王安平，朱善元，吳 雙，王永娟，左偉勇，洪偉鳴

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院/江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300)

鴨新城疫病毒M基因的原核表達(dá)與多抗制備

王安平，朱善元*，吳 雙，王永娟，左偉勇，洪偉鳴

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院/江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300)

為制備鴨源新城疫病毒M蛋白的多克隆抗體，根據(jù)鴨新城疫病毒M基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，RT-PCR方法擴(kuò)增出M基因，克隆入原核表達(dá)載體pET-30a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在IPTG的誘導(dǎo)下成功表達(dá)重組蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白分子質(zhì)量約為39 ku。將目的蛋白切膠免疫ICR小鼠，制備重組蛋白的多抗血清，Western blot分析顯示，制備的多抗血清能與鴨新城疫病毒感染的SPF雞胚尿囊液總蛋白發(fā)生特異反應(yīng)。以上結(jié)果表明，M基因在大腸桿菌中獲得了成功表達(dá)，且制備的鼠多抗血清可以用于M蛋白的檢測(cè)。

鴨新城疫病毒；M基因； 原核表達(dá)； 多抗

新城疫俗稱亞洲雞瘟、偽雞瘟，是由新城疫病毒(NDV)強(qiáng)毒株引起的侵害雞、火雞等250多種禽類的一種急性、高度接觸性傳染病，主要特征是病禽呼吸困難、高熱、下痢、神經(jīng)機(jī)能紊亂、黏膜和漿膜出血[1-3]。以往認(rèn)為NDV不會(huì)引起水禽致病，自1997年王永坤等[4]報(bào)道從病鵝體內(nèi)分離到了NDV強(qiáng)毒株，NDV對(duì)水禽不致病之說(shuō)被打破。近年來(lái)，鴨、鵝等水禽感染NDV并發(fā)病的報(bào)道越來(lái)越多，給我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的損失也越來(lái)越嚴(yán)重[5-7]。

NDV是單股負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA病毒，基因組編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核衣殼蛋白(NP)、膜蛋白(M)、磷酸化蛋白(P)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)、融合蛋白(F)和大分子蛋白(L)。其中，M蛋白是NDV囊膜上除F、HN蛋白之外的蛋白質(zhì)，由364個(gè)氨基酸殘基組成，是非糖基化膜相關(guān)蛋白，具有疏水性，但不是跨膜蛋白，位于病毒囊膜內(nèi)側(cè)面，一部分鑲嵌在囊膜內(nèi)，另一部分與核衣殼相互作用，構(gòu)成囊膜的支架。研究報(bào)道，M蛋白不僅在病毒的裝配中發(fā)揮重要作用，而且在調(diào)節(jié)病毒RNA合成、抑制宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答等方面也扮演著重要角色[8-9]。目前，關(guān)于鴨NDV的研究主要集中在F、NP蛋白新型疫苗的開(kāi)發(fā)等方面，而關(guān)于M蛋白在NDV致病性和免疫原性中的作用研究尚不多見(jiàn)。本研究利用pET原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)鴨NDV的M基因，切膠純化重組蛋白，免疫小鼠制備其多抗血清，為進(jìn)一步研究M蛋白的免疫原性及相關(guān)試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 毒株、菌株和載體

鴨NDV強(qiáng)毒株由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈(zèng)；9日齡SPF雞胚購(gòu)于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院國(guó)家水禽基因庫(kù)；pET-30a載體、大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 酶和相關(guān)試劑

Trizol試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ和T4 DNA連接酶購(gòu)于Fermentas公司；His組氨酸單抗、HRP-羊抗鼠IgG、DAB顯色試劑盒購(gòu)于康為世紀(jì)公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)于愛(ài)思進(jìn)公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中公布的鴨NDV病毒基因組序列，設(shè)計(jì)了1對(duì)針對(duì)M基因序列的引物，并在上游引入NdeⅠ酶切位點(diǎn)，下游引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為M-F: 5′-GACCATATGGACTCATCCAGGACAATCGG-3′(下劃線為NdeⅠ酶切位點(diǎn))；M-R:5′-GCGCTCGAGTTATTTCCTGAAAGGATTG-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。

1.4 病毒的增殖與RNA的提取

將NDV原代病毒10倍稀釋后，取0.2 mL接種于9日齡SPF雞胚尿囊腔，38 ℃孵化箱孵化。剔除24 h內(nèi)死亡的雞胚，選擇48～72 h死亡的雞胚，置于4 ℃過(guò)夜，收集尿囊液。按Trizol法抽提尿囊液總RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5M基因的擴(kuò)增和測(cè)序

