陳俊峰，王 璟，張家慶，高 翔，白獻(xiàn)曉，任巧玲，

高彬文1，馬 強(qiáng)1，郭紅霞1，邢寶松1*

(1．河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002； 2．鄭州市獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450052)

豬脂肪組織酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建及質(zhì)量鑒定

陳俊峰1，王 璟1，張家慶1，高 翔2，白獻(xiàn)曉1，任巧玲1，

高彬文1，馬 強(qiáng)1，郭紅霞1，邢寶松1*

(1．河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002； 2．鄭州市獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450052)

為了研究豬脂肪細(xì)胞分化的蛋白質(zhì)之間的相互作用，采用LR重組反應(yīng)的方法，構(gòu)建豬脂肪組織酵母雙雜交文庫(kù)。結(jié)果顯示，酵母雙雜交文庫(kù)的庫(kù)容量為5.28×106CFU。隨機(jī)挑取的24個(gè)克隆均帶有插入片段，重組率100%，片段大小多數(shù)為1～2 kb，表明構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量較高。

豬； 脂肪組織； 酵母雙雜交； cDNA文庫(kù)

脂肪組織在胚胎發(fā)育晚期出現(xiàn)，仔豬出生后迅速增長(zhǎng)，是一種高度分化的組織。脂肪組織生長(zhǎng)包括新脂肪細(xì)胞的生成和脂肪細(xì)胞體積的增大。在新生動(dòng)物中，主要表現(xiàn)為新脂肪細(xì)胞的生成，即脂肪細(xì)胞的分化；成年動(dòng)物則以脂肪細(xì)胞體積增大為主，但仍保留了脂肪細(xì)胞分化的能力。豬脂肪組織既是脂肪的儲(chǔ)存庫(kù)，同時(shí)也是內(nèi)分泌器官[1-2]，其分泌的主要活性因子包括瘦素(leptin)、1型纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor type 1,PAI-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNFα)、脂連素(adiponectin,APN)、酰化刺激蛋白(acylation stimulation protein,ASP)等[3]。脂肪細(xì)胞的分化途徑主要由3個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)節(jié)：CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族(CAAT/enhancer binding protein,C/EBP)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體家族(peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)和類固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein 1,SREBP1)[4]。脂肪細(xì)胞分化過(guò)程十分繁雜，還有許多因子的作用尚不清楚，通過(guò)酵母雙雜交文庫(kù)篩選互作蛋白是研究蛋白質(zhì)相互作用的一種重要方法。

酵母雙雜交的原理是通過(guò)將已知目的蛋白(誘餌蛋白，bait protein)與酵母DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA bindingdomain,BD)序列融合后表達(dá)產(chǎn)生融合蛋白BD-Bait；另一方面未知的捕獲蛋白(prey protein)與酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptiobal activation domain,AD)序列融合，在酵母中表達(dá)融合蛋白AD-Prey。若已知的誘餌蛋白與未知捕獲蛋白相互作用，在酵母宿主中，BD和AD聯(lián)系在一起，從而激活下游報(bào)告基因的表達(dá)[5-6]。通過(guò)對(duì)捕獲到的蛋白質(zhì)進(jìn)行序列分析，可確定與目的蛋白產(chǎn)生互作的蛋白質(zhì)。因此，能否構(gòu)建高質(zhì)量的脂肪組織是酵母雙雜交文庫(kù)蛋白質(zhì)篩選的關(guān)鍵。為此，本研究構(gòu)建豬脂肪組織酵母雙雜交文庫(kù)，以期為篩選與已知的脂肪代謝關(guān)鍵基因互作的未知蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試動(dòng)物 3頭2月齡大白豬由鄭州某豬場(chǎng)提供。

1.1.2 主要試劑 TRIzol 試劑、FastTrack?MAG mRNA isolation 試劑盒、CloneMiner Ⅱ cDNA Library Construction 試劑盒、PureLink?Hipure Plasmid Filter Midiprep 試劑盒、LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix、ElectroMAXTMDH10BTMT1 Phage Resistant Cells、1 kb Plus DNA Ladder均購(gòu)自Invitrogen公司，DEPC 水購(gòu)自Beyotime公司。

