陳羽琪，南文龍，秦立得，鞏明霞，張悅勇，陳義平

(1．中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷試劑研究室，山東青島 266032；2.西交利物浦大學(xué)生物科學(xué)系，江蘇蘇州 215123)

三種不同滅活方法對(duì)新城疫病毒血凝和RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果的影響

陳羽琪1,2，南文龍1，秦立得1，鞏明霞1，張悅勇1，陳義平1

(1．中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷試劑研究室，山東青島 266032；2.西交利物浦大學(xué)生物科學(xué)系，江蘇蘇州 215123)

為研究熱滅活、甲醛、β-丙內(nèi)酯(BPL)三種不同滅活方法對(duì)新城疫病毒(NDV)血凝和RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果的影響，將收獲的NDV雞胚尿囊液分別用濃度為0.1%～0.5%的甲醛37 ℃滅活24 h或4 ℃滅活48 h、濃度為0.02%～0.2%的BPL 37 ℃滅活9 h、60 ℃熱滅活30～90 min，并于滅活前后進(jìn)行血凝試驗(yàn)和RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，用0.02%的BPL 37 ℃滅活9 h或0.1%的甲醛4 ℃滅活48 h，不影響NDV的血凝價(jià)；采用熱滅活30 min或0.02%的BPL 37 ℃滅活9 h，不影響NDV核酸檢測(cè)。本研究可為相關(guān)病原檢測(cè)以及診斷制品制備過(guò)程中滅活方法的選擇提供參考。

新城疫病毒；滅活；血凝；RT-PCR

在動(dòng)物疫病檢測(cè)時(shí)，為確保生物安全，常需對(duì)臨床樣品或分離培養(yǎng)的病原微生物進(jìn)行滅活處理。滅活也是動(dòng)物疫病診斷制品制備過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，通過(guò)滅活可有效消除制品在使用過(guò)程中潛在的病原擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)。常用的物理滅活方法包括熱、超聲波、紫外線(xiàn)和γ-射線(xiàn)等，化學(xué)滅活方法包括甲醛、戊二醛、β-丙內(nèi)酯(beta-propiolactone, BPL)、二乙烯亞胺、鹽酸聚六亞甲基胍等[1]。不同處理方法的滅活原理不同，滅活時(shí)對(duì)病原微生物組分(如蛋白、核酸等)造成的破壞也有所差異。滅活后，進(jìn)行疫病檢測(cè)分析時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果與滅活前相比會(huì)受到不同程度的影響。本研究以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)為模型，分別研究熱、甲醛及BPL這3種常用滅活方法對(duì)其血凝(HA)和RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果的影響，以期為相關(guān)病原檢測(cè)及診斷制品制備過(guò)程中滅活方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 NDV La Sota株，由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供；10日齡SPF雞胚，購(gòu)于濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司；甲醛購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BPL購(gòu)自Serva公司；病毒RNA提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司；TransScript II One-Step RT-PCR SuperMix檢測(cè)試劑盒購(gòu)自全式金公司。

1.2 病毒擴(kuò)增 用滅菌生理鹽水將NDV La Sota種毒進(jìn)行10-4稀釋?zhuān)蚰仪唤臃N10日齡SPF雞胚，0.1mL/枚，接種后置37 ℃繼續(xù)孵化，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，取出隨后死亡的雞胚置4 ℃，120 h時(shí)取出全部雞胚，收獲雞胚尿囊液。4 ℃ 2500 r/min離心10 min，取上清，測(cè)定血凝價(jià)。

1.3 病毒滅活

1.3.1 甲醛滅活 40%的甲醛溶液經(jīng)稀釋后加入到5份等量的100 mL NDV病毒液中，充分混勻，使甲醛終濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。將5份含有不同甲醛終濃度的NDV病毒液分為兩組，一組置37 ℃滅活24 h，另一組置4 ℃滅活48 h。

1.3.2 BPL滅活 將BPL溶液稀釋后加入到5份等量的100 mL NDV病毒液中，充分混勻，使BPL終濃度分別為0.02%、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%，置37 ℃滅活9 h。1.3.3 熱滅活 將3等份NDV病毒液(100 mL/份)置60 ℃水浴中，分別滅活30 min、60 min、90 min。

1.4 滅活檢驗(yàn) 取上述滅活樣品各5 mL，參照《獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[2]附錄中滅活檢驗(yàn)法。將各滅活留樣，接種10日齡SPF雞胚，0.1 mL/枚，每個(gè)樣品接種6枚。接種后置37 ℃繼續(xù)孵化，每日照蛋2～4次，隨時(shí)取出死亡雞胚并置4 ℃，活胚繼續(xù)孵化至120 h時(shí)，然后取出所有雞胚，置4 ℃過(guò)夜，收獲尿囊液并測(cè)定血凝價(jià)。將24 h雞胚死亡數(shù)≤1，48～120 h無(wú)死亡胚，且尿囊液HA=0的滅活樣品視為完全滅活。

