李盈輝，王 青，徐彥召，孫林霞，張慶帥，徐亞茹，田 柳

(河南科技學院 動物科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

豬Tetherin基因的克隆及序列分析

李盈輝，王 青，徐彥召*，孫林霞，張慶帥，徐亞茹，田 柳

(河南科技學院 動物科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

為研究豬Tetherin基因的功能，應(yīng)用RT-PCR手段從感染豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的豬肺臟組織擴增得到豬源Tetherin基因，將其克隆到pMD19-T載體并進行測序，采用分子生物學軟件將其編碼的蛋白質(zhì)序列與其他來源的Tetherin蛋白序列進行比對分析，采用真核轉(zhuǎn)染的方法研究其在MARC-145細胞中的定位情況。結(jié)果顯示，克隆得到的豬源Tetherin基因全長534 bp；豬源Tetherin蛋白與牛、綿羊、貓、人、黑猩猩、貓頭鷹、獼猴Tetherin蛋白同源性分別為41.5%、44.1%、42.3%、43.7%、45.4%、35.6%、42.1%； 豬源Tetherin蛋白為跨膜蛋白，該蛋白定位在MARC-145細胞的細胞膜中。

豬；Tetherin基因； 序列分析

Tetherin蛋白，又稱為CD317或BST-2，1995年最早從類風濕性關(guān)節(jié)炎骨髓液細胞系中克隆成功，研究發(fā)現(xiàn)，Tetherin蛋白在人骨髓瘤細胞中表達量極高，同時在終末分化的B細胞、T細胞、骨髓基質(zhì)細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等與免疫相關(guān)的細胞，以及某些受到病毒感染的腫瘤細胞中均有表達[1-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Tetherin蛋白具有調(diào)節(jié)機體免疫細胞生長發(fā)育(如B細胞生長發(fā)育)和抗病毒的功能。研究者最早在人的艾滋病病毒(HIV)上證實了Tetherin蛋白具有抗病毒功能，Tetherin蛋白能夠?qū)滩〔《绢w粒粘附在母細胞的外膜上，阻止病毒繼續(xù)感染相鄰的靶細胞，進而阻止艾滋病病毒的擴散[5-8]。隨后研究者進一步證實，Tetherin蛋白還可以抑制卡波氏肉瘤病毒(KSHV)、Ebola病毒、Lassa病毒和Marburg病毒等有包膜病毒的釋放，進而發(fā)揮抗病毒功能[9-11]。

目前，關(guān)于人類Tetherin基因的研究較多[5-12]，而關(guān)于豬源Tetherin基因的研究尚未見報道。為此，本研究依據(jù)已發(fā)表的人源Tetherin基因序列，設(shè)計特異性引物，通過RT-PCR方法獲得了豬源Tetherin基因，分析了豬源Tetherin蛋白與其他來源Tetherin蛋白的差異性，并初步驗證了其在MARC-145細胞中的分布情況，旨在為進一步研究Tetherin蛋白的生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 載體、菌種和試劑