1.1.3 質(zhì)粒 pDONR222、pGADT7-DEST購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 脂肪組織總RNA提取、mRNA分離與純化

取3頭豬，采集背部皮下脂肪組織各1 g，混合預(yù)冷，放入液氮研成粉末，然后轉(zhuǎn)入50 mL RNase free離心管中，加入20 mL的Trizol試劑，按說(shuō)明書(shū)提取總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，并進(jìn)行濃度檢測(cè)，然后利用FastTrack?MAG mRNA isolation 試劑盒，對(duì)提取的脂肪組織總RNA進(jìn)行mRNA的分離與純化，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)mRNA質(zhì)量，并檢測(cè)濃度與純度。

1.3 cDNA初級(jí)文庫(kù)構(gòu)建

1.3.1 cDNA第一鏈的合成 取上一步獲得的mRNA，分別加入Glycogen (20 μg/μL) 1 μL，5 mol/L NH4OAc 100 μL和無(wú)水乙醇1 000 μL，于-80 ℃靜置15 min，然后4 ℃、14 000 r/min離心25 min，去上清；加入1 mL 70%乙醇洗滌沉淀，4 ℃、14 000 r/min離心3 min，去上清；室溫晾干后溶于7 μL DEPC水中。加入1 μL生物素標(biāo)記的引物biotin-attB2-Oligo(dT) (30 pmol/L)，混勻后65 ℃變性5 min，冷卻到45 ℃放置2 min；分別加入5×First Strand Buffer 4 μL，DTT(0.1 mol/L)2 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，45 ℃孵育2 min，加入5 μL SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶混勻，45 ℃水浴1 h，合成cDNA第一鏈。

1.3.2 cDNA第二鏈的合成 上述產(chǎn)物先后加入如下組分：DEPC處理水 91 μL，5×Second Strand Buffer 30 μL，10 mmol/L dNTPs 3 μL，DNA Ligase (10 U/μL) 1 μL，DNA Polymerase Ⅰ(10 U/μL)4 μL，RNaseH(2 U/μL) 1 μL，總計(jì)150 μL，于16 ℃孵育2 h；然后加入T4 DNA Polymerase 2 μL，于16 ℃反應(yīng)5 min后，加入0.5 mol/L EDTA(pH值8.0)10 μL終止反應(yīng)；利用酚/氯仿/異戊醇法抽提，加入18 μL DEPC處理水溶解cDNA。

1.3.3 cDNA連接三框attB1重組接頭 按順序分別加入如下組分：cDNA 6 μL，5× Adapter Buffer 10 μL，attB1 Adapter(1 μg/μL) 4 μL，0.1 mol/L DTT 8 μL，T4 DNA Ligase(1 U/μL) 6 μL，DEPC水16 μL，共計(jì)50 μL，混勻后于16 ℃連接過(guò)夜。3種接頭分別各連接1份。

1.3.4 cDNA BP重組 將帶有接頭的cDNA進(jìn)行分離純化后，加入如下組分：cDNA 14 μL，pDONR222(250 ng/μL) 1 μL，BP Clonase Ⅱ enzyme mix 4 μL，總計(jì)20 μL，混勻置于25 ℃反應(yīng)16～20 h，將其重組到載體pDONR222。

1.3.5 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B構(gòu)建初級(jí)文庫(kù) 分別將重組產(chǎn)物、感受態(tài)細(xì)胞DH10B 50 μL，加入-80 ℃預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯，置于冰上45 min，電轉(zhuǎn)化后加入SOC培養(yǎng)基1 mL，轉(zhuǎn)入新的15 mL離心管，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)1 h；取菌液10 μL用于庫(kù)容量鑒定；余下產(chǎn)物加入甘油至終含量20%，-80 ℃保存。

1.3.6 初級(jí)cDNA文庫(kù)質(zhì)量鑒定 構(gòu)建好的初級(jí)文庫(kù)分別進(jìn)行庫(kù)容量、重組率和插入片段長(zhǎng)度鑒定。吸取10 μL原液按1∶1 000稀釋后，取出50 μL稀釋液涂布于LB(含50 μg/mL Kan)平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。計(jì)算公式為：文庫(kù)總庫(kù)容=平板上的克隆數(shù)/50×103×文庫(kù)菌液總體積。隨機(jī)挑取24個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，引物為pDONR222載體上的通用引物 M13F和M13R。

