金舒博，張穎，關(guān)海紅，傅洪拓，蔣速飛，熊貽偉，喬慧，張文宜，龔永生，吳滟

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214081；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

青蝦幼蝦發(fā)育時(shí)期性腺發(fā)育組織學(xué)研究

金舒博1,2，張穎3，關(guān)海紅3，傅洪拓1,2，蔣速飛2，熊貽偉2，喬慧2，張文宜2，龔永生2，吳滟2

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214081；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

采用組織切片及類固醇激素含量測(cè)定等方法，研究青蝦Macrobrachium nipponense幼蝦發(fā)育第1～31d的精巢、卵巢及促雄腺發(fā)育的起始時(shí)間、發(fā)育過程及成熟時(shí)間。結(jié)果表明：青蝦幼蝦發(fā)育到第10d（PL10）時(shí)促雄腺呈索狀結(jié)構(gòu)開始發(fā)育，隨后經(jīng)歷增殖期（PL10）、合成期（PL13）和分泌期（PL19）3個(gè)發(fā)育階段發(fā)育成熟，形成完整的促雄腺。青蝦精巢和卵巢均在幼蝦發(fā)育第13d（PL13）開始發(fā)育，精巢形成不規(guī)則排列的精原細(xì)胞，而卵巢生殖上皮開始分化為橢圓或多邊形的卵原細(xì)胞。精巢經(jīng)精原細(xì)胞期（PL13）、精母細(xì)胞期（PL16）、精細(xì)胞期（PL19）和精子期（PL22）4個(gè)發(fā)育階段成熟，此時(shí)成熟的精巢生精小管內(nèi)充滿成熟的精子。卵巢經(jīng)卵原細(xì)胞期（PL13）、初級(jí)卵母細(xì)胞期（PL16）、次級(jí)卵母細(xì)胞期（PL16）和卵子期（PL19）4個(gè)時(shí)期發(fā)育成熟，此時(shí)卵巢充滿成熟卵子。從PL1到PL22，睪酮分泌量逐漸增加，維持在穩(wěn)定水平至PL25后逐漸下降；從PL1到PL19，17β-雌二醇的分泌量逐漸增加，維持在穩(wěn)定水平至PL25后逐漸下降。本研究顯示：促雄腺與精巢發(fā)育過程均持續(xù)10d，但促雄腺早于精巢3d開始發(fā)育和成熟，這可為性別和生殖相關(guān)基因的篩選及性別調(diào)控機(jī)制的研究提供參考。

青蝦；組織學(xué)觀察；類固醇激素測(cè)定；性腺發(fā)育；性早熟

青蝦Macrobrachium nipponense（日本沼蝦）是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類，養(yǎng)殖范圍廣泛。青蝦的雌雄個(gè)體生長差異顯著，雄性個(gè)體的生長速度明顯快于雌性，同齡雄蝦的大小約為雌蝦的2～2.5倍[1]。青蝦全雄群體養(yǎng)殖具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

促雄腺（androgenic gland）又稱為促雄性腺，與性別分化、雄性發(fā)育及維持有關(guān)，在甲殼類性別調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]，可促使甲殼動(dòng)物向雄性方向發(fā)育[3]。在性別分化的早期，植入促雄腺或注射促雄腺提取物可導(dǎo)致雌性甲殼動(dòng)物出現(xiàn)雄性第二性征而雄性化[4]；性別已經(jīng)分化的個(gè)體，人為摘除或植入促雄腺可使性逆轉(zhuǎn)，改變生理性別。圍繞促雄腺開展的研究已成為近些年來甲殼動(dòng)物性別決定相關(guān)研究的重點(diǎn)。目前已研究了青蝦[5]、凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus cannamei[6]、鋸緣青蟹Scylla serrata[7]、三疣梭子蟹Portunus trituberculatus[8]、中華絨螯蟹Eriocheir sinensis[9]等甲殼動(dòng)物成體促雄腺的組織學(xué)。但尚未開展有關(guān)幼蝦發(fā)育過程中促雄腺的組織學(xué)研究，如青蝦促雄腺分化的起始時(shí)間、發(fā)育過程及成熟時(shí)間等。

