曾范利，于丹，姜園園，時(shí)坤，李健明，宗穎，趙丹，杜銳，4*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2. 長(zhǎng)春市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，長(zhǎng)春 130061；3. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究中心，長(zhǎng)春 130118；4. 吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，長(zhǎng)春 130118)

黃連總生物堿對(duì)結(jié)核菌PhoPR 雙組份系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄水平影響的研究

曾范利1，于丹2，姜園園1，時(shí)坤1，李健明1，宗穎1，趙丹3，杜銳1，4*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2. 長(zhǎng)春市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，長(zhǎng)春 130061；3. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究中心，長(zhǎng)春 130118；4. 吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，長(zhǎng)春 130118)

為研究黃連總生物堿對(duì)結(jié)核菌PhoPR雙組份系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，對(duì)不同藥物作用的菌液提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)GenBank 中H37Rv的PhoP (0757) 基因、PhoR(0758) 基因和SigA的基因序列，應(yīng)用Primer6.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物并進(jìn)行熒光定量PCR分析。結(jié)果顯示：在高濃度黃連生物堿作用時(shí)，多藥耐藥結(jié)核菌MT-7、MB-1的PhoP和PhoR的基因的表達(dá)水平明顯下降，并且黃連總生物堿與RPF聯(lián)合作用時(shí)，多藥耐藥結(jié)核菌MT-7、MB-1的PhoP和PhoR的基因的表達(dá)水平明顯下降，表明黃連生物堿是RFP抗菌增效劑。本試驗(yàn)為結(jié)核菌抗菌增效作用機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ)。

黃連總生物堿；結(jié)核菌；PhoPR 雙組份系統(tǒng)；轉(zhuǎn)錄水平

鹿結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的鹿的慢性消耗性傳染病，可侵犯全身各器官，但以肺結(jié)核為最多見(jiàn)，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)鹿業(yè)的健康發(fā)展[1]。病鹿尤其是具有開(kāi)放性結(jié)核的病鹿是人類結(jié)核病的主要傳染源之一。由于結(jié)核分枝桿菌為長(zhǎng)期胞內(nèi)寄生菌，可以長(zhǎng)期處于休眠狀態(tài)，沒(méi)有有效的疫苗和藥物進(jìn)行控制，為降低結(jié)核病給公共衛(wèi)生和人類帶來(lái)的危害，大部分發(fā)達(dá)國(guó)家采用檢疫和撲殺相結(jié)合的方式來(lái)消除結(jié)核病[2]，但是檢疫和撲殺不是根除動(dòng)物結(jié)核病和人類結(jié)核病的長(zhǎng)期有效方法。近年來(lái)隨著耐藥性結(jié)核菌株的增加，多藥耐藥結(jié)核病的防治已成為難題[3]。

結(jié)核菌PhoPR雙組份系統(tǒng)是對(duì)外環(huán)境變化作出感知的重要系統(tǒng)，在外界環(huán)境變化時(shí)，PhoPR雙組份系統(tǒng)會(huì)對(duì)結(jié)核分枝桿菌做出相應(yīng)的調(diào)控，使結(jié)核分枝桿菌更容易適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境的變化[4]。有報(bào)道表明，PhoPR可能與結(jié)核分枝桿菌的致病力、毒性作用、細(xì)胞膜的通透性、外排泵、耐藥性和新型疫苗的研制有關(guān)[5]。PhoPR雙組分系在結(jié)核分枝桿菌的致病作用中扮演著重要的角色，而且是一個(gè)潛在的候選目標(biāo)[6]。因此本試驗(yàn)以標(biāo)準(zhǔn)人型結(jié)核分枝桿菌H37Rv為對(duì)照菌株，以鹿源多藥耐藥結(jié)核菌為試驗(yàn)?zāi)Ｐ途x擇PhoPR雙組份系統(tǒng)為研究對(duì)象，在國(guó)內(nèi)率先研究本課題組前期篩選出的RFP的抗菌增效劑黃連總生物堿對(duì)PhoPR雙組份系統(tǒng)基因表達(dá)的影響，初步探討黃連總生物堿作為結(jié)核菌抗菌增效劑的作用機(jī)制并且為多藥耐藥結(jié)核病的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑 標(biāo)準(zhǔn)人型結(jié)核分枝桿菌H37Rv、鹿源耐藥性牛型結(jié)核分枝桿菌(MB-1)和耐藥性人型結(jié)核分枝桿菌(MT-7)由吉林大學(xué)于錄教授惠贈(zèng)；黃連總生物堿為實(shí)驗(yàn)室提取保存；利福平(rifampicin, RFP) 購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；小檗堿(Berberine)購(gòu)于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；Middlebrook7H9肉湯和Middlebrook-OADC增菌液購(gòu)于BD Difco 公司；β-巰基乙醇購(gòu)于Sigma公司；DEPC和緩沖溶液(TE butter)購(gòu)于維特杰生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌RNA提取試劑盒(RNApure Bacteria Kit，CW0536)和溶解酶(Lysozyme，CW0887)購(gòu)于康為世紀(jì)公司， SYBR?Premix EX TaqTMⅡ和PrimescriptTMRT reagent Kit With gDNA Erase購(gòu)于大連TaKaRa公司。