1.4 酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建

1.4.1 初級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒提取 將初級(jí)文庫(kù)菌液接種到100 mL肉湯培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan)，30 ℃ 、250 r/min搖菌培養(yǎng)至OD600為1.0，提取文庫(kù)質(zhì)粒。

1.4.2 LR重組反應(yīng) 將得到的初級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒稀釋到300 ng/μL，取1 μL分別加入如下組分：pGADT7-DEST (300 ng/μL) 1 μL，LR Clonase Ⅱ Mix 4 μL，ddH2O 14 μL，總計(jì)20 μL，混勻后置于25 ℃反應(yīng)16～20 h。

1.4.3 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B構(gòu)建酵母雙雜交文庫(kù) 重組產(chǎn)物加入2 μL Proreinase K，37 ℃反應(yīng)15 min，然后75 ℃反應(yīng)10 min，使重組酶失活。乙醇沉淀重組產(chǎn)物后加入8 μL TE Buffer，吹打至重組產(chǎn)物完全溶解。電轉(zhuǎn)化同1.3.5，取10 μL用于文庫(kù)質(zhì)量鑒定，剩余培養(yǎng)物加入甘油至終含量20%，于-80 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取、mRNA分離與純化結(jié)果

從圖1可以看出，有2條清晰的條帶28S和18S，且亮度比值接近2∶1，經(jīng)檢測(cè)，質(zhì)量濃度為3 781.7 ng/μL，A260/A280為2.01，說(shuō)明提取的RNA純度和完整性均能滿足文庫(kù)構(gòu)建的要求。

從圖2可以看出，分離到的mRNA呈均勻的彌散狀態(tài)，表明mRNA未降解。經(jīng)檢測(cè)，mRNA質(zhì)量濃度為18.8 ng/μL，A260/A280為2.11，達(dá)到下一步試驗(yàn)要求。

M．1 kb Plus DNA Ladder； 1．豬脂肪組織提取的總RNA

M．1 kb Plus DNA Ladder； 1．豬脂肪組織mRNA

2.2 初級(jí)cDNA文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)

分離純化后的mRNA反轉(zhuǎn)錄后合成第一鏈和第二鏈cDNA，分別與attB1的三框接頭進(jìn)行連接，分離收集后重組于pDONR222載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B搖菌培養(yǎng)，獲得初級(jí)cDNA文庫(kù)。稀釋后的菌液涂布LB平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)，經(jīng)計(jì)算，文庫(kù)總庫(kù)容數(shù)為7.56×106CFU。24個(gè)克隆均有插入片段的陽(yáng)性克隆，插入片段平均大于1.5 kb，表明重組率很高，且重組的cDNA片斷的序列完整性較好(圖3)。cDNA文庫(kù)可以用于下一步的酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建。

M．1 kb Plus DNA Ladder； 1—24．初級(jí)cDNA文庫(kù)挑取的克隆子PCR產(chǎn)物

2.3 酵母雙雜交文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)

初級(jí)文庫(kù)提取質(zhì)粒后經(jīng)過(guò)重組到酵母菌載體pGADT7-DEST，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B培養(yǎng)，菌液稀釋后涂布LB平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，酵母雙雜交文庫(kù)的庫(kù)容量為5.28×106CFU。24個(gè)克隆均帶有插入片段，其中有2個(gè)小于1 kb，2個(gè)大于2 kb，其余大小均在1～2 kb。結(jié)果表明構(gòu)建的酵母雙雜交文庫(kù)完整性較好，且重組率為100%(圖4)，說(shuō)明構(gòu)建的酵母雙雜交文庫(kù)質(zhì)量較好。

M．1 kb Plus DNA Ladder； 1—24．酵母雙雜交文庫(kù)挑取的克隆子PCR產(chǎn)物

3 結(jié)論與討論

3.1 關(guān)于文庫(kù)擴(kuò)增

由于文庫(kù)本身包含的克隆并不是單一的，而是多種克隆的集合體，在擴(kuò)增過(guò)程中難免會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增效率的不均一。在37 ℃條件下擴(kuò)增文庫(kù)，擴(kuò)增速度過(guò)快，很容易造成文庫(kù)的冗余率上升，拷貝數(shù)較低或較難擴(kuò)增的質(zhì)粒也容易丟失。30 ℃擴(kuò)增更能保證文庫(kù)的穩(wěn)定性。

