋白B細(xì)胞表位編碼序列有機地融合為gB-C表位編碼序列。將融合基因片段插入到原核表達(dá)載體pET28a，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，1.0 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示，融合蛋白gB-C能夠高效表達(dá)，重組蛋白的分子質(zhì)量約為38 ku；經(jīng)Western blot鑒定分析，小鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體和PRV陽性血清均能識別表達(dá)的重組蛋白。表明成功表達(dá)了融合蛋白gB-C，且表達(dá)的重組蛋白具有較好的免疫學(xué)活性。

豬偽狂犬病毒； gB蛋白； gC蛋白； B細(xì)胞表位； 融合表達(dá)

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒(PRV)引起，造成母豬嚴(yán)重繁殖障礙以及仔豬高死亡率的傳染病。PRV感染導(dǎo)致機體免疫抑制，引起其他病原如豬圓環(huán)病毒、豬鏈球菌和豬肺炎支原體等的繼發(fā)性感染和混合感染，是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的病毒性疾病之一[1-2]。PRV 基因組為線狀雙鏈 DNA 分子，大小約為 150 kb，G+C 含量高達(dá) 73%，分子質(zhì)量約 9.5×103ku，屬線狀雙鏈DNA 病毒。糖蛋白 gB(gⅡ)、gC(gⅢ)均被定位于UL區(qū)。到目前為止，已證實 gB對病毒體內(nèi)增殖是非必需的，而 gC為病毒復(fù)制所必需[3]。在皰疹病毒中，gB蛋白既是良好的保護性抗原又是可靠的免疫檢測抗原。gB蛋白由gBa、gBb和gBc 3個糖蛋白通過二硫鍵共價連結(jié)而成。gBb、gBc由gBa剪切而來；gB蛋白通常包含2個gBb和2個gBc分子。gBc、gBb存在多個結(jié)構(gòu)表位和線性表位[4-5]。gB蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能中和病毒阻止感染傳代細(xì)胞，gB蛋白免疫的小鼠能夠抵抗PRV的攻擊免受病毒的感染。gC蛋白也是PRV的重要功能蛋白質(zhì)之一，廣泛存在于PRV囊膜表面[6]，gC蛋白能夠與宿主細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白(HS)結(jié)合，從而啟動病毒對細(xì)胞的侵入，病毒囊膜與細(xì)胞膜融合始于gC蛋白與HS的結(jié)合[7]。gC蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體主要識別HS結(jié)合區(qū)域內(nèi)的B細(xì)胞表位[8]。gC蛋白單抗能夠體外中和病毒，同時也能保護小鼠和豬免受病毒感染[9]。因此，gC蛋白的B細(xì)胞表位也可用于亞單位疫苗的制備。gB、gC的中和抗體水平是評價免疫保護效率的重要指標(biāo)之一。目前，基于PRV融合中和抗體的診斷試劑的研究較少，為此，本研究利用融合PCR技術(shù)將gB和gC片段融合(命名為gB-C)，并利用基因工程方法原核表達(dá)gB-C重組融合蛋白，為豬群免疫水平檢測及亞單位疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、載體及毒株 大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生物公司，pMD19-T vector購自寶生物工程(大連)有限公司。PK-15細(xì)胞、PRV毒株、表達(dá)載體pET28a、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均由農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、LATaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶2×GC Buffer、BamHⅠ、HindⅢ、dNTP均購自寶生物工程(大連)有限公司。PRV陽性血清、His標(biāo)簽抗體(一抗)、羊抗豬IgG(二抗)均由農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點實驗室保存。