1.5 血凝價(jià)測(cè)定 參照《獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[2]附錄中紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)法，測(cè)定各滅活留樣的血凝價(jià)，并與滅活前病毒液血凝價(jià)比較。

1.6 RT-PCR測(cè)定 分別取滅活前病毒液以及各滅活留樣，采用無(wú)菌生理鹽水10倍遞進(jìn)稀釋?zhuān)瑥?0-1稀釋至10-6。病毒RNA提取參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。引物參照《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T 16550-2008)[3]所用的檢測(cè)引物，由寶生物工程(大連)有限公司合成。反應(yīng)體系按RT-PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制，反應(yīng)條件為：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，PCR 產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。測(cè)定各滅活留樣可檢出的病毒最高稀釋倍數(shù)，并與滅活前病毒液比較。

2 結(jié)果

2.1 滅活檢驗(yàn) 按所述方法檢測(cè)各滅活留樣的滅活效果，采用濃度為0.1%～0.5%的甲醛滅活時(shí)，無(wú)論37 ℃滅活24 h或4℃滅活48 h，滅活的病毒樣品再次接種雞胚后，收獲的尿囊液血凝價(jià)均為0，證明滅活完全；采用濃度為0.02%～0.2%的BPL 37 ℃滅活9 h，經(jīng)檢測(cè)均滅活完全；采用60 ℃30 min、60 min、90 min熱滅活，經(jīng)檢測(cè)均滅活完全。

2.2 滅活前后血凝試驗(yàn)檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)表1。病毒滅活前，經(jīng)測(cè)定病毒液血凝價(jià)為 210。用甲醛滅活，滅活溫度為37 ℃時(shí)，隨著甲醛濃度從0.1%增加至0.5%，滅活后的病毒液血凝價(jià)下降到29～26；滅活溫度為4 ℃時(shí)，在不同的滅活濃度下，滅活后的病毒液血凝價(jià)與滅活前保持一致，均為210。用BPL滅活時(shí)，滅活濃度從0.02%增加至0.2%，滅活后的病毒液血凝價(jià)與滅活前保持一致，均為210。采用60 ℃熱滅活，滅活時(shí)間從30 min增加至90 min，滅活后的病毒液均檢測(cè)不到血凝價(jià)。

表1 不同滅活處理方法對(duì)NDV血凝價(jià)的影響

“/”代表無(wú)數(shù)據(jù)；HA效價(jià)為“0”代表無(wú)凝集

2.3 滅活前后RT-PCR檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)表2。病毒滅活前，RT-PCR可檢測(cè)到的病毒最高稀釋倍數(shù)為10-3。甲醛滅活時(shí)，無(wú)論采用37 ℃或4 ℃滅活，或是滅活濃度從0.1%增加至0.5%，滅活后的病毒液均檢測(cè)不到病毒核酸。BPL滅活時(shí)，滅活濃度為0.02%時(shí)，滅活后可檢測(cè)到的病毒最高稀釋倍數(shù)與滅活前一致，仍為10-3；隨著滅活濃度從0.025%增加至0.2%，滅活后可檢測(cè)到的病毒最高稀釋倍數(shù)有所下降，但仍可檢測(cè)到10-2稀釋的病毒液。60 ℃熱滅活時(shí)，滅活時(shí)間從30 min增加至90 min，滅活后可檢測(cè)到的病毒最高稀釋倍數(shù)均和滅活前一致，為10-3。

表2 不同滅活方法處理后RT-PCR可檢測(cè)到NDV的最高稀釋倍數(shù)

“/”代表無(wú)數(shù)據(jù)；可檢測(cè)稀釋倍數(shù)“-”代表檢測(cè)結(jié)果為陰性

3 討論

甲醛是傳統(tǒng)的滅活劑[6-7]，通過(guò)對(duì)蛋白和核酸的烷化作用使病毒或細(xì)菌喪失感染性[4]。本研究中，37 ℃或4 ℃條件下0.1%～0.5%甲醛滅活后，NDV核酸結(jié)構(gòu)受損，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性。37 ℃滅活時(shí)，隨甲醛濃度升高，NDV血凝價(jià)呈下降趨勢(shì)，這可能與血凝素蛋白變性發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而致抗原性破壞有關(guān)。采用4 ℃滅活，則可抑制上述交聯(lián)反應(yīng)，有效保存血凝素蛋白的抗原性。不過(guò)，在相關(guān)診斷制品(如新城疫抗原、禽流感抗原等)制備過(guò)程中，甲醛滅活濃度、溫度、時(shí)間，還需依據(jù)生物材料的特性及具體工藝，靈活選擇。

