張航俊,林仙軍,陳慧華,陸春波

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所,杭州 310020)

高效液相色譜法測定氯前列醇鈉含量

張航俊,林仙軍,陳慧華,陸春波*

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所,杭州 310020)

建立了氯前列醇鈉含量測定的高效液相色譜法。采用Agilent ZORBAX RX-SIL(4.6 mm×250 mm, 5 μm)為色譜柱，冰乙酸-無水乙醇-正己烷(1∶100∶900)為流動相，流速1.5 mL/min，檢測波長220 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果表明，在0.05～2.50 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999)。本方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于氯前列醇鈉的質(zhì)量控制。

氯前列醇鈉;含量測定：高效液相色譜法

氯前列醇鈉(Cloprostenol Sodium)為人工合成的前列腺素F2a同系物，具有強(qiáng)大的溶解黃體作用，能迅速引起黃體消退，并抑制其分泌；對子宮平滑肌也具有直接興奮作用，可引起子宮平滑肌收縮，子宮頸松弛[1]。2003年10月批準(zhǔn)該產(chǎn)品在國內(nèi)上市，該產(chǎn)品的生產(chǎn)周期較長，約為半年，而市場需求量較少，每年的產(chǎn)量較低，約為1～2 kg，且價格昂貴。氯前列醇鈉原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在《中國獸藥典》[2]、《美國藥典》[3]和《英國藥典》[4]均有收載，含量測定均采用正相高效液相色譜法，但進(jìn)樣濃度和進(jìn)樣體積差異較大。《中國獸藥典》氯前列醇鈉原料的含量測定采用正相色譜法，而注射用氯前列醇鈉的含量測定采用反相色譜法。氯前列醇鈉的合成工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)，主要為雜質(zhì)A和雜質(zhì)B，《英國藥典》在有關(guān)物質(zhì)項明確了雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的結(jié)構(gòu)式，本試驗分別采用正相色譜法和反相色譜法對雜質(zhì)A和雜質(zhì)B是否對主峰產(chǎn)生干擾進(jìn)行了研究，確立了HPLC法測定氯前列醇鈉原料含量。

1 儀器與試劑

Waters 2695 高效液相色譜，配Waters 2487 紫外檢測器，美國Waters公司；XS-205電子天平(感量0.01 mg)，瑞士METTLER TOLEDO公司。

氯前列醇鈉對照品(含量為99.3%，批號FOH392，USP)；氯前列醇鈉樣品(批號130305)由寧波三生藥業(yè)有限公司提供，該產(chǎn)品由我國臺灣進(jìn)口；氯前列醇鈉樣品(批號130413)；雜質(zhì)A：(±) -(5Z)-7-〔(1R,3R,5S)-2-〔(1E,3S)-4-(3-氯苯氧基)-3-羥基-1-丁烯基〕-3,5-二羥基環(huán)戊烷基〕-5-庚烯酸鈉 (差向異構(gòu)體，epimer)；雜質(zhì)B：(±)-(5E)-7-〔(1R,3R,5S)-2-〔 (1E,3R)-4-(3-氯苯氧基)-3-羥基-1-丁烯基〕-3,5-二羥基環(huán)戊烷基〕-5-庚烯酸鈉 (反式異構(gòu)體，trans-isomer)，均由寧波第二激素廠生產(chǎn)和制備。冰乙酸、無水乙醇、正己烷和乙腈均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 專屬性考察

2.1.1 正相色譜條件 流動相為冰乙酸-無水乙醇-正己烷(1∶100∶900)；色譜柱：Agilent ZORBAX RX-SIL(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長220 nm；流速1.5 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫35 ℃。理論板數(shù)按氯前列醇峰計算大于7000，主峰的保留時間約為11 min。結(jié)果見圖1。結(jié)果表明在上述色譜條件下，氯前列醇與雜質(zhì)A 和雜質(zhì)B的分離度分別為1.5和3.3，均達(dá)到基線分離(圖1)。

2.1.2 反相色譜條件 流動相為0.24%磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5)-乙腈(65∶35)；色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長220 nm；流速1.5 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫35 ℃。理論板數(shù)按氯前列醇峰計算大于7000，主峰的保留時間約為8 min。結(jié)果見圖1。結(jié)果表明在上述色譜條件下，氯前列醇與雜質(zhì)A不能分離，氯前列醇與雜質(zhì)B分離度為1.5(圖2)。

