王樂，盧建國，王平平，欒培賢，王秋實，孫效文

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱150070）

黃顙魚cGnRH基因的篩選鑒定及生物信息學(xué)分析

王樂，盧建國，王平平，欒培賢，王秋實，孫效文

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱150070）

本研究在前期已獲得的黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco轉(zhuǎn)錄組基礎(chǔ)上，利用BLAST程序從中篩選獲得黃顙魚cGnRH基因的候選序列，再通過氨基酸序列分析從中篩選獲得cGnRH的全長cDNA為261bp，編碼86個氨基酸，其核心十肽的序列為QHWSHGWYPG，相對分子質(zhì)量為9 755.5、理論PI值為9.02。序列同源比對發(fā)現(xiàn)：黃顙魚與斑馬魚Danio rerio、草魚Ctenopharyngodon idella、鯉Cyprinus carpio中cGnRH氨基酸的相似性分別高達70.93%、68.60%和67.44%。用MEGA構(gòu)建的黃顙魚與其他27種硬骨魚cGnRH的Neighbour-joining進化樹發(fā)現(xiàn)，黃顙魚cGnRH先與脂鯉科的墨西哥麗脂鯉Astyanax mexican共聚類，再依次與鯉科的斑馬魚、草魚、黑頭呆魚Pimephales promelas、稀有鮈鯽Gobiocypris rarus等魚的cGnRH序列聚類。本研究首次篩選獲得黃顙魚的cGnRH序列，并利用生物信息學(xué)軟件進行鑒定分析，為后續(xù)的基因表達和cGnRH調(diào)節(jié)生長生殖作用的研究提供序列資源及基礎(chǔ)。

黃顙魚；促性腺激素釋放激素；序列分析

黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco主要產(chǎn)于長江支流，廣泛分布于長江、黑龍江、珠江等內(nèi)陸水域[1]。黃顙魚肉質(zhì)細嫩鮮美，無肌間刺，富含蛋白質(zhì)，是一種重要的淡水魚類，深受消費者喜愛的美味，具有重要的經(jīng)濟價值，在日本、韓國、東南亞等國家亦有巨大的市場，是出口創(chuàng)匯的優(yōu)良魚類[2]。但由于其生長較為緩慢，雌魚更甚，限制了黃顙魚的養(yǎng)殖及推廣[3]。

促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）是一個保守的神經(jīng)家族，具有調(diào)節(jié)生物性腺發(fā)育和誘導(dǎo)性成熟的作用。經(jīng)過幾十年的研究，已從多種脊椎動物和硬骨魚中獲得GnRH的基因序列[4]。一般在硬骨魚中有3種類型的GnRH基因：sbGnRH、cGnRH及sGnRH，其中sbGnRH的主要功效為調(diào)節(jié)促性腺激素的合成與釋放；cGnRH作為神經(jīng)遞質(zhì)間接參與魚類生長的生殖調(diào)節(jié)；sGnRH的功能與cGnRH相近，但并不存在于所有的硬骨魚中[5]。cGnRH廣泛存在于各種脊椎動物中，處于高度保守的進化地位[6]。目前，國內(nèi)外關(guān)于黃顙魚中GnRH基因的研究還處于初級階段。本研究在前期已獲得的黃顙魚轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，通過初步篩選、分析鑒定黃顙魚的cGnRH基因，為后續(xù)探索GnRH基因在黃顙魚生長發(fā)育及生殖代謝中的作用提供基因序列基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 候選基因的篩選與獲得

利用BLAST程序?qū)⒈菊n題組前期已測序獲得的黃顙魚轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)據(jù)與美國國家生物技術(shù)信息中心（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索數(shù)據(jù)庫中已公開發(fā)布的硬骨魚cGnRH基因進行比對，從中選擇相似度高的基因序列作為候選序列待測。

1.2 候選基因確定

利用DNAMAN 6.0軟件獲取候選基因的開放讀碼框序列（ORF）和各基因的氨基酸序列，比對核心十肽的序列，篩選獲得cGnRH的準(zhǔn)確序列。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用Expasy的Protparam工具分析cGnRH基因所編碼氨基酸序列的基本理化性質(zhì)，如相對分子質(zhì)量、理論PI值、氨基酸組成及不穩(wěn)定系數(shù)等信息；用Expasy的SOPMA功能分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；利用PredictProtein平臺進行功能預(yù)測與注釋。