1.2 菌液及藥物菌液的制備 標(biāo)準(zhǔn)菌H37Rv、鹿源耐藥性結(jié)核分枝桿菌MB-1、MT-7以無(wú)菌7H9培養(yǎng)基培養(yǎng)5～10 d后，將菌液移至含有直徑為1 mm玻璃珠的10 mL的離心管中，于漩渦震蕩儀上震蕩、打碎，取上層菌液加入與麥?zhǔn)媳葷峁芡瑯哟笮〉脑嚬苤?，以無(wú)菌7H9肉湯培養(yǎng)基稀釋成1號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁軡舛龋o(wú)菌稀釋20倍制備成20 mL的菌液。

黃連總生物堿單用：分別向H37Rv、MB-1、MT-7的20 mL菌液加入黃連總生物堿，使黃連總生物堿的終濃度為0、1/4、1/2、1 MIC(μg/mL)。加入之后37 ℃，無(wú)菌培養(yǎng)5～10 d，至肉眼可見(jiàn)菌膜生成及對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

黃連總生物堿與RFP聯(lián)用：分別向H37Rv、MB-1、MT-7的20 mL菌液加入黃連總生物堿和利福平，終濃度為黃連總生物堿(單獨(dú))：1/4MIC(μg/mL)，RFP(單獨(dú))：1/4MIC(μg/mL)，黃連總生物堿1/4MIC(μg/mL)+ RFP 1/4MIC(μg/mL)及無(wú)藥空白培養(yǎng)基。加入之后37 ℃，無(wú)菌培養(yǎng)5～10 d，至肉眼可見(jiàn)菌膜生成及對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3 結(jié)核分枝桿菌總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 將培養(yǎng)好的菌液移至2 mL的離心管中，4 ℃，10000 r/min離心4 min收集菌體，清洗菌液2次，然后小心除凈上清液，將菌體移至處理好的預(yù)凍研缽中，倒入液氮，快速研磨至白粉末狀，重復(fù)2次，然后按照細(xì)菌RNA提取試劑盒RNApure Bacteria Kit-CW0536說(shuō)明書操作，獲得結(jié)核分枝桿菌總RNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量并用超微量快速核酸測(cè)定儀檢測(cè)總RNA含量。采用PrimescriptTMRT reagent Kit With gDNA Erase反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行去除基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄兩步反應(yīng)。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 PhoPR雙組份系統(tǒng)的PhoP、PhoR基因和SigA內(nèi)參基因的引物設(shè)計(jì)及熒光定量PCR 根據(jù)GenBank中H37Rv的PhoP(0757)基因、PhoR(0758)基因和SigA的基因序列，應(yīng)用Primer6.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物如(表1)并由大連寶生物公司合成。通過(guò)梯度PCR摸索，PhoP、PhoR和SigA的基因引物的最適宜退火溫度分別為62 ℃、62 ℃、60 ℃。反應(yīng)的條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60～62 ℃退火/延伸30 s，總共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，根據(jù)熒光信號(hào)獲得擴(kuò)增曲線；反應(yīng)后進(jìn)行溶解曲線的反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 15 s，60 ℃持續(xù)15 s，從60 ℃增至95 ℃保持20 min。

表1 熒光定量PCR引物

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析 基因表達(dá)量分析以內(nèi)參為對(duì)照，采用2-△△Ct分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)SPSS Statistics 17.0進(jìn)行差異性檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的質(zhì)量與含量的測(cè)定結(jié)果 H37Rv、MB-1、MT-7的RNA的OD260/OD280比值均在1.9～2.0之間，表明總RNA的含量符合要求。通過(guò)RNApure Bacteria Kit試劑盒獲得RNA，電泳之后可見(jiàn)兩條明顯的條帶，分別為16S、23S條帶(圖1)，表明總RNA的質(zhì)量符合后續(xù)試驗(yàn)的要求。