BPL在國(guó)外廣泛用于疫苗滅活，其作用于病原體DNA或RNA，通過(guò)與核酸的嘌呤堿基(主要是鳥(niǎo)嘌呤)反應(yīng)破壞核酸結(jié)構(gòu)，但不直接作用于蛋白質(zhì)，因此能保持良好的抗原活性。同時(shí)，BPL滅活病原時(shí)間短，且易水解為無(wú)毒性的人體脂肪代謝產(chǎn)物β-羥基丙酸，故不必考慮在成品中的殘留[8]。本研究采用0.02%～0.2%BPL進(jìn)行滅活，在NDV完全滅活的情況下，滅活前后血凝價(jià)保持不變，效果較為理想。同時(shí)，BPL雖然直接作用于核酸，當(dāng)采用0.02%的濃度進(jìn)行滅活時(shí)，滅活前后RT-PCR檢測(cè)結(jié)果未受影響；當(dāng)濃度增加到0.025%～0.2%時(shí)，RT-PCR可檢測(cè)病毒最高稀釋倍數(shù)降低至10-2，但與甲醛相比，BPL滅活對(duì)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果影響相對(duì)較小。本研究表明，用0.02%的BPL 37 ℃ 9h滅活效果較好，既保持了NDV血凝素蛋白的抗原性，又不會(huì)影響RT-PCR 檢測(cè)。

熱滅活簡(jiǎn)單易行，但容易造成病原體蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而使抗原活性受到影響。本研究采用熱滅活后，均檢測(cè)不到血凝價(jià)，說(shuō)明血凝素蛋白變性而失去其抗原性。但熱滅活對(duì)核酸檢測(cè)影響較小，滅活30～90 min，均不會(huì)影響RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，該方法較適用于分子檢測(cè)試劑的質(zhì)控品、對(duì)照品的制備。

本研究顯示，3種滅活方法對(duì)NDV血凝性的影響，依次為熱滅活﹥甲醛﹥BPL；對(duì)NDV核酸檢測(cè)的影響，依次為甲醛﹥BPL﹥熱滅活。因此，新城疫血凝和血凝抑制試驗(yàn)時(shí)，推薦采用0.02%的BPL 37 ℃滅活9 h或0.1%的甲醛4 ℃滅活48 h；NDV核酸檢測(cè)時(shí)，建議熱滅活30 min，也可用0.02%的BPL 37 ℃滅活9 h。實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)檢測(cè)目的以及病原微生物的種類(lèi)和生物學(xué)特性，合理選擇滅活方法及滅活條件。

[1] 徐守振，尹燕博，王新．動(dòng)物疫苗中常用抗原滅活劑的研究進(jìn)展[J]．中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37(9)：162-167．

[2] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部．中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，2001．

[3] 新城疫診斷技術(shù)(GB/T 16550-2008)[M]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，2001．

[4] 姜平．獸醫(yī)生物制品學(xué)[M]．第2版．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006．

[5] 徐守振，王新，尹燕博．四種不同滅活劑對(duì)新城疫病毒的滅活效果研究[J]．中國(guó)家禽，2011，33(14)：15-19．

[6] Jagt H J，Bekkers M L，Van Bommel S A,etal．The influence of the inactivating agent on the antigen content of inactivated Newcastle disease vaccines assessed by theinvitropotency test[J]．Biologicals，2010，38：128-134．

[7] Habib M，Hussain I，F(xiàn)ang W H，etal．Inactivation of infectious bursal disease virus by binary ethylenimine and formalin[J]．Zhejiang Univ Science B，2006，7(4)：320-323．

[8] 衛(wèi)龍興，王福泉．動(dòng)物疫苗中滅活劑與佐劑的種類(lèi)及其作用[J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009，19：321-322．

(編輯：李文平)

Influence of Three Different Inactivation Methods on Newcastle Disease Virus Hemagglutinin Test and RT-PCR Assay

CHEN Yu-qi1,2, NAN Wen-long1, QIN Li-de1, GONG Ming-xia1,ZHANG Yue-yong1, CHEN Yi-ping1

(1.LaboratoryofDiagnosticsDevelopment,ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter,Qindao,Shangdong266032,China;2.DepartmentofBiologicalSciences,Xi’anJiaotong-LiverpoolUniversity,Suzhou,Jiangsu215123,China)

In order to investigate the influence of different inactivation methods on Newcastle disease virus (NDV) hemagglutinin (HA) test and RT-PCR assay, viral suspensions were inactivated by 0.1%～0.5% formaldehyde for 37 ℃24 h and 4 ℃ 48 h, 0.02%～0.2%β-propiolactone (BPL) for 37 ℃ 9 h and 60 ℃ water bath for 30～90 min, respectively. Then the suspensions were detected by HA test and RT-PCR assay. The results showed that the optimal inactivation conditions for HA were 0.02% BPL at 37 ℃ for 9 h or 0.1% formaldehyde at 4 ℃ for 48 h; for RT-PCR were 60 ℃ water bath for 30 min or 0.02% BPL at 37 ℃ for 9 h. This study provided suggestions for the selection of appropriate inactivation methods, which were used in detecting related pathogens and preparing diagnostic reagents.

Newcastle disease virus; inactivation; hemagglutinin; RT-PCR

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0501609)

陳羽琪， 從事微生物相關(guān)研究。

陳義平。 E-mail: cyp777@163.com

2016-07-23

A

1002-1280 (2016) 09-0011-04

S852.65