性早熟是青蝦養(yǎng)殖過程中的嚴(yán)重問題。在繁殖季節(jié)，雌蝦卵巢發(fā)育周期非常短，新繁育的雌蝦性腺成熟早，可以在發(fā)育45d后與雄蝦交配產(chǎn)卵，導(dǎo)致多代同塘、種質(zhì)退化、養(yǎng)殖密度增大等問題，嚴(yán)重制約青蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[10]。因此，開展青蝦性腺發(fā)育的研究對(duì)性腺發(fā)育調(diào)控至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)采用組織學(xué)切片方法研究青蝦幼蝦發(fā)育過程中促雄腺及性腺發(fā)育，以確定促雄腺及性腺分化的起始時(shí)間、發(fā)育過程及成熟時(shí)間；測(cè)定睪酮和17β-雌二醇的分泌量，探討類固醇激素分泌對(duì)青蝦精巢及卵巢發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

野生健康的抱卵雌蝦購于無錫太湖邊，體質(zhì)量為3.78～5.26g，養(yǎng)殖于實(shí)驗(yàn)室中，24h充氣，水溫維持在30℃。日換水量約為總水量的1/2，每天投喂2次，直到受精卵進(jìn)入幼蝦發(fā)育期。

1.2 方法

組織學(xué)觀察：從幼蝦發(fā)育第1～31d，每隔3d取樣一次，每次取8只幼蝦固定于Bouin氏固定液中，用于組織學(xué)觀察。實(shí)驗(yàn)蝦的體質(zhì)量見表1。常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚6μm。Ehrlich氏蘇木精與伊紅對(duì)比染色，Olympus SZX16顯微鏡下觀察。

表1 組織學(xué)研究中實(shí)驗(yàn)蝦的體質(zhì)量Tab.1 The body weight of oriental river prawn（Macrobrachium nipponense）in histological observation

1.3 類固醇激素測(cè)定

從幼蝦發(fā)育第1～31d，每隔3d取樣一次，每次取10只用于測(cè)定類固醇激素。實(shí)驗(yàn)蝦的體質(zhì)量見表2。實(shí)驗(yàn)蝦取樣后立即保存在-20℃環(huán)境中。用Beckman Coulter Access 2測(cè)定類固醇激素的分泌量。用甲醇提取睪酮及17β-雌二醇，用BECKMAN ACESSⅡT和E2試劑盒分別測(cè)定睪酮及17β-雌二醇的分泌量。

2 結(jié)果與分析

2.1 促雄腺的組織結(jié)構(gòu)及變化

增殖期：在PL10，促雄腺開始形成而進(jìn)入增殖期。此期，促雄腺體積較小，成索狀結(jié)構(gòu)，形成少量促雄腺細(xì)胞。細(xì)胞體積小，直徑約為5.67～8.69μm。細(xì)胞核呈較強(qiáng)的嗜堿性（圖1-1）。

合成期：在PL13，促雄腺發(fā)育進(jìn)入合成期。此期，促雄腺腺體及腺細(xì)胞均明顯增大，腺細(xì)胞呈圓形或橢圓形，直徑為12.98～17.67μm。腺細(xì)胞弱嗜堿性。腺體細(xì)胞已成典型的腺泡結(jié)構(gòu)，血竇較為清晰（圖1-2）。

分泌期：在PL19，促雄腺發(fā)育進(jìn)入分泌期。此期，促雄腺發(fā)育成熟，腺體呈泡狀化，含嗜堿性顆粒。腺細(xì)胞已不再有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，核完全固化，體積很小。促雄腺與輸精管肌層的連接變得疏松，有從其表面脫落的趨勢(shì)，輸精管中充滿成熟的精子（圖1-3、圖1-4）。

表2 測(cè)定類固醇激素含量實(shí)驗(yàn)中青蝦的體質(zhì)量Tab.2 The body weight of oriental river prawn（Macrobrachium nipponense）for steroid analysis

圖1 青蝦幼蝦發(fā)育過程中促雄腺的發(fā)育Fig.1 The development of androgenic gland in post-larva prawn