1.4 親緣關(guān)系的分析

選取數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的其他種屬魚的cGnRH氨基酸序列，用Clustal X軟件比較、整理氨基酸序列的同源性，利用MEGA構(gòu)建cGnRH的Neighbour-joining進化樹，重復(fù)抽樣1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃顙魚cGnRH的序列分析

黃顙魚cGnRH的全長cDNA為261bp，編碼86個氨基酸（圖1），含有23個信號肽，其核心十肽的序列為QHWSHGWYPG。Expasy的Protparam工具分析結(jié)果表明：cGnRH的相對分子質(zhì)量為9 755.5、理論PI值為9.02，亮氨酸Leu（L）的含量最高，為17.4%，且不含有氨基酸Pyl（O）和Sec（U）。帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為8個，而帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為12個；理論計算得到的分子式為C441H708N120O119S5，總原子數(shù)為1 393個。除此之外，其不穩(wěn)定系數(shù)為37.28，說明該蛋白比較穩(wěn)定。脂肪系數(shù)為106.63，總平均吸水?dāng)?shù)為-0.029。為了更好地理解分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，利用DNAMAN軟件分析該cGnRH氨基酸序列的親水性（圖2）。

圖1 黃顙魚cGnRH的全長cDNA及氨基酸序列Fig.1 The full-length cDNA sequence and amino acid sequence of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

圖2 cGnRH的氨基酸序列親水性分析Fig.2 Hydrophilic analysis of amino acid sequence of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

用Expasy的SOPMA功能分析得到cGnRH氨基酸序列的α螺旋、β折疊及其他的二級結(jié)構(gòu)（圖3）。用PredictProtein平臺分析序列得到氨基酸組成示意圖（圖4），對序列的多功能區(qū)域進行注釋及特征預(yù)測所得到的結(jié)果如圖5所示。

2.2 cGnRH的比對分析

將本研究鑒定獲得的黃顙魚cGnRH氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的斑馬魚（NP_852104.3）、草魚（ACH78253.1）及鯉（AAO39753.1）等硬骨魚的cGnRH氨基酸序列進行比對。Clustal X比對結(jié)果表明，各硬骨魚的cGnRH氨基酸序列具有很高的相似性（圖6）。DNAMAN軟件分析的相似度結(jié)果表明，黃顙魚的cGnRH氨基酸序列與斑馬魚、草魚、鯉的相似性分別為70.93%、68.60%及67.44%。它們之間共同的相似性高達87.79%。這些比對結(jié)果證明了cGnRH保守性極高的同時，也進一步驗證了本研究所得序列的正確性。

2.3 親緣關(guān)系分析

選取NCBI數(shù)據(jù)庫中已公開發(fā)表的其他27個種屬硬骨魚的cGnRH氨基酸序列構(gòu)，采用其他種屬硬骨魚的檢索信息（表1），利用MEGA 4.0構(gòu)建黃顙魚cGnRH的系統(tǒng)進化樹（圖7）。結(jié)果表明：黃顙魚cGnRH先與脂鯉科的墨西哥麗脂鯉Astyanax mexican共聚類，再依次與鯉科的斑馬魚、草魚、黑頭呆魚Pimephales promelas、稀有鮈鯽Gobiocypris rarus等的cGnRH序列聚類，說明黃顙魚cGnRH序列與淡水魚，尤其是鯉科魚類的同源性較高，保守性較好，證明本研究所獲得的黃顙魚cGnRH序列的正確性。

圖3 黃顙魚cGnRH的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The secondary structure of cGnRH protein in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

圖4 cGnRH氨基酸組成示意圖Fig.4 The schematic diagram of amino acid composition of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

圖5 功能注釋及特征預(yù)測Fig.5 Functional annotation and feature prediction of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

表1 用于構(gòu)建親緣關(guān)系樹的其他物種序列信息Tab.1 The sequence information of other species used to construct phylogenetic trees

3 討論

本課題組前期利用高通量測序技術(shù)對雌雄黃顙魚不同發(fā)育時期的腦及性腺組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序，通過裝配整理及基因注釋獲得了大量的黃顙魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)資源，在此基礎(chǔ)上針對雌雄黃顙魚性別決定基因進行了大量的研究分析工作[7,8]。這些資源和成果為黃顙魚的生長發(fā)育調(diào)節(jié)和性狀研究提供了重要的基礎(chǔ)。本研究在這些成果的基礎(chǔ)上，進一步對生長調(diào)控基因GnRH進行挖掘和鑒定。

