王靜文，范強(qiáng)，龔旭昊，董玲玲，楊星，萬仁玲，顧進(jìn)華

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

魚腥草注射液中非法添加甲氧氯普胺的HPLC-PDA檢測方法的建立

王靜文，范強(qiáng)，龔旭昊，董玲玲，楊星，萬仁玲，顧進(jìn)華*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為檢測魚腥草注射液中非法添加的甲氧氯普胺，以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，0.02 mol/L磷酸溶液(用三乙胺調(diào)劑pH值至4.0)-乙腈(81:19)為流動相，流速為1.0 mL/min，波長掃描范圍為200～400 nm，柱溫25 ℃，建立了HPLC-PAD檢測方法，并采用峰純度檢查和光譜相似度檢查輔助對照品比對方法，對非法添加藥物進(jìn)行確證。結(jié)果顯示，甲氧氯普胺回收率為98.8%，RSD為0.3%；線性方程為y=43542070x+36695,R2=1；檢測限為6 μg/mL；定量限為9 μg/mL。本方法快速、靈敏、可靠，可對魚腥草注射液中非法添加的甲氧氯普胺違禁藥物進(jìn)行定性和定量檢測。

甲氧氯普胺；魚腥草注射液；HPLC-PDA

魚腥草注射液為魚腥草經(jīng)水蒸氣蒸餾制成的滅菌水溶液。臨床中主要功能為清熱解毒，消腫排膿，利尿通淋，主治肺癰，痢疾，乳癰，淋濁[1]。甲氧氯普胺又稱胃復(fù)安、滅吐靈, 為有機(jī)合成的普魯卡因酰胺衍生物,系中樞性和外周性多巴胺D2受體阻斷劑，抑制中樞催吐化學(xué)感受區(qū)中的多巴胺受體而調(diào)高該感受區(qū)的閾值，同時(shí)可以促進(jìn)上消化道運(yùn)動而不刺激胃液、膽汁和胰腺分泌。臨床上常用于治療慢性消化性不良引起胃腸運(yùn)動障礙，改善惡心、嘔吐等癥狀、癌癥放、化療和手術(shù)后的嘔吐[2]。由于該藥物價(jià)格低廉，應(yīng)用廣泛，有關(guān)其不良反應(yīng)的報(bào)道也日漸增多。甲氧氯普胺半衰期短,個體間的藥動學(xué)特征差異大,長期或高劑量使用容易造成嚴(yán)重的錐體外系反應(yīng)[3]。在魚腥草注射液中添加甲氧氯普胺，不僅違反了《獸藥管理?xiàng)l例》，也為動物源性食品安全埋下了隱患。

國內(nèi)外文獻(xiàn)已報(bào)道的用于甲氧氯普胺檢測的方法有：高效液相色譜法[4]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜檢測法及分光光度法[6]，但目前尚未有檢測非法添加甲氧氯普胺的方法報(bào)道，因此有必要建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的方法檢測魚腥草注射液中非法添加的甲氧氯普胺。參考以上文獻(xiàn)結(jié)合中獸藥中非法添加化學(xué)藥品的特點(diǎn)[7-8]，本文建立了快速、準(zhǔn)確、可靠的定性定量方法，以期廣泛應(yīng)用于非法添加的檢測工作。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695液相系統(tǒng)、2998 PDA二極管陣列檢測器、Empower3色譜工作站軟件(美國Waters 公司)、Mettler XS205型十萬分之一天平(美國Mettler Toledo公司)、MiliQ純水機(jī)、雷磁PHSJ-4A型pH 計(jì)。

1.2 試藥與試劑 甲氧氯普胺對照品(含量：99.8%，批號：100832-201404，中國食品藥品檢定研究院)，供試品：魚腥草注射液空白樣品(批號：20140901)；魚腥草注射液陽性樣品(批號：20140601)，乙腈(德國Merck公司，色譜純，批號：1747130433)，甲醇(德國Merck公司，色譜純，批號：1748007433)，三乙胺(美國Fisher Scientific公司，色譜純，批號：111435)，磷酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級純，批號：20140819)，去離子水(MiliQ純化系統(tǒng)制備的去離子水)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Atlantis T3(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動相：0.02 mol/L磷酸溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH值至4.0)-乙腈(81∶19)，流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量：20 μL，二極管陣列檢測器(PDA,檢測波長:200～400 nm，記錄275nm波長處的色譜圖)。