2.2 精巢的結(jié)構(gòu)及變化

精原細(xì)胞期：在PL13，精巢發(fā)育進(jìn)入精原細(xì)胞期。在這一時(shí)期，精原細(xì)胞開始逐漸形成。精巢體積很小，輸精管充滿了排列不規(guī)則的精原細(xì)胞（圖2-1）。

精母細(xì)胞期：在PL16，精巢發(fā)育進(jìn)入精母細(xì)胞期。在這一時(shí)期，精巢及輸精管體積顯著增大。處于這一時(shí)期的精巢包含初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞及少量的精原細(xì)胞。大多數(shù)剩余的精原細(xì)胞正處于分化狀態(tài)（圖2-2）。

精細(xì)胞期：在PL19，精巢發(fā)育進(jìn)入精細(xì)胞期。在這一時(shí)期，精巢體積進(jìn)一步增大，仍可發(fā)現(xiàn)一些精母細(xì)胞及精原細(xì)胞，及少量成熟的精子（圖2-3）。生精小管繼續(xù)變大，營養(yǎng)物質(zhì)散布在精細(xì)胞中。

精子期：在PL22，精巢發(fā)育進(jìn)入精子期。在這一時(shí)期，精巢發(fā)育成熟，生精小管內(nèi)充滿著成熟的精子，但腔內(nèi)仍有一定量的精母細(xì)胞（圖2-4）。

退化期：在PL22，精巢發(fā)育進(jìn)入退化期。此時(shí)，精巢發(fā)育停止，成熟的精子被排出。精巢進(jìn)入新的發(fā)育周期，殘存的精原細(xì)胞開始恢復(fù)增殖（圖2-5）。

2.3 卵巢的組織結(jié)構(gòu)及變化

卵原細(xì)胞期：在PL13，卵巢開始發(fā)育進(jìn)入卵原細(xì)胞期。此時(shí)，生殖上皮分化出的卵原細(xì)胞呈橢圓或多邊形，細(xì)胞最大直徑為40.7～101.5μm。細(xì)胞核大，約占細(xì)胞體積的4/5。核中央有1個(gè)大而明顯的核仁。細(xì)胞質(zhì)僅在核外一薄層（圖3-1）。

圖2 青蝦幼蝦發(fā)育過程中精巢的發(fā)育Fig.2 The development of testis in post-larva prawn

圖3 青蝦幼蝦發(fā)育過程中卵巢的發(fā)育Fig.3 The development of ovary in post-larva prawn

圖4 青蝦幼蝦發(fā)育期睪酮及17β-雌二醇的分泌量Fig.4 The contents of testosterone and 17β-estradiol in the post-larva prawn

初級(jí)卵母細(xì)胞期：在PL16，卵巢發(fā)育進(jìn)入初級(jí)卵母細(xì)胞期。此時(shí)，卵原細(xì)胞體積逐漸變大，變?yōu)閳A形或橢圓形，成初級(jí)卵母細(xì)胞，最大細(xì)胞直徑為55.7～129.1μm。核質(zhì)比例相對(duì)減小，無卵黃積累，細(xì)胞質(zhì)區(qū)增厚是營養(yǎng)物質(zhì)開始增長的預(yù)兆（圖3-2）。

次級(jí)卵母細(xì)胞期：在PL16，卵巢發(fā)育進(jìn)入次級(jí)卵母細(xì)胞期。此時(shí)，營養(yǎng)物質(zhì)迅速積累，空泡內(nèi)外已有卵黃粒積累。卵黃的堆積使得卵細(xì)胞體積大幅增加，最大細(xì)胞直徑可達(dá)69.5～164.7μm。細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，圓形，有數(shù)個(gè)小核仁（圖3-3）。

卵子期：在PL19，卵巢發(fā)育進(jìn)入卵子期。卵巢發(fā)育成熟并生成卵子。此時(shí)營養(yǎng)物進(jìn)入成熟期。卵黃顆粒在空泡內(nèi)外先后沉積，充塞了幾乎全部細(xì)胞，使得卵細(xì)胞相互擠壓呈多邊形，最大直徑為409.5～517.3μm。已不見細(xì)胞核（圖3-4）。

