于競杰,馮二凱,尹茉莉,任飛,盛程程,胡桂學(xué),陳立志*
(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長春 130118;2.吉林特研生物技術(shù)有限責任公司,長春 130112)[收稿日期] 2016-06-29 [文獻標識碼]A [文章編號]1002-1280 (2016) 09-0001-05 [中圖分類號]S852.65
生物反應(yīng)器中PRRSV TJM株在Marc-145細胞上最佳增殖條件研究
于競杰1,2,馮二凱2,尹茉莉2,任飛2,盛程程1,2,胡桂學(xué)1*,陳立志2*
(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長春 130118;2.吉林特研生物技術(shù)有限責任公司,長春 130112)[收稿日期] 2016-06-29 [文獻標識碼]A [文章編號]1002-1280 (2016) 09-0001-05 [中圖分類號]S852.65
為了在Marc-145細胞上獲得更高滴度的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)TJM株,對細胞培養(yǎng)條件、細胞接種量、微載體的用量以及病毒培養(yǎng)時間等條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明,利用生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)Marc-145細胞在血清為金源康且含量為10%、培養(yǎng)基為DMEM、細胞接種密度為20~30細胞/球、微載體為5 g等條件下生長狀態(tài)最好;病毒最佳培養(yǎng)時間為27~36 h,病毒增殖效果好且能夠達到最高的病毒滴度。本試驗為微載體培養(yǎng)條件下大規(guī)模生產(chǎn)PRRSV-TJM株疫苗奠定了一定理論基礎(chǔ)。
PRRSV;Marc-145細胞;微載體;生物反應(yīng)器
SHENG Cheng-cheng1,2, HU Gui-xue1*, CHEN Li-zhi2*
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的二類傳染病[1]。在20世紀80年代美國首次報道了該病[2]。1991年荷蘭成功分離到該病毒并命名為Lelystad病毒[3-4]。1996年郭寶清等人在國內(nèi)某豬場首次分離出PRRSV,并命名為CH-1α株[5]。直到2006年我國首次爆發(fā)了高致病性呼吸與繁殖綜合征,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[6]。由于病毒經(jīng)過周期性擴張,出現(xiàn)基因交換[7],導(dǎo)致新亞型病毒出現(xiàn)。隨后許多高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定被相繼報道[8]。培養(yǎng)PRRSV常用的細胞系有豬肺泡巨噬細胞(PAM)、MA-104細胞以及Marc-145細胞等。伴隨著國家第1708號公告的頒布,血清價格不斷上漲的壓力以及市場對于高質(zhì)量疫苗需求,國內(nèi)外越來越多的企業(yè)和研究機構(gòu)都著手進行PRRSV工藝革新,目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于PRRSV TJM株的報道。本研究采用Marc-145細胞在生物反應(yīng)器中不同培養(yǎng)條件下對PRRSV增殖的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,為疫苗的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 細胞、毒株、血清和培養(yǎng)基 Marc-145細胞由吉林特研生物技術(shù)有限責任公司保存,并經(jīng)過傳代培養(yǎng)至第10代進行試驗;PRRSV TJM毒株(第78代)由吉林特研生物技術(shù)有限責任公司保存;金源康血清(批號20150629)購自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司;草原綠野血清(批號140101001)購自呼和浩特市草原綠野生物工程材料有限公司;MEM與DMEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司(批號160110400PM);微載體cytodex-1(批號17044803)購自GE公司。
1.1.2 儀器 生物反應(yīng)器購自廣州奇志公司(型號BC-7L);細胞計數(shù)儀Countstar購自上海樂純生物技術(shù)有限公司(型號IC1000)。
1.2 方法
