劉自揚(yáng), 董玲玲, 畢言鋒, 郭桂芳, 郝利華

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京,100081)

黃芪多糖注射液中非法添加林可霉素檢查方法的研究

劉自揚(yáng), 董玲玲, 畢言鋒, 郭桂芳, 郝利華*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京,100081)

為建立黃芪多糖注射液中非法添加林可霉素的檢查方法，采用薄層色譜法初篩出黃芪多糖注射液中非法添加林可霉素的樣品，而后用HPLC-PDAD法檢測，液相色譜條件: 采用Atlantis?T 3(十八烷基硅烷鍵合硅膠，4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為0.02 mol/L的磷酸氫二銨-乙腈(70∶30)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為194 nm，最后用LC-MS法進(jìn)行確證。結(jié)合薄層色譜、高效液相色譜光譜圖以及質(zhì)譜的分子離子峰等方面信息，證明該樣品中確實(shí)非法添加了林可霉素，其中HPLC-PDAD法平均回收率為97.8%，RSD為1.4%，檢出限為6 μg/mL。該檢測方法準(zhǔn)確可靠，可用于黃芪多糖注射液中非法添加林可霉素的檢測。

林可霉素；黃芪多糖注射液；薄層色譜；高效液相色譜；質(zhì)譜

林可霉素[Lincomycin，6-(1-甲基反-4-丙基-L-2-吡咯烷甲酰氨基)-1-硫代-6,8-二脫氧-D-赤式-α-D-半乳辛吡喃糖苷，C18H34N2O6S，分子量：406.54]一般多以鹽酸鹽-水合物的形式出現(xiàn)，主要用于治療革蘭氏陽性菌感染，亦可用于治療支原體和豬密螺旋體等感染[1]，用作飼料添加劑時(shí)，可促進(jìn)肉雞和育肥豬生長，提高飼料利用率。過量使用能引起馬、兔和其他草食動物嚴(yán)重的或致死性腹瀉，也可能產(chǎn)生神經(jīng)肌肉阻斷作用[2]。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化和抗應(yīng)激等作用[3]，黃芪多糖注射液作為其最常用的制劑，具有能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)抗體形成等功效，在獸醫(yī)臨床應(yīng)用廣泛，用于雞傳染性法氏囊等病毒性疾病的治療[4]。

自2007年以來，獸藥檢驗(yàn)系統(tǒng)多次在黃芪多糖注射液等中獸藥制劑中發(fā)現(xiàn)了非法添加物，初步判定添加化學(xué)藥物為林可霉素。因此，亟需建立檢測黃芪多糖注射液中非法添加林可霉素的檢查方法，為中獸藥制劑中非法添加化學(xué)物質(zhì)提供檢測手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters 2695e高效液相色譜儀，配有Waters 2998二極管陣列檢測器、自動進(jìn)樣器和Empower 2工作站；Waters ACQUITY UPLC- Waters HDMS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；CAMAG紫外觀測箱。硅膠GF254,青島海洋化工分廠；碘、乙酸乙酯、乙醇為分析純，磷酸氫二銨、甲酸、三乙胺、甲醇、乙腈為色譜純。

林可霉素對照品：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號：K0101003；黃芪多糖提取物(25%)：實(shí)驗(yàn)室自制；樣品(3個(gè)批次的黃芪多糖注射液分別編為1號、2號和3號)均為市售產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 薄層色譜法 參照文獻(xiàn)方法[1，5]，取供試品1 mL，加甲醇-水(1∶1)至10 mL，作為供試品溶液。另取林可霉素對照品，用甲醇-水(1∶1)制成每1 mL中含5 mg的溶液作為對照品溶液。再取黃芪多糖提取物，加超純水制成每1 mL中含10 mg黃芪多糖的溶液作為陰性對照溶液[5]。照薄層色譜法，吸取上述三種溶液各3 μL，點(diǎn)于硅膠GF254板上，以乙酸乙酯-乙醇(1∶1)為展開劑，展開，晾干。置紫外光燈(254 nm)下檢視，再經(jīng)碘蒸氣熏蒸后，置紫外光燈(254 nm)下檢視。在與林可霉素對照品斑點(diǎn)相應(yīng)的位置上不得檢出斑點(diǎn)，否則用1.2.2方法驗(yàn)證。

1.2.2 高效液相色譜法

1.2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[6-7]，所用色譜柱為Waters Atlantis?T 3 4.6 mm×250 mm， id, 5 μm(十八烷基硅烷鍵合硅膠)。0.02 mol/L的磷酸氫二銨-乙腈(70∶30)為流動相；采用二極管陣列檢測器，采集波長范圍為190～400 nm，分辨率為1.2 nm；記錄194 nm波長處的色譜圖及光譜圖。

