周彩顯，吳昊，于晶，陽麗媛，姚望遠(yuǎn)，趙健，伊淑帥，董浩，胡桂學(xué)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

6株鵝細(xì)小病毒的分離及其VP3基因序列分析

周彩顯，吳昊，于晶，陽麗媛，姚望遠(yuǎn)，趙健，伊淑帥，董浩，胡桂學(xué)*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

為了解吉林省不同地區(qū)小鵝瘟流行情況，從吉林省磐石、白城、九臺、德惠、遼源與鎮(zhèn)賚地區(qū)鵝養(yǎng)殖場采集疑似小鵝瘟雛鵝的腸管，處理后接種SPF鵝胚成功分離到6株病毒(暫命名為PSH、BCH、JLJT、DH、LY與ZL株)，經(jīng)PCR鑒定為鵝細(xì)小病毒。VP3基因序列分析結(jié)果顯示，分離到的6株鵝細(xì)小病毒VP3基因與近年來國內(nèi)流行毒株同源性較高，核苷酸與氨基酸同源性分別為93.1%～99.6%與95.9%～99.4%。其中，BCH株、JLJT株與LY株屬同一分支，與浙江和揚(yáng)州等地區(qū)分離的鵝細(xì)小病毒相似性較高，達(dá)到99.4%～99.6%；ZL株、DH株與PSH株屬同一分支，相似性較低。試驗(yàn)表明，吉林省流行的鵝細(xì)小病毒與我國南方地區(qū)流行毒株同源性較高，與其他地區(qū)流行毒株存在一定差異。

鵝細(xì)小病毒；分離；VP3基因

鵝細(xì)小病毒病又稱小鵝瘟，是一種由鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起的以雛鵝和雛番鴨出血性、敗血性纖維素性腸炎為主要特征的急性或亞急性高度接觸性傳染病，具有傳播速度快與死亡率高等特點(diǎn)，對鵝養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重威脅[1-2]。自1956年，我國學(xué)者方定一發(fā)現(xiàn)小鵝瘟后，該病相繼在各個地區(qū)均有報道。20世紀(jì)80年代以后，在國內(nèi)幾乎每個地區(qū)具有該病的出現(xiàn)，對鵝養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。吉林省作為我國鵝養(yǎng)殖大省，小鵝瘟的流行成為制約養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展的主要因素。近年來，吉林省磐石、德惠、九臺與鎮(zhèn)賚地區(qū)大型鵝養(yǎng)殖場相繼暴發(fā)小鵝瘟疫情，對養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，了解吉林省不同地區(qū)小鵝瘟的流行情況，對小鵝瘟的防治意義重大。本試驗(yàn)通過尿囊腔接種鵝胚從吉林省不同地區(qū)小鵝瘟疑似病料種分離到6株病毒，經(jīng)PCR初步鑒定為鵝細(xì)小病毒。對分離株的VP3基因進(jìn)行序列測定與分析，并與近年來國內(nèi)流行毒株進(jìn)行同源性分析，以期為指導(dǎo)本地小鵝瘟的防治工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 GPV標(biāo)準(zhǔn)毒株B株由吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院惠贈；Viral DNA Extraction kit，DNA Gel Extraction kit，Plasmid Mini Preparation kit購自O(shè)MEGA公司；Ex Taq酶、dNTP、10×buffer、DL 2000 maker、pMD-18T質(zhì)粒、DH5α感受態(tài)等均購自大連寶生物公司。MikRo 22R高速冷凍離心機(jī)(德國HETTICH公司)、MCO-18AIC 恒溫孵化箱(日本SANYO公司)、TC-25/H PCR儀(BIOER公司)、DYY-6B電泳儀凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)等。

1.2 病料來源及處理 疑似小鵝瘟雛鵝的腸管采集自吉林省九臺、磐石、白城、鎮(zhèn)賚、遼源、德惠地區(qū)鵝養(yǎng)殖場的發(fā)病鵝群。采集的病料使用含1%雙抗溶液的生理鹽水進(jìn)行組織勻漿，反復(fù)凍融3次后，10000 r/min離心10 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm纖維濾膜過濾后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒分離 10日齡鵝胚由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)鵝養(yǎng)殖中心提供，按照0.2 mL/胚的劑量分別將6個地區(qū)處理過的病料組織勻漿液經(jīng)尿囊腔接種鵝胚，接種后每隔12 h觀察鵝胚的存活狀態(tài)，連續(xù)觀察5 d，無菌收集24 h～120 h內(nèi)死亡鵝胚的尿囊液與-80 ℃保存，并按照上述方法連續(xù)盲傳5代，收集尿囊液并保存。