1.2.1 Marc-145細胞的復(fù)蘇 從液氮罐取出凍存的細胞,放入到37 ℃水浴鍋中,輕輕搖晃使之融化,在超凈臺內(nèi)吸出細胞懸液加入細胞培養(yǎng)瓶中并補加培養(yǎng)液置于37 ℃ 5% CO2恒溫箱中,細胞貼壁后換液1次,繼續(xù)培養(yǎng)細胞直至細胞長滿單層。
1.2.2 Marc-145細胞傳代及轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 將長滿單層的Marc-145細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液棄掉,用PBS進行沖洗1~2遍,加入0.25%的胰酶1 mL輕輕搖晃細胞培養(yǎng)瓶使細胞充分接觸胰酶后棄掉,放入溫箱待細胞培養(yǎng)瓶“發(fā)霧”并有針狀空隙后加入含8%血清的MEM培養(yǎng)液終止消化,用移液器反復(fù)吹打細胞平均分成4個瓶并補加培養(yǎng)液。待每個細胞培養(yǎng)瓶形成Marc-145細胞單層,按照上述方法進行消化及終止,準備好一個1 L含8%血清DMEM細胞培養(yǎng)液,將這4個T125細胞瓶的細胞用移液槍吸取7~8 mL分別加入反應(yīng)體系中充分混勻,最后將1 L的細胞液倒入10 L轉(zhuǎn)瓶中,蓋上瓶塞放入轉(zhuǎn)瓶機進行培養(yǎng)。
1.2.3 轉(zhuǎn)瓶Marc-145細胞上生物反應(yīng)器培養(yǎng) 待轉(zhuǎn)瓶Marc-145細胞在顯微鏡下觀察其長滿致密單層細胞,按照方瓶消化細胞的方法進行消化,然后將細胞用移液器進行反復(fù)吹打混勻并將細胞懸液加入到1 L含8% DMEM中混勻后吸取1 mL進行細胞計數(shù),最后將該1 L細胞液利用管道打入生物反應(yīng)器內(nèi),調(diào)節(jié)好四氣(CO2、O2、N2、Air)并調(diào)至自動,7.5%的碳酸氫鈉溶液調(diào)至自動添加,轉(zhuǎn)速調(diào)至60 r/min進行懸浮培養(yǎng)。
1.2.4 病毒的復(fù)壯 取總體積為10 L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的長滿單層的Marc-145細胞棄去營養(yǎng)液,加入1 mL稀釋好的病毒液,37 ℃吸附60 min,期間每20 min搖晃1次以使病毒與細胞充分接觸,60 min后補加維持液置于CO2溫箱中并每天觀察細胞病變情況,當CPE達到80%,反復(fù)凍融3次后置于-20 ℃保存。
1.2.5 TCID50的測定 方瓶細胞長滿單層時,按106/mL細胞濃度向96孔板中每孔加入150 μL的細胞懸液,然后輕輕震蕩96孔板,使細胞分散均勻然后置于37 ℃的CO2溫箱中培養(yǎng),將待測病毒進行10倍系列稀釋至10-7,同時設(shè)立未接毒的細胞作為陰性對照,對96孔板細胞進行滴定,參照Reed-Muench法來計算TCID50。
1.2.6 最佳血清及培養(yǎng)基試驗 在保證微載體量和接種細胞一定的條件下,采用分批式培養(yǎng)Marc-145細胞微載體懸浮培養(yǎng)PRRSV,分別做不同批次的10%草原綠野血清+MEM培養(yǎng)基、10%金源康血清+MEM培養(yǎng)基、10%金源康血清+DMEM培養(yǎng)基,并在不同批次不同的時間段進行取樣后進行病毒的滴定,測出這3組的TCID50,算出不同批次同一時間點的TCID50的平均值,試驗進行了3次重復(fù)性試驗,取最接近平均值的數(shù)據(jù)進行分析并繪制折線圖,通過比較可以得出該工藝的最佳血清和培養(yǎng)基。1.2.7 最佳細胞接種量試驗 采用3個細胞接種量梯度進行試驗:10~20 cells/球(2.15×105~4.3×105)、20~30 cells/球(4.3×105~6.45×105)、30~40 cells/球(6.45×105~8.6×105)。在確定最優(yōu)培養(yǎng)基和血清的條件下,保證微載體量一定時按照不同的初始上罐細胞濃度進行微載體懸浮培養(yǎng),通過比較他們在24 h、48 h和72 h顯微鏡下圖觀察細胞生長狀態(tài)差異情況以及在接毒后不同時間段取樣并測量病毒的TCID50來綜合考慮得出該最佳細胞接種量。
1.2.8 最佳微載體量試驗 在血清、培養(yǎng)基和細胞接種量為最佳的條件下,分別做不同批次的3 g、5 g和8 g微載體進行試驗,通過比較空球率的大小及接毒后病毒的TCID50來確定最佳微載體的含量。
1.2.9 病毒最佳培養(yǎng)時間試驗 分別做不同批次及不同條件微載體懸浮試驗,經(jīng)過了五次的重復(fù)性試驗,選取了最具有代表性的三個批次結(jié)果進行簡要分析,通過比較不同批次接毒后的TCID50,以其中TCID50最高者所對應(yīng)的取樣時間為最佳病毒培養(yǎng)時間。
2.1 病毒復(fù)壯后病毒滴度 病毒復(fù)壯后其病毒滴度為107.2TCID50/mL。