3.2 文庫(kù)的質(zhì)量鑒定

文庫(kù)的庫(kù)容量能否滿足需求取決于樣本中表達(dá)出的mRNA的種類和每種mRNA序列的拷貝數(shù)。對(duì)于一般的樣本來(lái)說(shuō)，一個(gè)庫(kù)容量在106以上的文庫(kù)是對(duì)該樣本的所有轉(zhuǎn)錄本的上百倍的覆蓋，即使是低豐度的mRNA也應(yīng)有數(shù)千個(gè)克隆的存在，文庫(kù)的代表性能夠得到很好的保證。本試驗(yàn)構(gòu)建的初級(jí)文庫(kù)和酵母雙雜交文庫(kù)總?cè)萘繑?shù)分別達(dá)到7.56×106CFU和5.28×106CFU。此外，PCR檢測(cè)顯示重組率達(dá)100%，表明文庫(kù)構(gòu)建的質(zhì)量很好，能很好地滿足后續(xù)利用酵母雙雜交文庫(kù)篩選互作蛋白等研究。

3.3 酵母雙雜交文庫(kù)與豬脂肪分化網(wǎng)絡(luò)研究

胴體性狀是豬最重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，其脂肪沉積是影響胴體性狀的主要因素。脂肪細(xì)胞分化主要由PPAR、C/EBP和SREBP1等幾個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，其中，PPARγ主要是誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的分化[7]。SREBP-1c通過(guò)調(diào)節(jié)與脂肪合成和葡萄糖代謝有關(guān)的基因調(diào)控動(dòng)物體內(nèi)的脂肪合成[8-10]。C/EBPα與SREBP1協(xié)同作用增加PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性并促使細(xì)胞產(chǎn)生PPARγ相應(yīng)的配體。在小鼠的脂肪分化研究中，另一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子——脂肪細(xì)胞增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(adipocyte enhancer binding protein,AEBP1)也被證實(shí)與脂肪細(xì)胞分化有關(guān)。利用酵母雙雜交技術(shù)，篩選了與小鼠AEBP1互作的因子G蛋白異源三聚體γ5亞基(Gγ5)，發(fā)現(xiàn)AEBP1的轉(zhuǎn)錄抑制功能通過(guò)Gγ5進(jìn)行調(diào)節(jié)[11]。本研究構(gòu)建了豬脂肪組織酵母雙雜交文庫(kù)作為捕獲蛋白池，利用已知的蛋白質(zhì)篩選與之相互作用的其他因子，將有助于進(jìn)一步弄清豬脂肪組織的分化途徑，完善其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

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Construction and Identification of Yeast Two-hybrid Library From Porcine Adipose Tissue

CHEN Junfeng1，WANG Jing1，ZHANG Jiaqing1，GAO Xiang2，BAI Xianxiao1，REN Qiaoling1， GAO Binwen1，MA Qiang1，GUO Hongxia1，XING Baosong1*

(1．Institute of Animal Husbandry and Veterinary,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 2．Zhengzhou Supervisory Institute of Veterinary Drugs and Feedstuffs,Zhengzhou 450052,China)

A yeast two-hybrid cDNA library from porcine adipose tissue was constructed by LR reaction to study on protein-protein interaction of porcine adipocyte．The results showed that the yeast two-hybrid library contained 5.28×106independent clones．All randomly selected 24 clones have recombination，and the recombination rate was 100%．The sizes of most inserts were 1—2 kb in length．These results indicated that the library constructed has high quality．

porcine; adipose tissue； yeast two-hybrid； cDNA library

2016-04-10

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年科技基金項(xiàng)目(2013YQ21)

陳俊峰(1979-)，男，湖北天門(mén)人，副研究員，博士，主要從事豬分子遺傳與育種研究工作。 E-mail：afeng008@163.com

*通訊作者：邢寶松(1969-)，男，河南新密人，副研究員，博士，主要從事豬分子遺傳與育種研究工作。 E-mail：baosong@126.com

Q51

A

1004-3268(2016)10-0138-04