退化期：在PL19，卵巢進(jìn)入退化期。此時(shí)，卵巢中成熟的卵子排出，剩余的卵原細(xì)胞回到初級(jí)卵母細(xì)胞期，并開始恢復(fù)生殖功能，卵巢進(jìn)入新的發(fā)育周期。

2.4 睪酮與17β-雌二醇的分泌量

青蝦幼蝦發(fā)育過程中睪酮的分泌量從PL1的33.69pg/尾逐漸增加到PL22的69.27pg/尾，然后維持在穩(wěn)定水平到PL25，之后開始逐漸下降；17β-雌二醇的分泌量從PL1的10.26pg/尾逐漸增加到PL19的19.77pg/尾，然后維持在穩(wěn)定水平到PL25，之后開始逐漸下降（圖4）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：在性腺發(fā)育成熟期，睪酮與17β-雌二醇的分泌量顯著高于其他發(fā)育階段（P＜0.05）。

3 討論

3.1 促雄腺發(fā)育研究

促雄性腺與性別分化、雄性發(fā)育及維持有關(guān)，在甲殼類性別調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2]。根據(jù)促雄腺發(fā)育的形態(tài)變化，可將甲殼動(dòng)物的促雄腺分為不同的發(fā)育階段，如鯨螯蝦Orconectes nais的促雄腺分為4個(gè)發(fā)育時(shí)期[11]，長額蝦Pandalus platyceros分為6個(gè)時(shí)期[12]，中華絨螯蟹劃分為3個(gè)時(shí)期[13]。根據(jù)組織學(xué)觀察，青蝦促雄腺在PL10開始分化，隨后經(jīng)歷增殖期（PL10）、合成期（PL13）和分泌期（PL19），在PL19發(fā)育成熟，形成完整的促雄腺結(jié)構(gòu)。而在PL10時(shí)，性腺原基已發(fā)育成熟，可分化為精巢或卵巢。

3.2 精巢和卵巢發(fā)育的研究

青蝦精巢在PL13開始分化，隨后經(jīng)歷精原細(xì)胞期（PL13）、精母細(xì)胞期（PL16）、精細(xì)胞期（PL19）和精子期（PL22）4個(gè)發(fā)育時(shí)期，在PL22發(fā)育成熟。促雄腺與精巢發(fā)育過程均持續(xù)10d，但促雄腺早于精巢3d開始發(fā)育和成熟，表明促雄腺的發(fā)育可調(diào)控精巢發(fā)育[5]。溪蟹Potamon koolooense的促雄腺和精巢發(fā)育與本文中所述的結(jié)果相似，當(dāng)促雄腺最大時(shí)，精巢剛好啟動(dòng)精子發(fā)生；當(dāng)精子發(fā)育時(shí)，促雄腺逐漸縮小[14]。卵巢也從PL13開始分化，隨后經(jīng)歷卵原細(xì)胞期（PL13）、初級(jí)卵母細(xì)胞期（PL16）、次級(jí)卵母細(xì)胞期（PL16）、卵子期（PL19），在PL19發(fā)育成熟。與其他的水產(chǎn)物種相似，青蝦精巢和卵巢經(jīng)歷4個(gè)發(fā)育時(shí)期，直至成熟并退化[15-18]。測(cè)定睪酮及17β-雌二醇的分泌量已為多種水產(chǎn)動(dòng)物的性腺發(fā)育提供了依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中，睪酮的分泌量從PL1到PL22逐漸上升，并維持在穩(wěn)定的分泌水平直到PL25，然后逐漸下降；然而，17β-雌二醇的分泌量從PL1～PL19逐漸上升，并維持在穩(wěn)定的分泌水平直到PL25，然后逐漸下降。該結(jié)果與組織學(xué)觀察結(jié)果一致，證明精巢在PL22發(fā)育成熟，而卵巢在PL19發(fā)育成熟。類固醇激素在幼蝦發(fā)育后期分泌量下降表明，精巢和卵巢進(jìn)入了新的發(fā)育周期。該結(jié)果說明，近親繁殖不但發(fā)生在新生的雌蝦與親本雄蝦之間，還可以發(fā)生在新生雄蝦與親本雌蝦之間，這嚴(yán)重制約著青蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。Zhang等[19]報(bào)道，在28℃水溫條件下，青蝦在PL11可觀察到性腺原基，卵巢在PL18開始分化，而精巢在PL20開始分化。該結(jié)果顯示，溫度可顯著促進(jìn)青蝦性腺的發(fā)育。