M：DL 2000；1：0 MIC黃連總生物堿；2：1 MIC黃連總生物堿；3：1/2 MIC黃連總生物堿；4：1/4 MIC黃連總生物堿；5：1/4 MIC 利福平；6：1/4 MIC黃連總生物堿+1/4 MIC 利福平圖1 六個(gè)濃度藥物作用結(jié)核分枝桿菌的RNA電泳圖

2.2 PhoP、PhoR基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量 耐藥菌株MB-1、MT-7的PhoP的基因表達(dá)量分別是H37Rv的16.7倍和7.5倍，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，耐藥菌株MB-1、MT-7的PhoR的基因表達(dá)量分別是H37Rv的4.7倍和8.2倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05(圖2)。

圖2 H37Rv、MB-1、MT-7的PhoP和PhoR基因表達(dá)水平

2.3 黃連總生物堿作用下PhoP、PhoR基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量 隨著黃連濃度的增加，H37Rv的PhoP、PhoR 基因的表達(dá)處于上升趨勢(shì)，P>0.05無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MB-1、MT-7的PhoP、PhoR 基因表達(dá)處于上升后下降的趨勢(shì)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。黃連總生物堿濃度為1/4MIC時(shí)MT-7的PhoP、PhoR基因表達(dá)原始狀態(tài)相比相差不大，MB-1的PhoP、PhoR基因表達(dá)是原始狀態(tài)的6.9倍和5.4倍；黃連總堿濃度為1/2MIC時(shí)MT-7的PhoP、PhoR基因表達(dá)比原始狀態(tài)下調(diào)了0.82倍和0.86倍，MB-1的PhoP、PhoR基因表達(dá)量與原始狀態(tài)相差不大；黃連總堿濃度為1 MIC時(shí)MT-7的PhoP、PhoR基因表達(dá)量比黃連總堿濃度為1/4MIC時(shí)下調(diào)1.3倍和1.2倍，MB-1的PhoP、PhoR基因表達(dá)量比黃連總堿濃度為1/4MIC時(shí)下調(diào)5.4倍和4.1倍(圖3)。

圖3 黃連總生物堿作用下H37Rv、MB-1、MT-7的PhoP、PhoR基因表達(dá)水平

2.4 黃連總生物堿與RFP作用下PhoP、PhoR基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量 雖然H37Rv在藥物黃連總生物堿與RFP藥物作用下PhoP、PhoR基因的表達(dá)量有所差異，但P>0.05無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MB-1、MT-7在藥物黃連總生物堿與RFP作用下PhoP、PhoR基因的表達(dá)量有所差異，而且MB-1、MT-7在藥物黃連總生物堿與RFP聯(lián)用的作用下，PhoP、PhoR基因的表達(dá)量均比在單獨(dú)用黃連和單獨(dú)用RFP的表達(dá)量降低了，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05(圖4)。

圖4 黃連總生物堿和RFP作用下H37Rv 、MB-1、MT-7的PhoP、PhoR 基因表達(dá)水平

3 討論

結(jié)核分枝桿菌Pho PR雙組分系統(tǒng)是結(jié)核分枝桿菌編碼的11個(gè)完整的雙組分系統(tǒng)中最基本、最重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。它可以感應(yīng)外界環(huán)境變化，并做出相應(yīng)反應(yīng)的調(diào)控，能夠使結(jié)核分枝桿菌更好的適應(yīng)宿主微環(huán)境變化，以及協(xié)助結(jié)核分枝桿菌逃避宿主的免疫監(jiān)視和殺滅，促使其在宿主體內(nèi)生存、繁殖、致病等。同時(shí)對(duì)結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)的生長(zhǎng)、分化、代謝、滲透調(diào)節(jié)、繁殖、毒性、趨化性、變異性、致病性等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[7-8]。對(duì)于PhoRP雙組份系統(tǒng)在耐藥菌中的調(diào)控作用是否伴有相關(guān)耐藥基因的高表達(dá)以及與細(xì)菌中的其他調(diào)控系統(tǒng)共同發(fā)揮作用，其與耐藥性之間的關(guān)系尚不清楚，還需要進(jìn)一步研究。