2.2 溶液制備

2.2.1 魚腥草注射液空白溶液 取已測得不含甲氧氯普胺的魚腥草注射液10 mL,置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，過濾，作為空白對照溶液。

2.2.2 甲氧氯普胺對照品儲備液 取甲氧氯普胺對照品15 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成0.3 mg/mL的對照品儲備液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 樣品本底及干擾 精密量取對照品溶液(0.006 mg/mL)和魚腥草注射液空白溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖和光譜指數(shù)圖，檢測魚腥草注射液中成分對測定結(jié)果是否產(chǎn)生干擾。結(jié)果見圖1、圖2，魚腥草注射液本底對甲氧氯普胺的檢測不產(chǎn)生干擾。

圖1 魚腥草注射液空白溶液色譜圖、光譜圖

圖2 甲氧氯普胺對照品(0.006mg/mL)色譜圖、光譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取甲氧氯普胺對照品儲備液1、3、5、7、9 mL置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.006、0.018、0.030、0.042、0.054 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，測定。按甲氧氯普胺峰面積與對應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。甲氧氯普胺回歸方程為y=43542070x+36695,R2=1。表明甲氧氯普胺在6～54 μg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 檢測限與定量限 檢測限溶液制備：取已測得不含甲氧氯普胺的魚腥草注射液1 mL,置10 mL容量瓶中，精密加入甲氧氯普胺對照品溶液(0.006 mg/mL)適量(0.5、1、1.5、2 mL),用甲醇稀釋至刻度。以光譜圖(圖3)失真的最大濃度作為方法的檢出限，S/N≥10的濃度為定量限。該色譜條件下甲氧氯普胺在魚腥草注射液樣品中的檢出限為6 μg/mL；定量限為9 μg/mL。

圖3 甲氧氯普胺檢出限色譜圖、光譜圖

2.3.4 準(zhǔn)確度 以空白魚腥草注射液加甲氧氯普胺對照品做回收率試驗(yàn)來考察方法的準(zhǔn)確度。回收率試驗(yàn)溶液配制：取已測得不含甲氧氯普胺的魚腥草注射液5 mL,置50 mL容量瓶中，精密加入甲氧氯普胺對照品儲備液(0.3 g/mL)1 mL,用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。平行配制6份，結(jié)果見表1,甲氧氯普胺回收率為98.8%，RSD為0.3%。

表1 甲氧氯普胺回收率結(jié)果

2.3.5 耐用性 從柱溫、流動相pH值、色譜柱三個方面考察方法的耐用性。調(diào)節(jié)柱溫為20 ℃、25 ℃、30 ℃，結(jié)果顯示：隨著柱溫升高，保留時(shí)間略提前，但差異小于0.4 min；調(diào)節(jié)流動相pH值為3.0、4.0和5.0，結(jié)果顯示：隨著pH值的降低, 甲氧氯普胺的保留時(shí)間縮短；選擇三款不同品牌色譜柱，以甲氧氯普胺對照品溶液(0.006 mg/mL)作為供試品溶液，考察不同色譜柱對測定的影響，結(jié)果如表2所示：三種品牌色譜柱均可用于該檢查，方法耐用性較好。

表2 三種色譜柱耐用性考察結(jié)果表

2.4 樣品測定結(jié)果 取該批陽性魚腥草注射液0.5 mL,置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，用建立的HPLC-PDA法對該樣品進(jìn)行甲氧氯普胺含量測定，結(jié)果為3.23 mg/mL，樣品中甲氧氯普胺的色譜光譜圖、純度圖和光譜匹配圖見圖4-圖6，純度角度為0.11，純度閾值為0.385，純度角度小于純度閾值，為單一物質(zhì)峰；匹配角度為0.567，匹配閾值為1.173，匹配角度小于匹配閾值，光譜相似。

圖4 魚腥草注射液陽性樣品中甲氧氯普胺色譜圖、光譜圖

圖5 魚腥草注射液陽性樣品中甲氧氯普胺純度圖

圖6 魚腥草注射液陽性樣品中甲氧氯普胺光譜匹配圖

3 討論與小結(jié)