組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，同一天發(fā)育的幼蝦的性腺發(fā)育狀況差異極顯著。例如，在PL19實(shí)驗(yàn)蝦中，體質(zhì)量為0.0289g的幼蝦卵巢僅發(fā)育到初級(jí)卵母細(xì)胞期，而體質(zhì)量為0.0466g及0.0517g的幼蝦卵巢則分別發(fā)育到次級(jí)卵母細(xì)胞期及卵子期。另外在PL22，體質(zhì)量為0.0254g的幼蝦精巢僅發(fā)育到精母細(xì)胞期，而體質(zhì)量為0.0756g及0.1117g的幼蝦精巢則分別發(fā)育到精細(xì)胞期及精子期。該結(jié)果表明，青蝦精巢和卵巢的發(fā)育狀況與其體長及體質(zhì)量顯著相關(guān)。

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Histological Observation of Gonadal Development During Post-larva in Oriental River Prawn,Macrobrachium nipponense

JIN Shu-bo1,2,ZHANG Ying3,GUAN Hai-hong3,FU Hong-tuo1,2,JIANG Su-fei2,XIONG Yi-wei2, QIAO Hui2,ZHANG Wen-yi2,GONG Yong-sheng2,WU Yan2
（1.Wuxi Fisheries College,Nanjing Agricultural University,Wuxi 214081,China; 2.Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization,Ministry of Agriculture,Freshwater Fisheries Research Center,Chinese Academy of Fishery Sciences,Wuxi 214081,China; 3.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

In this study,histological method and steroid hormone detection were used to analyze the beginning period,developmental process and mature period of gonad including testes,ovary,and androgenic gland during post-larvae of oriental river prawn（Macrobrachium nipponense）.The histological analysis revealed that the initial development of funicular androgenic gland with a few androgenic gland cells was observed at post-larval stage of 10 days（PL10）.The androgenic gland development was divided into 3 developmental stages:proliferating phase at PL10,synthesis phase at PL13 and secretary phase PL19,full maturity at PL19.Both small testes and ovary were found to begin to develop at PL13 when the spermatogonia with irregular arrangement were the first time observed. Oogonia differentiated from germinal epithelia were oval or polygon in shape.The testis development was divided into 4 stages including spermatogonium stage,spermatocyte stage,sperm cell stage and sperm stage and matured at PL22 when the seminiferous tubule of matured testis was filled with mature spermatozoa.The ovary development was divided into 4 stages including oogonia stage,primary oocyte stage,secondary oocyte stage and ovum stage,matured at PL19 when the matured ovary was full of ovum.The 17β-E2 levelwas shown to be gradually increased from 10.26 pg/prawn at PL1 to 19.77 pg/prawn at PL19,constant until PL25,and then the 17β-E2 level was gradually decreased.The level of 17α-T,however,was gradually increased from 33.69 pg/prawn at PL1 to 69.27 pg/prawn at PL22,constant until PL25,and then gradually decreased.Both androgenic gland and gonad were developed in 10 days,3 days earlier in development and maturity of androgenic gland than those in gonad.The findings provide information for the screening of the genes related to sexual differentiation and reproduction and for the mechanism of sex control during the developmental process.

Macrobrachium nipponense;histological observation;steroid hormone detection;gonadal development;sexual precocity

S954.48

A

1005-3832（2016）04-0011-06

2016-05-16

中央級(jí)科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2015JBFM11）；國家自然科學(xué)基金（31502154）.

金舒博（1986-），男，助理研究員，從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種研究.E-mail:jinsb@ffrc.cn

傅洪拓（1964-），研究員，博士生導(dǎo)師，從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種研究.E-mail:fuht@ffrc.cn