1.1.3 引物設(shè)計 依據(jù)GenBank中PRV BJ/YT株gB和gC蛋白B細(xì)胞表位編碼序列設(shè)計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列為gB-C-P1:5′-CCGGGATCCCTTTGGCCTGCTCCACACCACGCTG-3′；gB-C-P2:5′-GCTCGCCCGC-GCTGCTGTTGCCGCCGGACGGCGGCGGGCAGACGT-AGAAGC-3′;gB-C-P3:5′-CCGGGATCCGGCGGCAACAGCAGCGCGGGCGAGC-3′；gB-C-P4:5′-CCCAAGCTTCTATTAGCGCGGGGGCTCGTCAA-AGTACTCG-3′。融合擴增片段長度為708 bp。

1.2 方法

1.2.1 PRV病毒基因組的提取 PK-15細(xì)胞形成單層后棄去生長液,接種200 μL PRV病毒液，在吸附2 h后加維持液，當(dāng)70%細(xì)胞出現(xiàn)病變和脫落后，收集全部細(xì)胞培養(yǎng)物。在500 μL細(xì)胞培養(yǎng)物中，加入6 μL蛋白酶K、94 μL 10% (m/V)SDS，混勻，55 ℃加熱30 min；接著將等體積酚-氯仿加入，顛倒混勻，12 000 r/min離心5 min；收集上清，再加入等體積氯仿，混勻，12 000 r/min離心5 min；將上清收集并加入2倍體積冷乙醇顛倒混勻，-20 ℃靜置 10～20 min，12 000 r/min離心10 min；用70%的乙醇將沉淀洗滌1次，放到超凈臺使殘留乙醇揮發(fā)干凈；用25 μL含RNase (20 μg/mL)的滅菌去離子水溶解，盡快使用或置于-20 ℃條件下保存。

1.2.2 PRV病毒基因組的鑒定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]合成如下引物，用來鑒定偽狂犬病毒，p1:5′-CACGGAGGACGAGCTGGGGCT-3′;p2:5′-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3′。以病毒DNA作為模板，鑒定PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ExTaq預(yù)混酶10 μL，ddH2O 7 μL。擴增程序為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s， 31個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3gB-C融合表位編碼序列制備 以提取的病毒DNA為模板，利用引物gB-C-P1、gB-C-P2進行g(shù)B糖蛋白B細(xì)胞表位編碼序列的PCR擴增，利用引物gB-C-P3、gB-C-P4進行g(shù)C糖蛋白B細(xì)胞表位編碼序列的PCR擴增。反應(yīng)體系為20 μL：模板DNA 1 μL，LATaq酶0.2 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×GC Buffer 10 μL，dNTP 1 μL，ddH2O 6.8 μL?；靹蚝笾肞CR擴增儀中，95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，69 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用上述方法分別獲得gB和gC糖蛋白B細(xì)胞表位編碼序列。取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果并進行回收。然后將相同摩爾數(shù)的片段gB和gC混合為模板，上、下游引物分別為gB-C-P1、gB-C-P4，進行融合擴增獲得糖蛋白B細(xì)胞表位融合編碼序列。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，69 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果并進行回收。

1.2.4 pMD19T-gB-C重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將回收的DNA片段與PMD19-T載體16 ℃過夜連接，將10 μL連接產(chǎn)物加入到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30 min；42 ℃熱休克90 s，迅速置冰上3 min，隨后加入1 ml LB培養(yǎng)液，37 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。3 000 r/min離心3 min，棄上清，留200 μL懸浮細(xì)胞沉淀，涂布含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)，進行雙酶切及質(zhì)粒PCR鑒定，構(gòu)建pMD19T-gB-C重組質(zhì)粒。

1.2.5 表達(dá)載體的構(gòu)建 將陽性質(zhì)粒pMD19T-gB-C和表達(dá)載體pET28a分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，將酶切回收后的目的片段和表達(dá)載體用T4 DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，構(gòu)建質(zhì)粒pET-28a-gB-C。對pET-28a-gB-C進行質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定。將鑒定為陽性的pET-28a-gB-C菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

1.2.6 誘導(dǎo)表達(dá) 將測序鑒定正確的重組陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑菌斑過夜培養(yǎng)，取重組菌液100 μL 接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的100 mL LB培養(yǎng)液中，在溫度37 ℃、230 r/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)至OD600為0.6～1.0，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，24 ℃誘導(dǎo)表達(dá)8 h。