1.2.2.2 測定法 取供試品1 mL，加水-乙腈(70∶30)至100 mL，作為供試品溶液。取1.2.1陰性對照溶液1 mL，同法制成供試品陰性溶液，另取林可霉素對照品60 mg于25 mL量瓶中，加水-乙腈(70∶30)溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用水-乙腈(70:30)稀釋至刻度，作為對照品溶液。取供試品溶液和對照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖及光譜圖。供試品溶液中不得檢出與林可霉素對照品溶液主峰保留時(shí)間一致且光譜指數(shù)圖及最大吸收波長均一致的色譜峰，否則按1.2.3質(zhì)譜進(jìn)行確證。

1.2.2.3 回收率試驗(yàn) 取陰性對照溶液1 mL，分別精密添加林可霉素對照品40、50、60 mg，振搖使溶解，加水-乙腈(70∶30)至100 mL。每個(gè)濃度各制備3份平行樣，各取10 μL注入液相色譜儀，同時(shí)記錄光譜圖和194 nm波長處的色譜圖。

1.2.2.4 檢出限試驗(yàn) 對照品工作溶液：林可霉素對照品10 mg，置100 mL量瓶中，加水-乙腈(70∶30)溶解并稀釋至刻度，搖勻(100 μg/mL)。檢出限測試溶液：分別量取1.2.1陰性對照溶液1mL、對照品工作溶液5.0、 6.0、 7.0、8.0、 9.0、 10.0 mL置100 mL量瓶中，水-乙腈(70∶30)稀釋至刻度，搖勻(林可霉素的濃度分別為5、6、7、8、9、10 μg/mL)。取檢出限測試溶液10 μL注入液相色譜儀，同時(shí)記錄光譜圖和194 nm波長處的色譜圖。以光譜圖不失真的濃度作為檢出限。

1.2.3 質(zhì)譜方法確證 參考文獻(xiàn)方法[8-9]，色譜條件為Waters ACQUITY UPLC液相色譜儀；ACQUITY C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，id, 1.7 μm)；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；流動相為0.1%甲酸乙腈溶液，進(jìn)樣體積2 μL。

質(zhì)譜條件為Waters HDMS 四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Q-TOF MS)，離子源為電噴霧正電離模式(ESI+)，毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐孔電壓20 V；離子源及脫溶劑氣溫度分別為120 ℃和350 ℃；脫溶劑化氣體流速設(shè)為650 L/h。TOF MS質(zhì)量采集方式為全掃描，范圍為m/z50 至500Da，樣品分析前用甲酸鈉溶液進(jìn)行質(zhì)量數(shù)校正。另外，采用亮氨酸-腦啡肽溶液(LE，m/z566.2771)為Lock mass實(shí)時(shí)校正精確質(zhì)量數(shù)。

通過對比對照品溶液和供試品溶液色譜峰的保留時(shí)間及分子離子峰，來確證樣品中是否含有林可霉素。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜法 結(jié)果見圖1。紫外光燈(254 nm)下觀察結(jié)果：1號樣、林可霉素對照品和陰性對照均未見斑點(diǎn)；2號樣斑點(diǎn)較淺，3號樣展開兩個(gè)斑點(diǎn)。碘蒸氣熏蒸后置紫外光燈(254 nm)下觀察結(jié)果：1號樣中檢出一個(gè)暗黑色主斑點(diǎn)，與林可霉素對照品斑點(diǎn)一致；2號樣斑點(diǎn)顏色加深，3號樣斑點(diǎn)與碘蒸氣熏蒸前變化不明顯。懷疑1號樣為非法添加了林可霉素的黃芪多糖注射液，用高效液相色譜法(HPLC-PDAD)進(jìn)行進(jìn)一步檢測。

1:1號樣；2:2號樣；3:陰性對照；4:林可霉素對照品；5:3號樣;a：254 nm下檢視結(jié)果； b：碘蒸氣熏蒸后254 nm下檢視結(jié)果圖1 薄層色譜結(jié)果圖

2.2 高效液相色譜法 結(jié)果見圖2-圖3，1號樣主峰保留時(shí)間與林可霉素對照品峰的保留時(shí)間一致，且兩者光譜指數(shù)圖及最大吸收波長均一致，確認(rèn)1號樣中含有林可霉素。方法學(xué)研究結(jié)果見下表：平均回收率為97.8%，RSD為1.4%(表1)，檢出限為6 μg/mL，換算為在黃芪多糖注射液中的含量為0.06%。2.3 質(zhì)譜確證 結(jié)果見圖5， 1號樣溶液(圖中B)與林可霉素對照品溶液(圖中A)的選擇離子監(jiān)測色譜圖中峰保留時(shí)間(RT)一致均為1.14 min，1號樣中檢出的m/z為407.2成分與林可霉素對照品的407.2一致，證明1號樣中確實(shí)含有林可霉素。

圖2 林可霉素對照品光譜指數(shù)圖和色譜圖

圖3 1號樣光譜指數(shù)圖和色譜圖

a:光譜指數(shù)圖; b:色譜圖圖4 供試品陰性光譜指數(shù)圖和色譜圖

80%100%120%平均值RSD/%198.7%98.4%95.4%299.5%97.5%96.3%399.1%98.0%97.6%97.8%1.4

圖5 林可霉素對照品(A)和1號樣(B)全掃描質(zhì)譜圖及色譜圖

3 討論與小結(jié)