根據(jù)Invitrogen公司的RT-PCR試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，10 min；42 ℃，90 min；70 ℃，10 min。 PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；然后95 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 重組質(zhì)粒載體pET-M的構(gòu)建

將PCR 產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離后，參照DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)切膠回收目的條帶，然后經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切回收后，與同樣經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ酶切的pET-30a連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在含100 μg/mL卡那霉素(Kan)的LB 瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取單菌落，提取質(zhì)粒，電泳篩選出疑似菌落，進(jìn)一步用NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-M。

1.7 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-M轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，挑取單菌落接種于新鮮的含Kan抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng)過(guò)夜，次日按 1∶100 的比例轉(zhuǎn)接至5 mL含Kan的 LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值達(dá)0.6～0.8，加入 IPTG 至終濃度在0.2～1.0 mmol/L，37 ℃ 繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3～5 h，離心收集菌體，沉淀溶于適量PBS中，超聲波裂解后離心，分別收集上清及沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析。以相同條件下誘導(dǎo)含pET-30a空載體的菌液作為空白對(duì)照。

1.8 重組蛋白抗血清的制備

將重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，1 mol/L KCl染色，切出目的條帶，加入適量PBS研磨均勻，以皮下兩點(diǎn)注射法免疫8周齡ICR小鼠，每隔2周注射1次，4次免疫后第10天采血，分離血清，至-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 多抗血清的Western blot 鑒定

將鴨NDV雞胚尿囊液進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%的脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜，以制備的鼠多抗血清作為一抗，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠為二抗，DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色。同時(shí)以未接種NDV雞胚尿囊液作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1M基因的克隆及重組質(zhì)粒pET-M酶切鑒定

以提取的尿囊液總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增出約1 100 bp的目的條帶，與理論值相符。重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切后獲得約1 100 bp和5 400 bp 2個(gè)條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符，且進(jìn)一步的測(cè)序結(jié)果表明，克隆的M基因序列(1 095 bp)及閱讀框完全正確。

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)

將pET-M重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，并以空載體轉(zhuǎn)化菌作為陰性對(duì)照。結(jié)果表明，重組蛋白的分子質(zhì)量約為39 ku(圖2)，并均以包涵體形式存在。

M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1:pET-M的NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切； 2:M基因PCR產(chǎn)物圖1 M基因克隆及重組質(zhì)粒pET-M的酶切鑒定結(jié)果

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1:E.coli/pET-30a IPTG誘導(dǎo)； 2:E.coli/pET-M IPTG誘導(dǎo)圖2 M重組蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果

2.3 多抗血清的Western blot鑒定

以純化的融合蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物免疫ICR小鼠，制備M蛋白的多抗血清，獲得的血清能與NDV雞胚尿囊液反應(yīng)，條帶大小約為39 ku(圖3)，與M蛋白大小相符。

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1:NDV尿囊液; 2:SPF雞胚正常尿囊液圖3 M蛋白多抗血清的Western blot 鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

M蛋白是NDV中除HN和F蛋白之外的又一重要致病因子，是病毒粒子的包裝中必不可少的成分[10-11]。目前，對(duì)鴨NDV的研究多集中于F和HN蛋白，對(duì)M蛋白的免疫原性及在病毒復(fù)制和致病性中的作用研究還不多見(jiàn)，利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)M蛋白進(jìn)行體外表達(dá)和多抗制備，對(duì)深入研究M蛋白的功能和NDV的致病性具有重要意義。相對(duì)于繁瑣的病毒純化來(lái)講，利用成熟的原核表達(dá)系統(tǒng)獲得病毒蛋白相對(duì)比較容易簡(jiǎn)便。pET表達(dá)系統(tǒng)是目前使用較為廣泛的一種原核表達(dá)系統(tǒng)，在誘導(dǎo)狀態(tài)下宿主菌內(nèi)幾乎所有的資源都可以轉(zhuǎn)向目的基因的表達(dá)，外源基因的表達(dá)量一般可以達(dá)到菌體總蛋白的30%以上。本試驗(yàn)用pET-30a表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了鴨NDV M蛋白，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出完整的M基因，序列分析表達(dá)克隆的M基因長(zhǎng)為1 095 bp， SDS-PAGE電泳和Western blot分析證明，表達(dá)的融合蛋白分子質(zhì)量約為39 ku，與預(yù)期結(jié)果相符，說(shuō)明表達(dá)的重組蛋白大小正確。