1.4 病毒鑒定 使用Viral DNA Extraction kit提取盲傳第5代尿囊液中病毒的DNA，以病毒DNA為模板，去離子水、GPV標(biāo)準(zhǔn)株B株DNA為陰、陽對照，采用胡桂學(xué)等[5]建立的GPV檢測體系及條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.5 VP3基因的擴(kuò)增及序列分析 以提取的盲傳第5代尿囊液病毒DNA為模板，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計的VP3擴(kuò)增引物[6]擴(kuò)增分離株VP3基因片段，預(yù)期片段大小為1605 bp。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃終延伸10 min，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，經(jīng)膠回收后連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽性菌落提取質(zhì)粒分別命名為T-JLJT-VP3、T-PSH-VP3、T-BCH-VP3、T-ZL-VP3、T-LY-VP3與T-DH-VP3，并送往上海生工有限公司測序。

將測序結(jié)果進(jìn)行拼接構(gòu)成完整的VP3基因序列，查找近年來于GenBank上發(fā)表的GPV VP3基因序列，使用MegAlign軟件進(jìn)行基因序列及氨基酸序列同源性分析并繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離及傳代 采集自吉林省磐石、鎮(zhèn)賚、白城、九臺、 德惠、遼源地區(qū)的疑似小鵝瘟病料經(jīng)處理后接種10日齡鵝胚，72 h～120 h內(nèi)鵝胚全部死亡，尿囊液連續(xù)盲傳5代仍能致死鵝胚，證明成功分離到6株病毒，暫命名為磐石株(PSH)、鎮(zhèn)賚株(ZL)、白城株(BCH)、九臺株(JLJT)、德惠株(DH)與遼源株(LY)。

2.2 病毒PCR鑒定結(jié)果 利用GPV 鑒定引物GPV F/GPV R，對提取的盲傳第5代尿囊液病毒DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到特異性目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，片段大小約為375 bp(圖1)。經(jīng)序列測定以及在線Blast比對，與GPV同源性為95.7%～99.6%，初步確定分離到的6株病毒均為GPV。

M：DL 2000Maker；1～6：JLJT、PSH、BCH、ZL、LY、DH；7：陽性對照(GPV標(biāo)準(zhǔn)株B株)；8：陰性對照圖1 病毒PCR鑒定結(jié)果

2.3 VP3基因擴(kuò)增結(jié)果 以6株病毒盲傳第5代尿囊液提取的DNA為模板，本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計的VP3擴(kuò)增引物VP3 F/VP3 R對6株病毒的VP3基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳得到特異性目的條帶，結(jié)果如圖2所示。6株病毒均在1605 bp左右出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.4 VP3基因序列測定及遺傳進(jìn)化分析 將6株病毒的陽性克隆質(zhì)粒送往上海生工生物工程公司測序，測序結(jié)果經(jīng)拼接后均為1605 bp。根據(jù)近年來GenBank上發(fā)表的GPV VP3基因序列，應(yīng)用MegAlign軟件分析6株GPV分離株JLJT、PSH、BCH、ZL、LY、DH與已發(fā)表GPV毒株的同源性，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。

M：DL 2000Maker；1～6：JLJT、PSH、BCH、ZL、LY、DH圖2 病毒VP3基因擴(kuò)增結(jié)果

▲代表6株GPV分離株VP3基因圖3 GPV分離株VP3基因核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，6株GPV分離株VP3基因與近年來國內(nèi)流行的GPV以及GPV標(biāo)準(zhǔn)毒株B株VP3基因同源性均在93.1%～99.6%之間。其中，BCH株、JLJT株、LY株屬同一分支，JLJT株與LY株相似性最高，達(dá)到99.4%，JLJT株與2013年揚(yáng)州分離株YZGY同源性高達(dá)99.6%，BCH株與2013年浙江分離株ZJXF同源性達(dá)到99.4%。ZL株、DH株、PSH株屬同一分支，3株病毒相互之間同源關(guān)系較遠(yuǎn)，但是PSH株與2007年廣東分離株GZGD同源性較高，達(dá)到99.6%。2.5 VP3基因推導(dǎo)氨基酸序列分析 根據(jù)6株GPV分離株VP3基因序列推導(dǎo)VP3氨基酸序列，VP3基因序列為1605 bp，編碼534個氨基酸。應(yīng)用MegAlign軟件對推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果表明，6株GPV分離株VP3基因推導(dǎo)出的氨基酸序列與其余11株GPV VP3基因氨基酸序列同源性介于95.9%～99.4%之間，其中，BCH株、JLJT株、LY株與揚(yáng)州分離株YZGY屬于同一分支，JLJT株與YZGY株同源性最高，達(dá)到99.4%；PSH株與廣東分離株GZGD屬于同一分支，同源性為98.7%，DH株、ZL株與其余毒株同源性較遠(yuǎn)，但也達(dá)到95.9%～98.3%。