大腸埃希菌感受態(tài)細胞(K12)、MARC-145細胞、pEGFP-C3載體均由河南科技學院預防獸醫(yī)學實驗室自制和保存；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、rTaq酶、dNTP、T4 DNA 連接酶、pMD19-T載體、DL2000 DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司；RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司(美國)；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶消化液、氨芐青霉素購自索萊寶生物科技有限公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自O(shè)MEGA公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 豬源Tetherin基因的克隆 按RNA提取試劑盒說明書從感染豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的豬肺臟組織(來源于新鄉(xiāng)市輝縣某豬場送檢的病料)細胞中提取總RNA。依據(jù)M-MLV產(chǎn)品說明書，以隨機引物Oligo(dT)為反轉(zhuǎn)錄引物合成PCR擴增的第一鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄過程的反應(yīng)體系：總RNA 21 μL，Oligo(dT)隨機引物(50 μmol/L)2 μL，dNTP(10 mmol/L) 4 μL，RNase inhibitor 1 μL(20 U)，M-MLV 4 μL(10 U)，加5×M-MLV Buffer 8 μL，總反應(yīng)體系為40 μL。反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序為：42 ℃ 水浴1 h，95 ℃ 滅活 5 min，4 ℃保存，作為下一步PCR反應(yīng)的模板。根據(jù)GenBank中已公布的Tetherin基因序列(NM_001161755)設(shè)計特異性擴增引物，上游引物(PIG-TE-UP):5′-ATGAATTCATGTCACCTAGTTTGTATTCC-3′，其下劃線的序列為EcoR Ⅰ酶切位點；下游引物(PIG-TE-DP):5′-TTCTCGAGTCAGGTCAGCAGGGCA-TTGAG-3′，其下劃線的序列為XhoⅠ酶切位點。豬源Tetherin基因的PCR擴增反應(yīng)體系為：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物11 μL，上、下游引物(PIG-TE-UP/DP)(10 μmol/L)各2 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 4 μL，10×Buffer 5 μL，rTaq酶(2 U/μL) 1 μL，滅菌雙蒸水25 μL，共計50 μL。PCR的反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察PCR產(chǎn)物電泳條帶的大小以及特異性。隨后參照OMEGA公司的膠回收試劑盒說明書純化回收Tetherin基因片段。

1.2.2 克隆載體的構(gòu)建 將純化好的Tetherin基因片段與pMD19-T載體連接，連接體系為：PCR純化產(chǎn)物7 μL，pMD19-T載體 1 μL，10×T4 DNA連接酶Buffer 1 μL，T4 DNA連接酶1 μL，于16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至K12感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜。經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選和菌液PCR方法進行鑒定，提取鑒定為陽性的菌液質(zhì)粒并將其送往生工生物(上海)股份有限公司測序鑒定，并將陽性質(zhì)粒命名為pMD-Te。

1.2.3 豬源Tetherin蛋白的生物信息學分析 用DNASTAR和MEGA 5.0軟件分析上述豬源Tetherin蛋白序列，用于比對的參考序列包括Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫上發(fā)表的牛、綿羊、貓、人、黑猩猩、貓頭鷹及獼猴源Tetherin蛋白；運用在線的序列跨膜區(qū)預測軟件TMHMM Server V.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測豬源Tetherin蛋白的跨膜區(qū)位置。

1.2.4 豬源Tetherin蛋白在MARC-145細胞中的表達 將獲得的豬源Tetherin基因通過分子生物學手段克隆至真核表達載體pEGFP-C3中，經(jīng)PCR擴增、雙酶切鑒定正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MARC-145細胞驗證其在細胞中的表達情況，具體轉(zhuǎn)染步驟和方法參見文獻[13]。轉(zhuǎn)染48 h后，將細胞置于熒光顯微鏡下觀察其表達情況及在MARC-145細胞中的定位情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬源Tetherin基因的RT-PCR擴增結(jié)果

根據(jù)GenBank中已公布的Tetherin基因序列(NM_001161755)，通過RT-PCR方法克隆豬源Tetherin基因(圖1)。經(jīng)電泳分析，得到了大小約為500 bp的片段。

M.DNA標準DL2000； 1.Tetherin基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物圖1 Tetherin基因的RT-PCR擴增

2.2 重組載體的鑒定結(jié)果

運用PCR和雙酶切(EcoR Ⅰ和XhoⅠ)方法對構(gòu)建好的克隆載體pMD-Te進行鑒定，結(jié)果表明，該載體中含有符合預期大小的目的條帶(圖2)，經(jīng)測序鑒定，所得到的豬源Tetherin基因全長534 bp，共編碼177個氨基酸。

M.DNA標準DL2000； 1.重組質(zhì)粒pMD-Te雙酶切鑒定； 2.重組質(zhì)粒pMD-Te的PCR鑒定圖2 重組質(zhì)粒pMD-Te的鑒定