圖1 溶劑(1)、雜質(zhì)A(2)、雜質(zhì)B(3)、0.5 mg/mL供試品溶液(4)正相色譜圖

圖2 溶劑(1)、雜質(zhì)A(2)、雜質(zhì)B(3)、0.1 mg/mL供試品溶液(4)反相色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取氯前列醇鈉對照品25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度。

2.2.2 供試品溶液的制備 取氯前列醇鈉供試品25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度。

2.3 線性關(guān)系考察 取氯前列醇鈉對照品適量，精密稱定，用無水乙醇稀釋成0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5 mg/mL的對照品溶液，按2.1.1項的色譜條件，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=7.1×106X+62409，r=0.9999，表明在該濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.4 精密度試驗 精密量取氯前列醇鈉對照品溶液，按2.1.1項的色譜條件，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)進(jìn)樣6次測定峰面積。結(jié)果表明相對偏差(RSD)為0.29%，表明系統(tǒng)精密度符合要求。

2.5 穩(wěn)定性試驗 精密量取供試品溶液(批號130305)，分別在樣品處理后的0、1、2、4、8、12 h，按2.1.1項的色譜條件，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，考察樣品穩(wěn)定性。測定結(jié)果RSD為0.34%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 樣品的測定 精密量取供試品溶液，按2.1.1項的色譜條件，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算氯前列醇鈉含量，結(jié)果見表1。

表1 氯前列醇鈉原料含量測定結(jié)果

3 討論與小結(jié)

雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的母體結(jié)構(gòu)與氯前列醇鈉相同，理化性質(zhì)極為相似，采用2.1.2項的反相色譜條件，結(jié)果顯示雜質(zhì)A與主峰不能分離，雜質(zhì)B與主峰完全分離。而采用本文2.1.1項的色譜條件，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B與主峰均達(dá)到基線分離，故本試驗后續(xù)的研究均采用2.1.1項的色譜條件。

試驗表明，隨著進(jìn)樣體積的增加，理論板數(shù)下降，濃度為0.5 mg/mL 的氯前列醇鈉對照品溶液進(jìn)樣體積為5、10、20 μL時，理論板數(shù)分別為8499、7180和2405。不同濃度的氯前列醇鈉對照品溶液，進(jìn)樣體積均為10 μL時，結(jié)果顯示濃度為0.1 mg/mL的氯前列醇鈉對照品溶液峰面積過小，且基線波動較大。綜合考慮，選擇進(jìn)樣濃度為0.5 mg/mL，進(jìn)樣量為10 μL。

由于氯前列醇鈉的生產(chǎn)工藝不同，各企業(yè)在合成氯前列醇鈉的過程中所產(chǎn)生的雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的量不同，對氯前列醇鈉的含量會產(chǎn)生影響。經(jīng)試驗，批號為130305、130413的供試品中雜質(zhì)A和雜質(zhì)B 的總量分別為0.3%、1.1%，對應(yīng)的氯前列醇鈉的含量分別為99.0%和98.3%。

氯前列醇鈉的檢測標(biāo)準(zhǔn)方法研究尚未見相關(guān)報道。本文建立了氯前列醇鈉原料的含量測定方法，該方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，以期為《中國獸藥典》二○一五版氯前列醇鈉原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考依據(jù)。

[1] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典獸藥使用指南化學(xué)藥品卷二O一O年版[S].

[2] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典二O一O年版一部[S].

[3] U.S. Pharmacopoeia. 35-NF27[S].

[4] British Pharmacopoeia Commission. British Pharmacopoeia 2013[S].

(編輯：侯向輝)

Determination of Cloprostenol Sodium by HPLC

ZHANG Hang-jun, LIN Xian-jun, CHEN Hui-hua, LU Chun-bo*

(ZhejiangProvinceInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuff,Hangzhou310020,China)

The HPLC method was established for the determination of cloprostenol sodium. A chromatographic column of Agilent ZORBAX RX-SIL(4.6 mm×250 mm, 5 μm)was used , with the mobile phase of acetic acid-anhydrous ethanol-n-hexane ( 1∶100∶900) at the flow rate of 1.5 mL/min, the detective wavelength of 220 nm, the column temperature of 35 ℃ and the injected volumn was 10 μL. The linear concentration was within the range of 0.05～2.50 mg/mL(r=0.9999). The method is accurate and available for quality control of cloprostenol sodium.

cloprostenol sodium; determination；HPLC

張航俊，助理獸醫(yī)師，從事獸藥和畜產(chǎn)品檢測和技術(shù)研究。

陸春波。E-mail：lucb02@163.com

2016-05-19

A

1002-1280 (2016) 09-0058-03

S859.2