結(jié)果表明，在薄層色譜、高效液相色譜光譜和質(zhì)譜中，1號樣出現(xiàn)與林可霉素對照品一致結(jié)果，確證1號樣中含有林可霉素。陰性對照未出現(xiàn)與林可霉素相應(yīng)的薄層色譜斑點(diǎn)、色譜峰和光譜圖，對于本檢測方法無干擾，可用于判斷黃芪多糖注射液中是否非法添加林可霉素。質(zhì)譜確證中，1號樣溶液全掃描質(zhì)譜圖中除質(zhì)量數(shù)為407.2的峰外，還檢出其他峰，分析其為黃芪多糖注射液(含1%黃芪多糖)中的多糖降解物(各種小分子糖為主)和其他雜質(zhì)，另外林可霉素在黃芪多糖注射液中添加量較少，故樣品本底成分在質(zhì)譜中的響應(yīng)也相對明顯。

針對黃芪多糖注射液中非法添加林可霉素的檢查是一個(gè)常量分析(薄層色譜法即可檢出)，薄層色譜法和HPLC-PDAD法的無陰性干擾，考慮到HPLC-PDAD法的靈敏度和可靠性明顯優(yōu)于薄層色譜法，薄層色譜法又作為初篩方法，故在本試驗(yàn)中只對HPLC-PDAD法做進(jìn)一步方法學(xué)研究，測得平均回收率為97.8%，RSD為1.4%，檢出限為6 μg/mL，換算為在黃芪多糖注射液中的含量為0.06%。

本試驗(yàn)以市售的黃芪多糖注射液樣品為研究對象，首先采用薄層色譜法對3批樣品進(jìn)行初篩，陽性結(jié)果者采用高效液相色譜法(HPLC-PDAD)進(jìn)行檢測，將供試品色譜峰與對照品色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行比對，并比較二者紫外最大吸收波長及設(shè)定波長范圍內(nèi)光譜指數(shù)圖的相似性。最終用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)確證，結(jié)果確定樣品中有1批黃芪多糖注射液中非法添加了林可霉素。該方法可快速檢測黃芪多糖注射液中非法添加林可霉素，同時(shí)質(zhì)譜方法作為參考，在必要時(shí)可對檢測結(jié)果進(jìn)行確證。

[1] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版一部[S].

[2] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典獸藥使用指南化學(xué)藥品卷[S].

[3] 單體中, 汪以真.黃芪多糖的生物學(xué)功能及其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 中國飼料, 2006, (1):22-24.

[4] 中國獸藥典委員會. 國家獸藥標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品、中藥卷第一冊[S].

[5] 鄧樹勇, 馬啟龍, 丁燕. TLC法快速篩選抗風(fēng)濕類中成藥中的化學(xué)藥品[J].藥物分析雜志，2009(10):1719-1721.

[6] 黃滔敏, 段更利, 王東蕾. HPLC測定復(fù)方鹽酸去氧腎上腺素噴鼻液中鹽酸去氧腎上腺素、地塞米松磷酸鈉和鹽酸林可霉素的含量[J].復(fù)旦學(xué)報(bào),2010,5:598-600.

[7] 吳小紅,李煥德.高效液相色譜法-二極管陣列檢測器同時(shí)分析測定中成藥及保健品中非法添加的9種糖皮質(zhì)激素[J].中南藥學(xué),2009,5,7(5)324-327.

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(編輯：陳希)

Determination Methods of Lincomycin Illegally Adulterated into the Astragalus Polysaccharides Injection

LIU Zi-yang, DONG Ling-ling, BI Yan-feng, GUO Gui-fang, HAO Li-hua*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081，China)

The study was aimed to establish TLC and HPLC-PDAD methods for determination of lincomycin illegally adulterated into the astragalus polysaccharides injection, and then identified by LC-MS. The method of TLC was used as a pretest, then the methods of HPLC-PDAD and LC-MS were used to identify lincomycin illegally adulterated into the astragalus polysaccharides injection. HPLC-PDAD was performed on a column of Atlantis?T 3 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) at 194 nm. The mobile phase consisted of a mixture of a solution of 0.02 mol/L ammonium phosphate dibasic and acetonitrile(70:30)at a flow rate of 1.0 mL/min. The average recovery was 97.8% withRSDwas 1.4%. The limit of detection of the method was 6 μg/mL. It has been proved that there was lincomycin illegally adulterated into the astragalus polysaccharides injection based on the data of the spots in the chromatogram of TLC, the retention time of HPLC including ultraviolet spectra and the molecular ion mass spectra. The method is accurate and reliable, and can be used to lincomycin illegally adulterated into the astragalus polysaccharides injection.

lincomycin; the astragalus polysaccharides injection; TLC; HPLC; MS

劉自揚(yáng)，碩士，從事中獸藥檢測研究和評審工作。

郝利華。E-mail：haolihua@ivdc.org.cn

2015-12-24

A

1002-1280 (2016) 03-0056-04

S853.7