2.2 血清和培養(yǎng)基的選擇 結(jié)果見圖1。
圖1 不同血清及培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)Marc-145細胞在不同時間點微載體顯微形態(tài)觀察
通過觀察圖1中三組細胞顯微鏡下的生長形態(tài)可以看出:A組中細胞大部分沒有長到載體上,而D組空球較少,因此可以得出血清應(yīng)該選用金源康;G組和D組在24 h細胞生長差異不大,但到72 h可以看出G組細胞輪廓清晰且每個球都長滿細胞而F組仍然有沒有長滿的球。
為了進一步驗證所選血清和培養(yǎng)基,我們對培養(yǎng)72 h后的細胞進行病毒的滴定,測得TCID50結(jié)果如圖2所示。經(jīng)過比較可以看出,圖2-C中的TCID50數(shù)值明顯高于另外2組,所以最佳血清和培養(yǎng)基的選擇為金源康血清和DMEM培養(yǎng)基。
圖2 不同血清和培養(yǎng)基條件下的TCID50取樣分布圖
圖3 不同梯度的細胞接種量微載體顯微鏡下的形態(tài)觀察
2.3 最佳細胞接種量試驗 Marc-145細胞在載體上生長結(jié)果見圖3。10~20 cells/球上罐經(jīng)過24 h取樣,顯微鏡下觀察出現(xiàn)大量空載體,極少數(shù)細胞能夠長在載體上,直到培養(yǎng)至72 h,載體上的細胞仍然沒有長到致密球體。20~30 cells/球和30~40 cells/球的試驗,接種后72 h內(nèi)都能獲得足夠數(shù)量的細胞,病毒的滴度達到108.5TCID50/mL。但以40 cells/球的接種,培養(yǎng)48 h后載體上的細胞過多導(dǎo)致細胞有脫落,72 h有細胞老死脫落現(xiàn)象和大量的細胞碎片,接毒后病毒的滴度最高也只能達到107.75TCID50/mL。本梯度試驗進行了大量重復(fù)性試驗,如10~20 cells/球這一梯度,進行了(10、13、15和18 cells/球)試驗,同理20~30 cells/球和
30~40 cells/球也進行了多次試驗,選取各個梯度細胞生長差異明顯的一組為10 cells/球、25 cells/球和40 cells/球進行了分析和說明。2.4 最佳微載體量試驗 我們在保證一定細胞接種量,一定血清和培養(yǎng)基的條件下,微載體量按3 g/L、5 g/L和8 g/L進行試驗。經(jīng)過多個批次的大量重復(fù)性試驗,取樣觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn):微載體為3 g/L時,每個載體上的細胞過多,當培養(yǎng)到72 h,細胞生長過密,導(dǎo)致細胞從載體上脫落,致使細胞懸液中出現(xiàn)大量死細胞及細胞碎片;微載體為5 g/L時,每個載體都有細胞,沒有空球出現(xiàn)而且細胞量適中,接毒后的不同時間段內(nèi)取樣,病毒的滴度都能在108TCID50/mL以上;微載體為8 g/L時,取樣顯微鏡下觀察出現(xiàn)大量的空球,極少數(shù)細胞長在載體上,培養(yǎng)至72 h也沒有長滿致密球體,不滿足接毒條件。2.5 病毒最佳培養(yǎng)時間試驗 Marc-145細胞在生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)至致密球體后進行接毒(MOI=0.05),在不同時間段內(nèi)進行取樣觀察細胞病變情況并進行病毒的滴定及TCID50的測定,所做的三個批次是基于不同條件(草原綠野血清+MEM培養(yǎng)基、金源康血清+MEM培養(yǎng)基、金源康血清+DMEM培養(yǎng)基)進行試驗,TCID50最高者為最佳病毒培養(yǎng)時間,結(jié)果見圖4。在不同條件下生物反應(yīng)器培養(yǎng)PRRSV,其最佳病毒培養(yǎng)時間確定為27~36 h。
圖4 不同培養(yǎng)條件及不同取樣時間的TCID50分布圖
細胞的微載體技術(shù)是動物細胞培養(yǎng)中最先進的技術(shù)之一,為細胞的大量生產(chǎn)提供了可能,即從>小培養(yǎng)體積得到高產(chǎn)量的細胞。本實驗研究10~20、20~30和30~40 cells/球的細胞接種密度對細胞在微載體上生長的影響,結(jié)果表明細胞接種量過少則會出現(xiàn)大量空球,也會影響病毒的滴度,細胞接種量過高,培養(yǎng)至72 h出現(xiàn)脫落現(xiàn)象以及伴有大量細胞碎片,對細胞有毒性作用,從而降低細胞活性,導(dǎo)致病毒滴度不高于107.75TCID50/mL。在研究3、5和8 g/L的最佳微載體量試驗時,消化所得到的細胞密度不能完全相同,我們只能讓細胞接種密度保持在一個相對一致的范圍內(nèi)進行試驗,對所得結(jié)論的影響不大。