中藥是我國(guó)歷史悠久的自然資源，在治療疾病方面顯示了獨(dú)特的療效。研究表明中藥中存在潛在的對(duì)抗細(xì)菌耐藥的增敏劑或逆轉(zhuǎn)劑。目前研究抗結(jié)核的中藥有黃芩、夏枯草、苦參，大蒜素等，而黃連抗結(jié)菌研究的較少。黃連的主治功效為清熱解毒，消炎止痛，還有抑菌、抗炎的作用，同時(shí)提高機(jī)體的免疫力，主要成分為小檗堿(黃連素)，以小檗堿研究居多?？镨F吉等[9]發(fā)現(xiàn)黃連素(小檗堿)對(duì)H37Rv在濃度為100 μg/mL有殺菌作用，60 μg/mL有抑菌作用。目前，對(duì)于黃連總生物堿的研究較少，且集中于黃連總生物堿的降血糖、胃粘膜損傷的保護(hù)作用等，而對(duì)結(jié)核菌的作用未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以黃連總生物堿及與RFP聯(lián)合作用于標(biāo)準(zhǔn)菌和鹿源多藥耐藥結(jié)核菌，研究黃連總生物堿對(duì)結(jié)核菌PhoPR雙組份系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。

本研究的結(jié)果表明，在無(wú)藥狀態(tài)下，在耐藥菌MB-1、MT-7中PhoP、PhoR基因的表達(dá)明顯高于在H37Rv的，這可能是由于耐藥菌MB-1、MT-7的培養(yǎng)環(huán)境發(fā)生了改變，PhoPR雙組分系統(tǒng)能感知外界環(huán)境變化作出反應(yīng)，使PhoP、PhoR表達(dá)提高；在高濃度黃連生物堿作用時(shí)，多藥耐藥結(jié)核菌MT-7、MB-1的PhoP和PhoR的基因的表達(dá)水平明顯下降，說(shuō)明黃連總生物堿可能降低了MB-1、MT-7的耐藥性；并且黃連總生物堿與RPF聯(lián)合作用時(shí)，多藥耐藥結(jié)核菌MT-7、MB-1的PhoP和PhoR的基因的表達(dá)水平明顯下降，說(shuō)明黃連總生物堿與RFP能協(xié)同抑制結(jié)核菌[10]，表明黃連生物堿是RFP抗菌增效劑，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究，從而為解決動(dòng)物源結(jié)核分枝桿菌的耐藥性問(wèn)題做出有益的探索。

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(編輯：李文平)

Study on the Effect of Transcriptional Level on PhoPR Two-component System Genes byCoptischinensisTotal Alkaloids

ZENG Fan-li1, YU Dan2, JIANG Yuan-yuan1, SHI Kun1,LI Jian-ming1, ZONG Ying1, ZHAO Dan3, DU Rui1,4*

(1.CollegeofChineseMedicineMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.ChangchunPreventionandControlCenterofAnimalDisease,Changchun130061,China;3.ResearchCenterofAgricultureQualityStandardandDetectingTechnique,JilinAgricultureUniversity,Changchun130118,China;4.LaboratoryofProductionandProductApplicationofSikaDeerofJinlinProvince,Changchun130118,China)

To study the effect of transcriptional level on PhoPR two-component system genes byCoptischinensistotal alkaloids, the different concentrations ofCoptischinensistotal alkaloid or in combination with RFP were applied to detect sensitivity to MT-7, MB-1 and H37Rv. Then the total RNA was extracted and reverse transcribed. The expression level of PhoP and PhoR genes belonging to the PhoPR two-component system which was related to drug resistance were analyzed and compared by realtime fluorescence quantitative PCR. The results showed that the expression level of PhoP and phoR of MT-7, MB-1 was decreased significantly with the high concentration of total alkaloids fromCoptidisrhizoma. The expression of level of PhoP and phoR of MT-7 and MB-1 was decreased significantly byCoptischinensistotal alkaloid combined with RFP. The results showed thatCoptischinensistotal alkaloid was antibacterial synerists of RFP. The result will provide a theoretical basis for mechanism of action of antibacterial synerists.

Coptischinensistotal alkaloids; tuberculosis bacteria; PhoPR two-component system; trans-criptional level

吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204028NY)；吉林省科技廳科技成果轉(zhuǎn)化促進(jìn)計(jì)劃(20140309018YY)

曾范利，講師，博士，從事經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病與病原學(xué)研究。

杜銳。E-mail：durui71@126.com

2016-08-08

A

1002-1280 (2016) 09-0006-05

S852.61