1.2.7 表達(dá)產(chǎn)物的檢測

1.2.7.1 SDS-PAGE電泳 配置12%的分離膠。取誘導(dǎo)表達(dá)菌液1 mL于1.5 mL 離心管內(nèi)，12 000 r/min離心2 min。棄上清，用200 μL PBS重懸，加入50 μL 5×Buffer(用前加熱)。放入浮漂中，煮沸5 min后，12 000 r/min離心2 min。將未誘導(dǎo)的重組菌作為對照。取20 μL上清上樣至電泳槽內(nèi)，電泳后放入考馬斯亮藍(lán)染色液中染色3 h，然后脫色觀察。

1.2.7.2 Western blot檢測 取NC膜，剪成比蛋白膠稍大的長方形，之后按照濾紙→NC膜→SDS膠→濾紙的順序放入電轉(zhuǎn)儀(膜與膜之間無氣泡)，15 V電轉(zhuǎn)1 h。電轉(zhuǎn)后的NC膜用5%的脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，依次加入一抗、二抗進行處理，最后用AEC顯色方法進行顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

提取偽狂犬病毒DNA，以此為模板，應(yīng)用特異性引物PCR擴增，將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈光下觀察，可見PCR擴增出的片段大小約為217 bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。

M:DNA Marker； 1:正常細(xì)胞DNA 模板擴增；2：病毒培養(yǎng)物DNA 模板擴增圖1 PRV DNA模板PCR鑒定

以提取的病毒DNA為模板，利用引物gB-C-P1、gB-C-P2進行擴增，獲得了與設(shè)計大小(346 bp)一致的gB蛋白B細(xì)胞表位編碼序列的特異條帶(圖2)。利用引物gB-C-P3、gB-C-P4進行擴增獲得387 bp的gC蛋白B細(xì)胞表位編碼序列的特異性條帶(圖3)。以擴增出的gB、gC表位編碼序列片段為模板，利用引物gB-C-P1、gB-C-P4對其進行融合擴增，獲得了與預(yù)計大小一致的708 bp的gB-C蛋白B細(xì)胞表位融合編碼序列的特異條帶(圖4)。

M：DNA Marker;1：gB蛋白B細(xì)胞表位編碼序列擴增片段圖2 gB蛋白B細(xì)胞表位編碼序列擴增結(jié)果

M：DNA Marker;1：gC蛋白B細(xì)胞表位編碼序列擴增片段圖3 gC蛋白B細(xì)胞表位編碼序列擴增結(jié)果

M：DNA Marker; 1：gB-C融合蛋白B細(xì)胞表位編碼序列片段圖4 gB-C融合蛋白B細(xì)胞表位編碼序列擴增結(jié)果

2.2 pET-28a-gB-C的鑒定結(jié)果

2.2.1 酶切鑒定 對重組質(zhì)粒pET-28a-gB-C用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切后,經(jīng)瓊脂糖電泳可見目的條帶708 bp 和載體條帶5 900 bp，與預(yù)計的一致(圖5)。

M：DNA Marker; 1：pET-28a-gB-C質(zhì)粒圖5 pET-28a-gB-C質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.2.2 PCR鑒定 以初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒為模板,用引物gB-C-P1、gB-C-P4按上述擴增條件進行PCR擴增，擴增出了大小約700 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖6)。

M：DNA Marker;1：gB-C編碼序列片段圖6 pET-28a-gB-C質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

2.2.3 序列測定 將陽性重組質(zhì)粒進行序列分析，插入的基因閱讀框架無誤，測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致(測序圖表略)。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

2.3.1 SDS-PAGE鑒定 重組陽性菌用IPTG在24 ℃誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的重組菌比未誘導(dǎo)重組菌多出1條分子質(zhì)量大小約38 ku的目的蛋白條帶，與融合蛋白預(yù)期大小一致(圖7)。由此證明，融合的目的蛋白在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)。