▲代表6株GPV分離株VP3基因推導(dǎo)氨基酸序列圖4 GPV分離株VP3基因推導(dǎo)氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

3 討論

GPV主要侵害1～20日齡的易感雛鵝與雛番鴨，引起雛鵝與雛番鴨感染發(fā)病，具有發(fā)病快、發(fā)病率高與死亡率高的特點(diǎn)。GPV感染后2～5 d就可以波及整個鵝群，造成雛鵝大批量死亡，對鵝養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅[7]。因此，GPV毒株的分離成為研究GPV遺傳進(jìn)化特點(diǎn)、生物學(xué)特性及疫苗研發(fā)的重點(diǎn)。目前，使用鵝胚或鵝胚成纖維細(xì)胞進(jìn)行GPV的分離是最為普遍的方法。王建等通過鵝胚接種成功分離到4株GPV，并將分離株接種雞胚，雞胚未發(fā)生病變[8]；邱娜等使用不同代次的鵝胚成纖維細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)YN株GPV，獲得了高滴度的鵝細(xì)小病毒細(xì)胞適應(yīng)株[9]。本試驗(yàn)通過尿囊腔接種鵝胚成功分離到6株病毒，通過PCR驗(yàn)證所分離的病毒均為GPV，并暫命名為PSH株、ZL株、BCH株、JLJT株、DH株、LY株。此外，通過連續(xù)盲傳的方法，獲得了穩(wěn)定的GPV毒株。

鵝細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP3基因具有相對較高的保守性，同時可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是GPV的保護(hù)性抗原，常作為GPV分子生物學(xué)診斷以及遺傳進(jìn)化分析的依據(jù)[10-11]。胡桂學(xué)[5]、布日額[12]、Limn[13]、趙妍[14]等許多學(xué)者均針對GPV的VP3基因建立了小鵝瘟PCR檢測方法，且均有很好的特異性及敏感度。其中，布日額、Limn建立的PCR檢測方法是根據(jù)GPV的VP1與VP3基因設(shè)計的擴(kuò)增引物，檢測準(zhǔn)確率高，但檢測過程較為繁瑣；趙妍建立的檢測方法為二重PCR，可以同時檢測鴨瘟病毒與番鴨細(xì)小病毒，不適于檢測鵝源細(xì)小病毒；胡桂學(xué)建立的小鵝瘟PCR檢測方法特異性與敏感性均較高，并在吉林地區(qū)鵝細(xì)小病毒流行病學(xué)調(diào)查中得到了充分的驗(yàn)證[15]。因此，本試驗(yàn)采用胡桂學(xué)建立的GPV PCR檢測方法對6株病毒分離株進(jìn)行了PCR檢測，結(jié)果均在375 bp左右出現(xiàn)了目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。通過序列測定及在線Blast比對，與GPV同源性為95.7%～99.6%，確定分離到的6株病毒均為GPV。

根據(jù)VP3基因及所對應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析，分析毒株間親緣關(guān)系，也可以對不同毒株引起的疫病流行情況進(jìn)行系統(tǒng)的分析。本試驗(yàn)通過對6株GPV分離株VP3基因與國內(nèi)近年來流行的GPV毒株以及GPV標(biāo)準(zhǔn)毒株B株同源性比較，結(jié)果核苷酸與氨基酸同源性均較高，分別為93.1%～99.6%，95.9%～99.4%。其中，BCH株、JLJT株、LY株屬同一分支， 與2013年揚(yáng)州分離株YZGY的核苷酸同源性較高。ZL株、DH株、PSH株屬同一分支，3株病毒相互之間同源關(guān)系較遠(yuǎn)，但是PSH株與2007年廣東分離株GZGD同源性較高。PSH株與廣東分離株GZGD株，BCH株、JLJT株、LY株與揚(yáng)州分離株YZGY為同一株病毒，是南方GPV毒株在傳播過程中的變異毒株。造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于近年來吉林省鵝養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，由南方地區(qū)引入的種鵝數(shù)量也隨之增多，從而導(dǎo)致南方鵝群攜帶的GPV毒株進(jìn)入吉林省并發(fā)生變異造成大規(guī)模流行。通過本試驗(yàn)對吉林省不同地區(qū)的GPV毒株流行情況進(jìn)行了調(diào)查，并證明分離到的6株GPV毒株與近年來我國南方流行毒株同源性較近，推測為南方GPV毒株的變異毒株，可為吉林省不同地區(qū)鵝細(xì)小病毒的研究與防治提供依據(jù)。

[1] 金文杰, 呂亞楠, 王芳, 等. 我國小鵝瘟研究進(jìn)展及成就[J]. 微生物學(xué)通報, 2014, 41(3): 504-510.