3.1 流動相的選擇 甲氧氯普胺為對氨基苯甲酰胺類藥物，堿性較強(qiáng)，參考文獻(xiàn)資料[3-5]，考察了其在0.02 mol/L磷酸溶液(用三乙胺調(diào)劑pH值至4.0)-乙腈(81∶19)、乙腈- 0.025 mol/L乙酸銨(0.2%三乙胺, 冰醋酸調(diào)節(jié)pH 至5.7) (20∶80)、甲醇-乙睛-醋酸鹽緩沖液(pH 4.0)-三乙胺(7∶18∶15∶0.1) 和磷酸二氫鉀溶液(pH 4.0) -乙睛(100∶25) 作為流動相時(shí)的分離情況，結(jié)果表明以0.02 mol/L磷酸溶液(用三乙胺調(diào)劑pH值至4.0)-乙腈(81∶19)作為流動相時(shí)，甲氧氯普胺保留時(shí)間適宜，峰形良好。

3.2 測定用溶劑的選擇 魚腥草注射液為魚腥草經(jīng)水蒸氣蒸餾制成的滅菌水溶液[1],可與甲醇任意比例混溶；對甲氧氯普胺在甲醇中的溶解性進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在本方法濃度范圍內(nèi)，甲氧氯普胺在甲醇中的溶解性良好。考慮到在非法添加高通量篩查工作中以甲醇作為溶劑具有普適性，選取甲醇作為檢測用溶劑。

3.3 提取波長的選擇 魚腥草注射液中主要有效成分為揮發(fā)油，包括癸酰乙醛、甲基正壬酮、α-松油醇、4-萜品醇、乙酸龍腦酯、月桂醛等，通常用氣相色譜法進(jìn)行檢測[10]，在200～400 nm波長范圍內(nèi)無明顯紫外吸收。甲氧氯普胺對照品在200～400 nm波長范圍最大吸收波長為213、275、310 nm,為避免測定溶劑及流動相對紫外吸收的干擾，選擇275 nm作為提取波長。

3.4 峰純度和光譜相似度 通過與對照品建立的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜庫比較，Waters Empower工作站可以對峰純度和光譜匹配度進(jìn)行計(jì)算，當(dāng)純度角度小于純度閾值時(shí)，可以判定為單一物質(zhì)峰，當(dāng)匹配角度小于匹配閾值時(shí)，可以判定光譜相似。通常作為判斷峰純度和光譜相似度的重要依據(jù)。

由于具有療效顯著價(jià)格低廉等特點(diǎn)，魚腥草注射液一直廣泛應(yīng)用于臨床治療。本文所建立的魚腥草注射液中非法添加甲氧氯普胺的HPLC-PDA檢測方法，簡便、快捷、重復(fù)性好，適用于魚腥草注射液中非法添加甲氧氯普胺的檢測。

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(編輯：陳希)

Determination of Metoclopramide Illegally Added in the Houttuynia Cordata Injection by HPLC-PDA

WANG Jing-wen, FAN Qiang, GONG Xu-hao, DONG Ling-ling, YANG Xing, WAN Ren-ling, GU Jin-hua*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

A method for the determination of metoclopramide in the Houttuynia Cordata Injection was developed by the high performance liquid chromatography with photo-diode array detector(HPLC-PDA).It was tested with C18 column, using 0.02 mol/L phosphoric acid solution(adjusting pH to 4.0 by triethylamine) and acetonitrile as the mobile phase. The scanning wavelength was from 200 to 400 nm. Peak purity test and spectrum similarity test were used to identify the metoclopramide. The mean recovery of metoclopramide was 98.8% andRSDwas 0.3%.In conclusion, the method is simple, accurate and reliable for the determination of metoclopramide in the houttuynia Cordata Injection.

metoclopramide; Houttuynia Cordata Injection; HPLC-PDA

“十三五”科技支撐計(jì)劃(2015BAD11B03-4)

王靜文，碩士，從事獸藥檢驗(yàn)檢測工作。

顧進(jìn)華。E-mail: gujinhua@ivdc.org.cn

2015-11-16

A

1002-1280 (2016) 03-0045-04

S853.7