M：預(yù)染Marker；1：pET-28a-gB-C未誘導(dǎo)組； 2：pET-28a-gB-C誘導(dǎo)組圖7 gB-C融合蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果

2.3.2 Western blot分析 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到NC膜上進行免疫印跡分析。結(jié)果顯示，在約38 ku大小的位置出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶(圖8)。結(jié)果證實，表達(dá)的融合表位能夠被陽性血清識別。

M：預(yù)染Marker； 1：陽性血清誘導(dǎo)結(jié)合組； 2：陽性血清未誘導(dǎo)結(jié)合組； 3：His標(biāo)簽蛋白誘導(dǎo)結(jié)合組； 4：His標(biāo)簽蛋白未誘導(dǎo)結(jié)合組圖8 gB-C融合蛋白的Western blot鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

豬偽狂犬病對我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展造成了極大威脅，豬群病毒凈化、提高免疫密度和免疫強度、定期檢測豬群的免疫水平，是目前控制此病的有效方法，其中免疫監(jiān)測尤為重要[10-15]。本試驗將PRVgB、gC表位基因應(yīng)用融合PCR技術(shù)連接，采用李敏等[16]的一步融合PCR方法不能得到預(yù)期的融合片段，而應(yīng)用Davidson等[17]兩步 PCR方法，獲得融合基因gB-C。將融合的gB-C基因片段克隆到原核表達(dá)載體pET28a，采用大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)， IPTG濃度由0.2 mmol/L升高至1.0 mmol/L，誘導(dǎo)溫度由37 ℃降低至24 ℃，誘導(dǎo)時間由2 h提高至8 h，得到的目的蛋白能夠識別PRV陽性血清，表明該蛋白具有較好的免疫學(xué)活性。

本研究將gB、gC糖蛋白B細(xì)胞表位進行融合克隆表達(dá)，獲得了高純度的檢測抗原，提高了抗體檢測的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性，為制備用于PRV抗體檢測的試紙條和ELISA檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

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Fusion Expression and Activity Detection of Porcine Pseudorabies Virus gB and gC Glycoprotein B-cell Epitope Coding Sequences

ZHANG Chong1,2,LIU Fang1,ZHAO Dong2,DENG Ruiguang2,ZHANG Gaiping2,3,LI Xuewu2*

(1.College of Animal Science and Technology,Henan Science and Technology University,Luoyang 471003,China; 2.Henan Provincial Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 3.College of Veterinary Medicine and Animal Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

According to PRV B cell epitope sequences of the gB and gC protein，the fusion primers were designed respectively.Using the fusion PCR technology,the gB-Cwas fused by the B cell epitope sequences of the gB and gC protein.Then the gB-Cwas inserted into the pET28a.The recombinant plasmid was transformed intoE.coli(BL21).TheE.coli(BL21)expressed the recombinant protein which was induced with 1 mmol/L IPTG.The result of SDS-PAGE showed that the gB-C was expressed successfully.The molecular weight of the recombinant protein was 38 ku.The result of Western blot showed that the recombinant gB-C protein could be recognized by His-tag mouse Mcab and PRV porcine positive serum.In this research,the recombinant gB-C protein was expressed successfully and the recombinant protein had a good immunological activity.

PRV; gB protein; gC protein; B-cell epitope; fusion expression

2015-07-10

國家自然科學(xué)基金項目(31172348)

張 沖(1989-)，男，河南新鄉(xiāng)人，在讀碩士研究生，研究方向：分子病原學(xué)和免疫學(xué)。E-mail：421986388@qq.com

*通訊作者：李學(xué)伍(1964-)，男，河南通許人，研究員，博士，主要從事動物病原學(xué)和免疫學(xué)研究。 E-mail：lixuewu2002@126.com

S855.3

A

1004-3268(2016)01-0119-05