pET原核系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白缺少翻譯后加工功能，但表達(dá)產(chǎn)物依舊保持了良好的免疫原性。本試驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，利用表達(dá)的融合蛋白經(jīng)KCl染色切膠純化后，免疫小鼠制備了針對(duì)重組蛋白的多抗血清，Western blot分析說(shuō)明，制備的多抗血清可與NDV尿囊液中的M蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，充分說(shuō)明制備的多抗血清具有良好的反應(yīng)特異性，可以作為檢測(cè)用抗體進(jìn)一步用于NDV M抗原的檢測(cè)及功能研究。下一步有必要將目的蛋白進(jìn)行純化，并切除標(biāo)簽蛋白，以增強(qiáng)抗原及制備抗體的特異性。

[1] 于曉磊,涂軍,余明華,等.左旋咪唑?qū)π鲁且呋钜呙缑庖咝Ч挠绊慬J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2014(2):280,285.

[2] 楊金興,朱瑞良.山東地區(qū)新城疫病毒分離株的分離鑒定及其F基因的分子特性分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2013,28(2):231-234.

[3] 杜風(fēng)蘭,許國(guó)賓.雞大腸桿菌病和新城疫混合感染的診斷與防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2014(22):265-266.

[4] 王永坤,田慧芳,周繼宏,等.鵝副粘病毒病的研究[J].中國(guó)家禽,1998,20(4):3-5.

[5] 李世江,趙忠民,劉紅娟,等.鴨副粘病毒病的診治[J].中國(guó)動(dòng)物保健,2003,53(7):51.

[6] 何永強(qiáng),洪健,吳舊生,等.致麻鴨產(chǎn)蛋下降的副粘病毒的分離和鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2005,25(3):238-240.

[7] 張耀成,朱漢華.鴨副粘病毒與鴨疫里默氏桿菌混合感染的診治[J].禽病防制,2005,22(5):28.

[8] Kho C L,Tan W S,Yusoff K.Production of the nucleocapsid protein of newcastle disease virus inEscherichiacoliand its assembly of into ring-like and nucleocapsid-like particles[J].Journal of Microbiology,2001,39(4):293-299.

[9] Makkay A M,Krell P J,Nagy E.Antibody detection-based differential elisa for NDV-infected or vaccinated chickens versus NDV HN-subunit vaccinated chickens[J].Veterinary Microbiology,1999,66(3):209-222.

[10] Homer D P,Lori W M,Mark E P,etal.Requirements for the assembly and release of Newcastle disease virus-like particles[J].Journal of Virology,2006,80(22):11062-11073.

[11] 程相朝,李慧琴,吳庭才.新城疫病毒的一般生物學(xué)特性及其治病的分子基礎(chǔ)[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2005(1):61-63.

Prokaryotic Expression and Antiserum Preparation of theMGene of Duck NDV

WANG Anping,ZHU Shanyuan*,WU Shuang,WANG Yongjuan,ZUO Weiyong,HONG Weiming

(Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College/Jiangsu Province Key Laboratory of Veterinary Bio-pharmaceutical High-tech Research,Taizhou 225300,China)

In order to express M protein of duck-origin Newcastle disease virus and prepare polyclonal antibodies,according to the genome sequences of duck NDV,one pair of specific primers was designed.TheMgene was amplified by RT-PCR,and then was cloned into prokaryotic expression vector pET-30a,and the recombinant plasmids were transformed into BL21(DE3)E.coli.Then the recombinant proteins were successfully expressed following IPTG induction,SDS-PAGE showed that the approximate molecular weight of recombinant expression proteins was 39 ku.The antiserum against the recombinant proteins were produced by immunized ICR mouse with recombinant proteins.Western blot results showed that the antiserum could react specifically with NDV allantoic fluid.These results showed thatMgene was successfully expressed inE.coli,and the antiserum could be used for detection of M proteins,and these lay the foundation for the development of detection kit.

duck NDV;Mgene; prokaryotic expression; antiserum

2015-07-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302096);江蘇省農(nóng)業(yè)支撐項(xiàng)目(BE2013415);江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(NY-009)

王安平(1980-)，女，江蘇泰州人，副教授，博士，主要從事獸用生物制藥方面的研究。E-mail:wap4017@163.com

*通訊作者：朱善元(1968-)，男，江蘇泰州人，教授，博士，主要從事分子生物學(xué)方面的研究。E-mail：jstzzsy@126.com

S855.3

A

1004-3268(2016)01-0124-03