使用的生物反應(yīng)器為半自動系統(tǒng),營養(yǎng)液與維持液的更換需要人為控制;如果換成全自動生物反應(yīng)器能夠替換細胞生長耗盡的營養(yǎng)物質(zhì)并能去除抑制細胞生長產(chǎn)生的代謝廢物,那樣細胞的產(chǎn)量也能繼續(xù)擴大,一定程度上微載體培養(yǎng)的病毒滴度還能有很大的提升空間[9]。國外疫苗生產(chǎn)企業(yè)的微載體培養(yǎng)技術(shù)水平已經(jīng)達到能夠連續(xù)放大至6 t 反應(yīng)器自動控制的規(guī)模(企業(yè)交流信息),生產(chǎn)效能呈幾何級數(shù)放大,而國內(nèi)微載體技術(shù)應(yīng)用于人用或獸用疫苗的生產(chǎn)才剛剛起步,培養(yǎng)工藝、培養(yǎng)規(guī)模均遠遠落后于國外。我國學(xué)者馮磊等[10]所用的PRRSV為國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心保藏毒種,利用3 g/L的微載體量以及用不同培養(yǎng)方式對Marc-145細胞懸浮培養(yǎng)PRRSV工藝進行優(yōu)化,病毒的效價能達到107.92TCID50/mL。區(qū)別在于我們對微載體的量做進一步摸索,即分3個梯度進行摸索,結(jié)果微載體的量在5 g/L細胞狀態(tài)最好,滴定結(jié)果均能達到108TCID50/mL以上,最高達到108.5TCID50/mL。目前我國微載體培養(yǎng)技術(shù)還處于起步階段,未來必將躋身于我國動物疫苗生產(chǎn)的主流技術(shù)之中。
本研究摸索建立了PRRSV TJM株在生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)Marc-145細胞上的增殖條件(血清和培養(yǎng)基、細胞接種量、微載體用量及病毒培養(yǎng)時間等),為建立規(guī)?;i繁殖與呼吸綜合征疫苗生物反應(yīng)器工藝奠定了基礎(chǔ)。
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(編輯:李文平)
Best Propagation Conditions of PRRSV TJM Strain on Marc-145 Cells in Bioreactor
YU Jing-jie1,2, FENG Er-kai2, YIN Mo-li2, REN Fei2,
(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JiLinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.JLTeyanBiologicalTechnologyLimitedLiabilityCompany,Changchun130112,China)
In order to obtain higher titers of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) TJM strain on Marc-145 cells, cell culture conditions, cell inoculation, the amount of microcarrier and time of virus culture, etc. were optimized. The results showed that the growth status of Marc-145 cells was the best by using suspension culture in the bioreactor under followed conditions: serum was Jin Yuan Kang and content was 10%; medium was DMEM; cell concentration was 20~30 cells per microcarrier; weight of microcarriers were 5 grams. Besides, when the culture time of virus was 27~36 h, the effect of virus reproduction was best and the titer was highest. This study provided a theoretical basis for large-scale production of PRRSV TJM strain vaccine.
PRRSV; Marc-145 cell; microcarrier; bioreactor
國家科技攻關(guān)計劃橫向課題(201500001);吉林省科技攻關(guān)計劃(20150204073NY)
于競杰,碩士研究生,從事動物分子病毒學(xué)研究。
胡桂學(xué),E-mail: Huguixue901103@163.com;陳立志,E-mail: tcsclz@126.com