2.3 豬源Tetherin蛋白的生物信息學分析

將擴增到的豬源Tetherin基因序列翻譯成蛋白質(zhì)序列，并與Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫上近年來發(fā)表的牛、綿羊、貓、人、黑猩猩、貓頭鷹、獼猴源Tetherin蛋白進行比較(圖3)，結(jié)果顯示：豬源Tetherin蛋白序列與上述來源的Tetherin蛋白序列的同源性分別為41.5%、44.1%、42.3%、43.7%、45.4%、35.6%、42.1%。且不同來源的Tetherin蛋白長度也不相同，其中以貓頭鷹的Tetherin蛋白最長(含有191個氨基酸)，羊的Tetherin蛋白最短(含有156個氨基酸)。豬Tetherin蛋白比羊源Tetherin蛋白多21個氨基酸，但比其他來源的Tetherin蛋白均短。

對豬源Tetherin蛋白的跨膜區(qū)預測結(jié)果顯示，Tetherin蛋白為跨膜蛋白，其中27—49位和154—176位氨基酸為其跨膜區(qū)所在位置，1—26位氨基酸為其胞外區(qū)，50—153位氨基酸為其胞內(nèi)區(qū)(圖4)。

圖4 Tetherin蛋白的跨膜區(qū)預測

2.4 豬源Tetherin蛋白在MARC-145細胞中的表達

由圖5可以看出，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞在熒光顯微鏡下顯示出綠色熒光，且熒光主要分布于轉(zhuǎn)染細胞的細胞膜上，而轉(zhuǎn)染空載體的細胞中熒光分布均勻。

A．轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的MARC-145細胞；B.轉(zhuǎn)染空載體的MARC-145細胞圖5 Tetherin蛋白在MARC-145細胞中的定位

3 結(jié)論與討論

本研究成功克隆了豬源Tetherin基因(534 bp)，編碼177個氨基酸，比羊源Tetherin蛋白多21個氨基酸，但比其他來源的Tetherin蛋白均短。同源性分析顯示，豬源Tetherin蛋白與其他來源的Tetherin蛋白同源性約為40%，這表明不同來源的Tetherin蛋白同源性較低。這種氨基酸序列上的差異可能是由于該蛋白在進化過程中正向選擇的結(jié)果。分析發(fā)現(xiàn)，不同來源的Tetherin蛋白之間存在著保守的氨基酸位點，如亮氨酸(L)、天冬酰胺(N)、絲氨酸(S)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)及丙氨酸(A)等，這些保守的氨基酸位點可能與其發(fā)揮生物學功能直接相關(guān)[4,14]。因此，今后針對豬源Tetherin蛋白功能的研究可以圍繞這些保守的位點開展。

Tetherin蛋白的抗病毒生物學功能主要是通過其膜定位的特性得以實現(xiàn)。本研究初步證明了豬源Tetherin蛋白的膜定位特性，為進一步研究Tetherin蛋白對動物源性病毒的作用以及開發(fā)動物抗病毒藥物奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and Sequence Analysis of SwineTetherinGene

LI Yinghui,WANG Qing,XU Yanzhao*,SUN Linxia,ZHANG Qingshuai,XU Yaru,TIAN Liu

(Department of Animal Science，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，China)

In order to study the function ofTetheringene,theTetheringene was detected in swine lung tissue cells which were infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus by the method of RT-PCR.The obtained fragment was ligated into pMD19-T vector and sequenced.The sequences of Tetherin protein was analyzed and predicted by bioinformatics.And the localization was verified in MARC-145 cells.The result showed that the full-length gene ofTetherinwas successfully cloned,which contained 534 base pairs(bp).Sequence analysis showed 41.5% identity with bovine,44.1% with sheep,42.3% with cat,43.7% with human,45.4% with chimpanzee,35.6% with owl,42.1% with macaque.Secondary structure prediction and location assay in MARC-145 cells showed that this protein was a transmembrane protein.

porcine;Tetheringene; sequence analysis

2015-07-28

2013年地方高校國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310467050)

李盈輝(1993-)，男，河南商丘人，在讀本科生，研究方向：分子病原學與免疫學。

*通訊作者：徐彥召(1984-)，男，河南許昌人，講師，博士，主要從事分子病原學與免疫學研究。E-mail:haoxyz@163.com

S855.3

A

1004-3268(2016)01-0131-04