GnRH在魚類性腺發(fā)育和成熟的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中起重要作用。早在20世紀(jì)80年代，方永強等[9]就通過注射促性腺激素釋放素類似物（GnRH-A）誘導(dǎo)文昌魚性腺過早發(fā)育。GnRH基因的突變還會導(dǎo)致生物生殖生長異常變化。黎雙飛等[10]利用反義轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功實現(xiàn)了腦水平調(diào)控魚類性腺發(fā)育，獲得了敗育的轉(zhuǎn)基因鯉。這些研究充分證明了GnRH對魚類生長性狀的顯著調(diào)控作用。GnRH是下丘腦分泌的由10個氨基酸構(gòu)成的高度保守的肽類物質(zhì)[11]?，F(xiàn)階段已經(jīng)完成了包括鯉、斑馬魚、雙棘黃姑魚Protonibea diacanthus等在內(nèi)的許多魚類GnRH基因的序列分析及鑒定工作[12-14]。在已鑒定過的GnRH十肽中，1、4、9、10位的氨基酸序列都是完全保守的，基本結(jié)構(gòu)都是pGlu（1）—…—Ser（4）—…—Pro（9）-Gly（10）-NH2，這也為GnRH的篩選鑒定工作提供了重要的參考信息[10,15]。本研究所鑒定分析得到的黃顙魚cGnRH氨基酸序列也完全符合這一特點，含有23個信號肽和10個核心肽，這也與其他脊椎動物中的cGnRH基本結(jié)構(gòu)相一致[16-18]。

圖6 黃顙魚cGnRH與其他種屬魚的氨基酸序列比對Fig.6 Comparative sequence alignment of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco with other teleosts

圖7 黃顙魚cGnRH的系統(tǒng)進化樹Fig.7 The phylogenetic tree of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

魚腦中cGnRH主要分布在中腦區(qū)域，cGnRH肽不僅參與硬骨魚生長激素的調(diào)節(jié)，也與一些其他垂體激素的分泌密切相關(guān)[19]。大量研究表明，生長激素在調(diào)節(jié)魚類的生長生殖及性別分化中具有極為重要的作用[20]。本研究所鑒定獲得的黃顙魚cGnRH基因有待后續(xù)進一步驗證研究基因的表達，同時也為探索cGnRH對黃顙魚生長性狀的調(diào)節(jié)作用奠定了極為重要的前期工作基礎(chǔ)。

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Screening,Identification and Bioinformatics of cGnRH Gene in Yellow Catfish（Pelteobagrus fulvidraco）

WANG Le,LU Jian-guo,WANG Ping-ping,LUAN Pei-xian,WANG Qiu-shi,SUN Xiao-wen
（Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

In previous studies,our group has obtained transcription data of yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco,and in current study candidate sequences of cGnRH gene were screened and sequenced using the blast program and amino acid sequence analysis.Results showed that full-length cDNA of cGnRH was found to be 261 bp,encoding 86 amino acid sequences,with ten core peptides of QHW SHGWYPG,relative molecular mass of 9 755.5 and the theory PI of 9.02.The similarity of cGnRH amino acids in yellow catfish was as high as 70.93%to zebrafish Danio rerio,68.60%to grass carp Ctenopharyngodon idella,and 67.44%to common carp Cyprinus carpio.The neighbour-joining phylogenetic tree of cGnRH amino acids in yellow catfish and 27 other teleosts was established using MEGA.The cGnRH of yellow catfish was found to be co-clustered with Astyanax mexicanus in Characidae preferentially,then co-clustered with zebrafish,grass carp,Pimephales promelas and Gobiocypris rarus in Cyprinidae.The cGnRH sequence of yellow catfish was screened first time,and analyzed and identified using bioinformatics.The findings provide foundation for gene expression subsequently,and necessary sequence resources for analysis of the regulation of cGnRH in reproduction and growth.

Pelteobagrus fulvidraco;GnRH;sequence analysis.

S917.4

A

1005-3832（2016）04-0001-05

2016-04-29

黑龍江省科學(xué)基金項目（QC2016045）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（HSY201505）.

王樂（1988-），男，助理研究員，博士研究生，從事分子生物學(xué)與生物技術(shù)研究.E-mail:wangle0455@163.com

孫效文（1955-），研究員，博士生導(dǎo)師.