[2] Shein J, wang Y, Chen C,etal. Identification of sequence changes in live attenuated goose parvovirus vaccine strains developed in Asia and Europe [J]. Avain Pathology, 2008, 37(5): 499-505.

[3] 趙剛, 郭宇翔. 黑龍江省小鵝瘟的流行病學(xué)調(diào)查[J]. 養(yǎng)殖技術(shù)顧問, 2013, 5: 74-75.

[4] 牛小會. 小鵝瘟的流行、癥狀與防治[J]. 現(xiàn)代畜牧科技, 2015, 4: 66-67.

[5] 胡桂學(xué), 逄博, 高鳳山, 等. 小鵝瘟PCR診斷方法的建立和初步應(yīng)用[J]. 經(jīng)濟(jì)動物學(xué)報, 2003, 2: 50-53.

[6] 徐浩. 鵝細(xì)小病毒的分離鑒定及其全基因測序及結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)[D]. 長春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[7] Shao H, Lv Y, Ye J,etal. Isolation of a goose parvovirus from swan and its molecular characteristics [J]. Acta Virologica, 2014, 58(2):194-198.

[8] 王建, 王華琴, 徐澤鋒, 等. 五常地區(qū)小鵝瘟病毒的分離與鑒定[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊, 2014, 06: 10-12.

[9] 邱娜, 劉明, 白小飛, 等. 鵝細(xì)小病毒鵝胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)病毒株的培育及序列分析[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2014, 11(36): 898-900.

[10]Liu H M, Wang H, Tian X J,etal. Complete genome sequence of goose parvovirus Y strain isolated from Muscovy ducks in China [J]. Virus Genes, 2014, 48(1):199-202.

[11]Zadori Z, Judith E, Nagy J,etal. Characteristics of the genome of goose parvovirus[J]. Avian Pathology, 1994, 23(2):359-364.

[12]布日額, 王君偉, 吳金花, 等. GPV野毒株的分離及PCR檢測方法的應(yīng)用[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2003(6): 469-472.

[13]Limn C K, Yamada T, Nakamura M,etal. Detection of goose parvovirus genome by polymerase chain reaction: distribution of goose parvovirus in Muscovy ducklings [J]. Virus Research, 1996, 42(1/2): 167-172.

[14]趙妍, 王君偉, 邢明偉, 等. 二重 PCR 檢測鴨瘟病毒和鵝細(xì)小病毒的初步研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2007, 9(29): 710-713.

[15]于靖平. 待宰鵝新城疫和小鵝瘟的流行病學(xué)調(diào)查及新城疫病毒的分離與鑒定[D]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

(編輯：李文平)

Isolation of 6 Strains of Goose Parvovirus and Analysis of VP3 Gene

ZHOU Cai-xian, WU Hao, YU Jing, YANG Li-yuan, YAO Wang-yuan,ZHAO Jian，YI Shu-shuai, DONG Hao, HU Gui-xue*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

In order to evaluate the epodemic development of goose parvovirus (GPV) in different district of Jilin province, intestines of suspected goose were collected from poultry farm in different regions including Panshi, Baicheng, Jiutai, Dehui, Liaoyuan and Zhenlai city of Jilin province, and 6 strains named respectively PSH, BCH, JLJT, DH, LY and ZL, were isolated with inoculating SPF goose embryos. The detection of PCR showed that all six samples were positive for goose parvovirus. The result of sequence analysis of VP3 gene showed that the 6 isolated strains shared high identities with the domestic popular strains in recent years, with 93.1%～99.6% and 95.9%～99.4% homology. Among them, BCH, JLJT and LY located in the same branch, all three strains had a high homology at 99.4%～99.6% with isolayed strains from Zhejiang and Yangzhou; ZL, DH and PSH located in the same branch, but the homology was low. This assay indicate that the epidemic GPV strain in Jilin province possessed high identities with epidemic strain of the southern China, and different from strains in other areas.

goose parvovirus; isolation; VP3 gene

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201410193016)；吉林省科技發(fā)展計劃項目(20130522086JH)

周彩顯，從事動物病原學(xué)研究。

胡桂學(xué)。E-mail：huguixue901103@163.com

2016-01-02

A

1002-1280 (2016) 03-0001-05

S854.4+3